本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分離番茄果實(shí)原生質(zhì)體的方法。

背景技術(shù)：

果實(shí)作為鮮活的農(nóng)產(chǎn)品為人類健康提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)，是人們膳食結(jié)構(gòu)中不可缺少的組分。番茄作為研究果實(shí)成熟和抗病機(jī)理的模式生物，是世界范圍內(nèi)廣泛種植的第一大蔬菜作物,具有重要的經(jīng)濟(jì)和科研價(jià)值。近年來，番茄基因組序列的解讀和群體遺傳學(xué)的發(fā)展讓人們能夠能從基因組的角度加深對(duì)番茄的了解。隨著功能基因組學(xué)、分子生物學(xué)研究的不斷深入，果實(shí)發(fā)育進(jìn)程相關(guān)的功能基因在細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)空特異性及其調(diào)控模式得到了廣泛關(guān)注，而對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位分析依賴于樣品制備方法的不斷優(yōu)化。與其它模式生物細(xì)胞相比，果實(shí)細(xì)胞具有其特殊性:細(xì)胞含水量高，不同成熟度的果實(shí)細(xì)胞體積和結(jié)構(gòu)具有顯著差異，細(xì)胞間隙富含果膠等多糖類物質(zhì)，而且細(xì)胞中富含有機(jī)酸、糖類、色素和芳香類物質(zhì)。因此，以往對(duì)果實(shí)細(xì)胞的顯微觀察并不多見，而且試驗(yàn)中往往需要對(duì)果實(shí)進(jìn)行切片或者刺傷操作，極大地影響了對(duì)果實(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的原位無損解析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種分離番茄果實(shí)原生質(zhì)體的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1)用酶液酶解番茄果實(shí)，收集酶解后果實(shí)組織；

所述酶液包括纖維素酶、果膠酶、離析酶；

2)將所述酶解后果實(shí)組織在PME溶液中孵育，即得到番茄果實(shí)原生質(zhì)體，實(shí)現(xiàn)番茄果實(shí)原生質(zhì)體的分離；

所述PME溶液包括甘露醇、PIPES、MgCl₂和EDTA。

上述方法中，

所述甘露醇、所述PIPES、所述MgCl₂和所述EDTA的摩爾的量比為30-50：4-6：1-3：1-3；

或所述甘露醇、所述PIPES、所述MgCl₂和所述EDTA的摩爾的量比為40：5：2：1；

或所述甘露醇、所述PIPES、所述MgCl₂和所述EDTA的摩爾的量比為40：4：1：1；

或，所述纖維素酶、所述果膠酶、所述離析酶的質(zhì)量比為5-10：3-5：3-5；

或，所述纖維素酶、所述果膠酶、所述離析酶的質(zhì)量比為2：1：1。

上述方法中，

所述PME溶液由300-500mM甘露醇、40-60mM PIPES、10-30mM MgCl₂、10-30mM EDTA和水組成；

或，所述PME溶液由400mM甘露醇、50mM PIPES、20mM MgCl₂、10mM EDTA和水組成；

或，所述PME溶液由400mM甘露醇、40mM PIPES、10mM MgCl₂、10mM EDTA和水組成；

或，所述PME溶液的pH為6-8。

上述方法中，

所述酶液為由纖維素酶、果膠酶、離析酶和GKMMB溶液組成，

所述纖維素酶在所述酶液中的質(zhì)量百分比為0.5-1％，所述果膠酶在所述酶液中的質(zhì)量百分比為0.3-0.5％、所述離析酶在所述酶液中的質(zhì)量百分比為0.3-0.5％；

或所述纖維素酶在所述酶液中的質(zhì)量百分比為1％，所述果膠酶在所述酶液中的質(zhì)量百分比為0.4％、所述離析酶在所述酶液中的質(zhì)量百分比為0.5％；

或，所述纖維素酶在所述酶液中的質(zhì)量百分比為1％，所述果膠酶在所述酶液中的質(zhì)量百分比為0.5％、所述離析酶在所述酶液中的質(zhì)量百分比為0.4％；

或，所述GKMMB溶液由終濃度為300-500mM甘露醇、10-30mM KCl、40-60mM MgSO₄7H₂O、1-3mM MgCl₂、50-150mM MES、質(zhì)量百分含量為1-3％BSA和水組成；

或，所述GKMMB溶液由終濃度為400mM甘露醇、20mM KCl、60mM MgSO₄ 7H₂O、2mM MgCl₂、50mM MES、質(zhì)量百分含量為1％BSA和水組成；

或，所述GKMMB溶液由終濃度為400mM甘露醇、20mM KCl、50mM MgSO₄ 7H₂O、2mM MgCl₂、50mM MES、質(zhì)量百分含量為1％BSA和水組成。

上述方法中，

所述孵育的方式為22-30℃、60rpm震蕩2-5小時(shí)。

上述方法中，

所述酶解的溫度為22-30℃，所述酶解的方式為先0.07-0.08MPa保持5分鐘，再在黑暗常壓狀態(tài)下于60rpm震蕩3小時(shí)55分，再在黑暗常壓狀態(tài)下于80rpm震蕩5分鐘。

上述方法中，

在所述孵育后，還包括如下步驟:先將孵育后的體系中的果實(shí)組織去除，得到細(xì)胞孵育液；再將所述細(xì)胞孵育液過濾，收集過濾液；再將所述過濾液離心，收集沉淀，得到果實(shí)原生質(zhì)體。

上述方法中，

所述過濾采用的孔徑為100-300μm的細(xì)胞篩；

所述離心的條件為22-25℃，150-180g，3-5min。

上述方法中，

所述番茄果實(shí)為0.1-1mm厚番茄果實(shí)切片。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種分離番茄果實(shí)原生質(zhì)體的試劑盒。

本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述PME溶液；

或所述試劑盒還包括上述酶液。

本發(fā)明提供的分離番茄果實(shí)原生質(zhì)體的方法，其具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)操作簡(jiǎn)單、快速：縮短了酶解等前期處理的時(shí)間；2)酶解處理后使用PME溶液進(jìn)行孵育，終止酶解反應(yīng)并提高原生質(zhì)體的游離效率，節(jié)省了成本；3)分離效果好，不同大小的果實(shí)細(xì)胞都能夠得到高效的分離。

實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明提供的方法對(duì)番茄果實(shí)原生質(zhì)體進(jìn)行分離，原生質(zhì)體得率顯著提高；纖維素酶等的用量減少，達(dá)到節(jié)省成本的目的；為深入研究果實(shí)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)模式提供了重要工具。由此可見，酶解處理結(jié)合溫和消化技術(shù)對(duì)番茄果實(shí)原生質(zhì)體進(jìn)行分離的方法為果實(shí)發(fā)育相關(guān)蛋白的亞細(xì)胞定位以及基因表達(dá)模式的深入研究奠定了基礎(chǔ)，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值高。

附圖說明

圖1為普通光學(xué)顯微鏡觀察到的紅熟期番茄果實(shí)原生質(zhì)體。

圖2為普通光學(xué)顯微鏡觀察到的綠熟期番茄果實(shí)原生質(zhì)體。

圖3為對(duì)比例普通光學(xué)顯微鏡觀察到的紅熟期番茄果實(shí)原生質(zhì)體。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所述百分含量如無特別說明均為質(zhì)量百分含量。

實(shí)施例1、紅熟期番茄果實(shí)原生質(zhì)體分離

一、分離所需試劑

纖維素酶的酶活為10u/mg(β-1,4-D-葡聚糖葡糖苷底物下的酶活為10u/mg)，為Yakult Japan公司的產(chǎn)品；

果膠酶的酶活為5u/mg(果膠甲氧酯底物下的酶活為5u/mg)，為Yakult Japan公司的產(chǎn)品；

離析酶的酶活為3u/mg(β-1,4-D-葡聚糖葡糖苷底物下的酶活為5u/mg)，為Yakult Japan公司的產(chǎn)品。

酶液由纖維素酶、果膠酶、離析酶和GKMMB溶液組成，纖維素酶的終濃度為1％(質(zhì)量百分比)、果膠酶的終濃度為0.5％(質(zhì)量百分比)、離析酶的終濃度為0.4％(質(zhì)量百分比)。

上述GKMMB溶液由終濃度為400mM甘露醇、20mMKCl、50mM MgSO₄ 7H₂O、2mM MgCl₂、50mM MES、質(zhì)量百分含量為1％BSA和水組成。

酶液使用前用0.45μm的微孔濾膜過濾，收集過濾后酶液。

PME溶液由400mM甘露醇、50mM PIPES、20mM MgCl₂、10mM EDTA和水組成，pH為6.9。

二、紅熟期番茄果實(shí)原生質(zhì)體分離

1)將紅熟期番茄果實(shí)(Alsa Craig品種)以自來水洗凈后，以雙面刀片切成0.1-1mm厚的薄片；

2)將步驟1)獲得的果實(shí)組織浸沒酶液中進(jìn)行酶解，得到酶解體系，收集酶解體系中的酶解后果實(shí)組織。

上述酶解的溫度為25℃，上述酶解過程如下：先抽真空至0.07-0.08MPa保持5分鐘，再在黑暗常壓狀態(tài)下于搖床上60rpm(旋轉(zhuǎn)半徑5cm)酶解3小時(shí)55分，再在黑暗常壓狀態(tài)下?lián)u床上80rpm繼續(xù)震蕩5分鐘。

3)將上述酶解后果實(shí)組織浸沒在PME溶液中溫度為25℃、60rpm孵育2小時(shí),得到孵育后體系(由果實(shí)組織和細(xì)胞孵育液組成)，去除孵育后體系中的果實(shí)組織，保留細(xì)胞孵育液；

4)將細(xì)胞孵育液過孔徑為200μm的細(xì)胞篩，收集過濾液；將過濾液離心，收集沉淀，得到果實(shí)原生質(zhì)體。

上述離心條件為25℃，150g，3min。

三、果實(shí)原生質(zhì)體的檢測(cè)

W5溶液由154mMNaCl，125mM CaCl₂，5mMKCl，5mM葡萄糖，1.5mM MES和水組成，W5溶液的pH為5.6。

將上述二得到的果實(shí)原生質(zhì)體加入等體積的W5溶液，混勻后于普通光學(xué)顯微鏡下檢查原生質(zhì)體狀態(tài)。

結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以觀察到大小不等的番茄果實(shí)原生質(zhì)體，可以看出原生質(zhì)體中細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)流動(dòng)活躍，可見較多質(zhì)體和淀粉粒。

對(duì)比例：現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方法不包括酶解處理后使用PME溶液進(jìn)行孵育的步驟，此步驟可以終止酶解反應(yīng)，并通過溫和消化進(jìn)一步提高原生質(zhì)體的游離效率。對(duì)比例原生質(zhì)體分離效果如圖3所示。

實(shí)施例2、綠熟期番茄果實(shí)原生質(zhì)體分離

一、分離所需試劑

纖維素酶的酶活為10u/mg(β-1,4-D-葡聚糖葡糖苷底物下的酶活為10u/mg)，為Yakult Japan公司的產(chǎn)品；

果膠酶的酶活為5u/mg(果膠甲氧酯底物下的酶活為5u/mg)，為Yakult Japan公司的產(chǎn)品；

離析酶的酶活為3u/mg(β-1,4-D-葡聚糖葡糖苷底物下的酶活為5u/mg)，為Yakult Japan公司的產(chǎn)品。

酶液為將纖維素酶、果膠酶、離析酶添加到GKMMB溶液中得到的溶液，纖維素酶的終濃度為1％(質(zhì)量百分比)、果膠酶的終濃度為0.4％(質(zhì)量百分比)、離析酶的終濃度為0.5％(質(zhì)量百分比)。

上述GKMMB溶液由終濃度為400mM甘露醇、20mMKCl、60mM MgSO₄ 7H₂O、2mM MgCl₂、50mM MES、質(zhì)量百分含量為1％BSA和水組成。

酶液使用前用0.45μm的微孔濾膜過濾，收集過濾后酶液。

PME溶液由400mM甘露醇、40mM PIPES、10mM MgCl₂、10mM EDTA和水組成，pH為6.9。

二、綠熟期番茄果實(shí)原生質(zhì)體分離

1)將綠熟期番茄果實(shí)(Alsa Craig品種)以自來水洗凈后，以雙面刀片切成0.1-1mm厚的薄片；

2)將步驟1)獲得的果實(shí)組織浸沒酶液中進(jìn)行酶解，得到酶解體系，收集酶解體系中的酶解后果實(shí)組織。

上述酶解的溫度為25℃，上述酶解過程如下：先抽真空至0.07-0.08MPa保持5分鐘，再在黑暗常壓狀態(tài)下于搖床上60rpm(旋轉(zhuǎn)半徑5cm)酶解3小時(shí)55分，再在黑暗常壓狀態(tài)下?lián)u床上80rpm繼續(xù)震蕩5分鐘。

3)將上述酶解后果實(shí)組織浸沒在PME溶液中溫度為25℃、60rpm孵育2小時(shí),得到孵育后體系(由果實(shí)組織和細(xì)胞孵育液組成)，去除孵育后體系中的果實(shí)組織，保留細(xì)胞孵育液；

4)將細(xì)胞孵育液過孔徑為150μm的細(xì)胞篩，收集過濾液；將過濾液離心，收集沉淀，得到果實(shí)原生質(zhì)體。

5)上述離心條件為25℃，180g，3min。

三、果實(shí)原生質(zhì)體的檢測(cè)

W5溶液由150mM NaCl，130mM CaCl₂，4mM KCl，6mM葡萄糖，2mM MES和水組成，W5溶液的pH為5.6。

將上述二得到的果實(shí)原生質(zhì)體加入等體積的W5溶液，混勻后于普通光學(xué)顯微鏡下檢查原生質(zhì)體狀態(tài)。

結(jié)果如圖2所示，從圖2中可以觀察到較小的番茄果實(shí)原生質(zhì)體，可以看出原生質(zhì)體體積較小，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)流動(dòng)活躍，可見較多淀粉粒。