本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種聚多巴胺修飾的離心管及其制備方法和在核酸分離中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)中，高質(zhì)量的核酸(DNA)模板對于PCR的正常進(jìn)行起著非常重要的作用，因此對于DNA提取方法的探究非常必要。

酚-氯仿法是傳統(tǒng)的DNA提取方法，但這種方法操作步驟復(fù)雜，耗時長，涉及多步的離心，會由于剪切力對DNA產(chǎn)生損傷，而且不適于自動化和微型化，同時需使用酚、氯仿等高毒性的試劑。

基于硅基質(zhì)的固相萃取方法雖然操作簡單，能夠省去一些有毒有機溶劑的使用，但由于其固液分離仍然依靠多步離心導(dǎo)致其耗時，而且也容易對DNA造成損傷；另外聚乙二醇(PEG)和高鹽的加入會使得溶液黏度變大而降低DNA回收率。

基于磁性材料的磁性固相萃取技術(shù)避免了離心分離步驟產(chǎn)生的剪切力而使DNA降解的可能性，但作為固相吸附劑的磁性微粒需要通過外加磁場實現(xiàn)分離。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的首要目的在于提供一種聚多巴胺修飾的離心管的制備方法，該方法基于多巴胺的自聚和聚多巴胺(PDA)的粘附能力在弱堿性溶液中通過過硫酸銨提供氧氣制備了聚多巴胺修飾離心管，該制備方法簡單，條件溫和，重現(xiàn)性好。

本發(fā)明的另一目的在于提供由上述方法制得的聚多巴胺修飾的離心管。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述的聚多巴胺修飾的離心管在核酸分離中的應(yīng)用。以聚多巴胺修飾的離心管為吸附材料，利用PDA的結(jié)構(gòu)特點，通過調(diào)節(jié)溶液的酸度實現(xiàn)對核酸的分離和富集，該方法具有很強的通用性和可操作性，實用價值高。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種聚多巴胺修飾的離心管的制備方法，包括以下步驟：

將鹽酸多巴胺和過硫酸銨溶解在堿性溶液中，混合均勻，制得多巴胺懸浮液；將多巴胺懸浮液加入離心管中，在搖床上振蕩反應(yīng)，在離心管壁上會形成聚多巴胺薄膜；將多巴胺懸浮液倒出后，離心管內(nèi)部用40℃氮氣烘干，這是加強PDA涂層的穩(wěn)定性；再依次用三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液和去離子水洗滌，以除去殘留的未反應(yīng)物，最后經(jīng)40℃氮氣烘干，得到聚多巴胺修飾的離心管；

所述鹽酸多巴胺與過硫酸銨的質(zhì)量比為(2.5～10):1；鹽酸多巴胺與堿性溶液的質(zhì)量體積比為0.5～2.0mg:1mL；

所述的堿性溶液為Tris-HCl緩沖液，其pH值為7.5～9.5；Tris-HCl緩沖液中三羥甲基氨基甲烷的濃度為10～40mmol/L；

所述振蕩反應(yīng)優(yōu)選在25～50℃下振蕩反應(yīng)8～24h，轉(zhuǎn)速為0～150rpm。

由上述方法制得的聚多巴胺修飾的離心管可用于核酸分離。通過調(diào)節(jié)核酸吸附和洗脫溶液的酸度，該離心管可以對核酸進(jìn)行吸附和洗脫，從而實現(xiàn)對核酸的分離和富集，具有很強的通用性和可操作性，實用價值高。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

1、本發(fā)明的聚多巴胺修飾的離心管以聚多巴胺涂層為載體吸附DNA，利用聚多巴胺與DNA的靜電吸附作用，只需要在離心管中就可以實現(xiàn)對核酸的抓取，再通過靜電排斥作用對所吸附的DNA進(jìn)行洗脫，最后通過PCR擴增和電泳檢測來對所提取的DNA進(jìn)行評價。該離心管的普適性和實用性為DNA提取提供了一種便捷的方法。

2、本發(fā)明的聚多巴胺修飾的離心管極大地簡化了目前DNA提取的過程，優(yōu)于傳統(tǒng)的酚-氯仿法和商業(yè)化的試劑盒提取方法，在提取過程中不使用任何有毒的有機試劑，也無需繁瑣的離心步驟，同時無需磁固相萃取技術(shù)中的外加磁場。此外，吸附和洗脫緩沖液的組成都很簡單，整個吸附及洗脫過程都是在室溫下(25℃)完成的，無須加熱到較高溫度。將聚多巴胺修飾離心管提取DNA過程與PCR擴增和凝膠電泳檢測相結(jié)合，可以實現(xiàn)快速地對樣品中致病菌的檢測。

3、本發(fā)明中，離心管內(nèi)形成的聚多巴胺涂層具有極強的粘附能力，除強堿性水溶液(pH>13)以外，PDA涂層在大多數(shù)環(huán)境中都能表現(xiàn)出良好的長期穩(wěn)定性，這是傳統(tǒng)涂覆改性技術(shù)所無法實現(xiàn)的。

附圖說明

圖1是聚多巴胺修飾的離心管提取的DNA經(jīng)PCR后的瓊脂糖凝膠電泳圖(泳道1為標(biāo)準(zhǔn)DNA片段；泳道2、7、12為裂解液的擴增結(jié)果；泳道3、8、13為空白對照；泳道4、5、6、9、10、11、14、15、16為聚多巴胺修飾的離心管提取的細(xì)菌DNA模板的PCR產(chǎn)物)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

以下以聚多巴胺修飾的離心管提取Escherichia coli O157:H7基因組DNA為例，來闡述應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)行實際樣品檢測的過程。

步驟1：聚多巴胺修飾離心管的制備

準(zhǔn)確稱取20mg鹽酸多巴胺和8mg過硫酸銨，依次加入20mL 10mmol/L Tris-HCl緩沖液中(pH值8.5，其中三羥甲基氨基甲烷的濃度為20mmol/L)混合均勻，然后將制得的混合液迅速加入離心管中，在100rpm和40℃條件下?lián)u床上振蕩反應(yīng)12h。將經(jīng)過上述處理的離心管放入40℃烘箱中進(jìn)行氮氣烘干，然后依次用10mmol/L Tris-HCl緩沖液中(pH值7.0)和去離子水洗滌，再放入40℃烘箱中進(jìn)行氮氣烘干。

步驟2：提取DNA

取1.5mL細(xì)菌培養(yǎng)液，10000rpm離心1min，將細(xì)菌與培養(yǎng)基分離。隨后向菌體沉淀中加入400μL裂解液(40mmol/L Tris-CH₃COOH，20mmol/L NaAc，1mmol/L EDTA，1％SDS，pH值7.8)，37℃水浴孵育1h，為保證裂解效果在孵育期間需不時的震蕩。然后，向其中加入3μL核糖核苷酸酶溶液(10mg/mL)，37℃水浴孵育15min。孵育完成后，向其中加入200μL NaCl(5.0mol/L)充分混合，將混合液4℃離心(10000rpm)20min。然后，取300μL上清液(細(xì)菌裂解液)，并加入700μL吸附液(10mmol/L MES-HCl，pH值2.0)，充分混合后，加入到步驟1制備的聚多巴胺修飾的離心管中。將混合液在室溫下輕輕震蕩孵育10min后，將上清液小心地移出。將聚多巴胺修飾的離心管用70％的乙醇(V/V)洗兩次，在室溫下放置干燥。然后向其中加入100μL洗脫液(10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA，pH值8.0)，室溫下輕輕震蕩孵育10min，使吸附的DNA從管壁上洗脫下來。將上清液小心地移出，轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，4℃封存待用。

步驟3：PCR擴增實驗

PCR擴增過程中用到的試劑包括：5μL DNA模板，2×PCR buffer，1.5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTP混合液，0.4mmol/L上下游引物，0.2U/μL Taq DNA聚合酶，總的反應(yīng)體積為25μL。選取的上下游引物是針對E.coli O157:H7的毒力基因rfbE設(shè)計的，其目標(biāo)擴增片段大小為168bp。上下游引物的序列如下：

上游引物：5′‐CAGTTTACCAACCGTCAT-3′

下游引物：5′-GAGCAACCGTTCCATTAC-3′

PCR反應(yīng)在PCR擴增儀上進(jìn)行。具體的擴增過程為反應(yīng)液首先在94℃預(yù)變性3min，然后按以下條件進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)：變性(94℃，30s)，退火(56℃，30s)，延伸(72℃，30s)，循環(huán)40次后，再延伸3min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物置于4℃環(huán)境保存待用。

步驟4：瓊脂糖凝膠電泳檢測

配制1％瓊脂糖凝膠，取8μL PCR產(chǎn)物，加入加樣緩沖液2μL混勻，以GeneRuler100bp DNAladder作為參照，100V恒壓電泳30min。凝膠經(jīng)SYBR Green I染色后，用凝膠成像系統(tǒng)成像，結(jié)果見圖1。

通過對比泳道1的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段，泳道2的裂解液擴增結(jié)果和泳道3的空白對照均未得到明顯的目的擴增條帶(暗帶為引物二聚體條帶)，而泳道4、5、6為聚多巴胺修飾離心管提取的E.coli O157:H7DNA模板的PCR產(chǎn)物，可以看到明亮的擴增條帶，大小為168bp。說明本發(fā)明的聚多巴胺修飾的離心管可成功地用于DNA的提取分離。

實施例2

以下以聚多巴胺修飾的離心管提取Listeria monocytogenes基因組DNA為例，來闡述應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)行實際樣品檢測的過程。

步驟1：聚多巴胺修飾離心管的制備

準(zhǔn)確稱取40mg鹽酸多巴胺和8mg過硫酸銨，依次加入20mL 20mmol/L Tris-HCl緩沖液中(pH值7.5，其中三羥甲基氨基甲烷的濃度為40mmol/L)混合均勻，然后將制得的混合液迅速加入離心管中，在25℃條件下?lián)u床振蕩反應(yīng)24h。將經(jīng)過上述處理的離心管放入40℃烘箱中進(jìn)行氮氣烘干，然后依次用10mmol/L Tris-HCl緩沖液中(pH值7.0)和去離子水洗滌，再放入40℃烘箱中進(jìn)行氮氣烘干。

步驟2：提取DNA

細(xì)菌裂解步驟同實施例1。然后，取200μL上清液(細(xì)菌裂解液)，并加入700μL吸附液(10mmol/L MES-HCl，pH值2.0)，充分混合后，加入步驟1制備的聚多巴胺修飾離心管中。吸附和洗脫步驟同實施例1。

步驟3：PCR擴增實驗

PCR擴增過程中用到的試劑除了引物外，其他的均同實施例1。選取的上下游引物是針對L.monocytogenes的毒力基因hlyA設(shè)計的，其目標(biāo)擴增片段大小為106bp。上下游引物的序列如下：

上游引物：5′‐GGGAAATCTGTCTCAGGTGATGT-3′

下游引物：5′-CGATGATTTGAACTTCATCTTTTGC-3′

PCR反應(yīng)條件同實施例1

步驟4：瓊脂糖凝膠電泳檢測同實施例1

結(jié)果見圖1。通過對比泳道1的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段，泳道7的裂解液擴增結(jié)果和泳道8的空白對照均未得到明顯的目的擴增條帶(暗帶為引物二聚體條帶)，而泳道9、10、11為聚多巴胺修飾離心管提取的L.monocytogenes DNA模板的PCR產(chǎn)物，可以看到明亮的擴增條帶，大小為106bp。說明本發(fā)明的聚多巴胺修飾的離心管可成功地用于DNA的提取分離。

實施例3

以下以聚多巴胺修飾的離心管提取Staphylococcus aureus基因組DNA為例，來闡述應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)行實際樣品檢測的過程。

步驟1：聚多巴胺修飾離心管的制備

準(zhǔn)確稱取20mg鹽酸多巴胺和2mg過硫酸銨，依次加入40mL 40mmol/L Tris-HCl緩沖液中(pH值9.5，其中三羥甲基氨基甲烷的濃度為10mmol/L)混合均勻，然后將制得的混合液迅速加入離心管中，在25℃條件下?lián)u床振蕩反應(yīng)8h。將經(jīng)過上述處理的離心管放入40℃烘箱中進(jìn)行氮氣烘干，然后依次用10mmol/L Tris-HCl緩沖液中(pH值7.0)和去離子水洗滌，再放入40℃烘箱中進(jìn)行氮氣烘干。

步驟2：提取DNA

細(xì)菌裂解步驟同實施例1。然后，取225μL上清液(細(xì)菌裂解液)，并加入750μL吸附液(10mmol/L MES-HCl，pH值2.0)，充分混合后，加入步驟1制備的聚多巴胺修飾離心管中。吸附和洗脫步驟同實施例1。

步驟3：PCR擴增實驗

PCR擴增過程中用到的試劑除了引物外，其他的均同實施例1。選取的上下游引物是針對S.enterica的16S rRNA基因設(shè)計的，其目標(biāo)擴增片段大小為177bp。上下游引物的序列如下：

上游引物：5′‐AAGAAGTGGGCGAACGCTTA-3′

下游引物：5′-ACGGTTCAGTTCTCTGCATCA-3′

PCR反應(yīng)條件同實施例1。

步驟4：瓊脂糖凝膠電泳檢測同實施例1

結(jié)果見圖1。通過對比泳道1的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段，泳道12的裂解液擴增結(jié)果和泳道13的空白對照均未得到明顯的目的擴增條帶(暗帶為引物二聚體條帶)，而泳道14、15、16為聚多巴胺修飾離心管提取的S.enterica DNA模板的PCR產(chǎn)物，可以看到明亮的擴增條帶，大小為177bp。說明本發(fā)明的聚多巴胺修飾的離心管可成功地用于DNA的提取分離。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南師范大學(xué)

<120> 聚多巴胺修飾的離心管及其制法和在核酸分離中的應(yīng)用

<130> 20161209

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物

<400> 1

cagtttacca accgtcat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物

<400> 2

gagcaaccgt tccattac 18

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物

<400> 3

gggaaatctg tctcaggtga tgt 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物

<400> 4

cgatgatttg aacttcatct tttgc 25

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物

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aagaagtggg cgaacgctta 20

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> 下游引物

<400> 6

acggttcagt tctctgcatc a 21