本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、分析化學(xué)以及組合化學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及適配體組合文庫及其構(gòu)建方法，還涉及使用所述的適配體組合文庫篩選評價所需適配體的方法以及由該方法篩選得到的適配體。本發(fā)明還涉及所述篩選得到的適配體的用途及含有所述篩選得到的適配體的試劑盒。利用本發(fā)明提供的適配體組合文庫及篩選方法篩選得到的適配體親和力更優(yōu)，并且無冗余序列。

背景技術(shù)：

寡核苷酸適配體(Oligonucleotide aptamer)，通常經(jīng)指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)篩選得到(Nature 1990,346；Science 1990,249(4968):505-510)，一般為一段短的單鏈寡核苷酸序列(ssDNA或RNA)，通過折疊成一定的三維結(jié)構(gòu)，經(jīng)空間構(gòu)型互補與靶分子形成高親和力、高特異性結(jié)合，又稱為“化學(xué)抗體”(Oncotarget 2016,7(12):13446-13463)。

對于通過SELEX技術(shù)篩選得到的適配體又稱全長適配體，一般均包含引物序列和隨機序列，長度一般在70～130堿基(nt)之間。全長適配體和靶分子的關(guān)鍵結(jié)合位點一般并不明確，這導(dǎo)致了全長適配體不適合作為功能性識別元件。許多經(jīng)SELEX技術(shù)篩選出的適配體，其引物區(qū)與隨機區(qū)產(chǎn)生堿基配對，某些引物區(qū)參與了特異性識別，或者隨機區(qū)序列較長，存在冗余堿基序列。因此，對于全長適配體序列，需對其進行結(jié)構(gòu)剪裁，以便于得到既保持結(jié)合活性、又僅有適當(dāng)長度(10-40nt)的適配體，這樣的適配體更適合作為功能性識別元件。為了得到這樣的適配體，需要精確界定對識別功能產(chǎn)生貢獻的適配體序列(或結(jié)構(gòu)域)。

因此，適配體后篩選(post-SELEX)始終是研究熱點之一，已發(fā)展了結(jié)構(gòu)剪裁、化學(xué)修飾、多價組合、定點突變等方法，從中尋找親和性更高、特異性更強、序列更短的適配體，但多數(shù)尚限于以試錯法(J.Biol.Chem.2001,276(54):48644-48654)進行嘗試。

試錯法一般是針對末輪文庫的富集序列，在共有的二級結(jié)構(gòu)及計算所得較低自由能(ΔG)的基礎(chǔ)上，依據(jù)一些核酸二級結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗性判斷，對適配體序列進行較為隨機的剪裁或定點突變，例如，上官等采用試錯法，對其篩選得到的呈環(huán)1-莖1-環(huán)2-莖2-環(huán)3二級結(jié)構(gòu)的肺癌細胞適配體Sgc8，進行結(jié)構(gòu)剪裁，逐級截掉環(huán)1、莖1、環(huán)2等，最終得到莖2-環(huán)3的適配體序列Sgc8c，基本保留了原Sgc8的親和力(Chem.Bio.Chem.2007,8:603-606)。又例如，發(fā)明人之前針對重組人促紅細胞生成素-α篩選得到的全 長適配體828，經(jīng)截掉全部隨機序列后得到的828r，較原來828的親和力稍優(yōu)(CN102191250A；Bioorg.Med.Chem.2010，18，8016-8025)。

上述試錯法效率較低，往往篩選得到許多無效序列。例如，F(xiàn)erreira-Bravo等采用試錯法對經(jīng)SELEX技術(shù)篩選得到的HIV反轉(zhuǎn)錄蛋白的DNA適配體FA1進行堿基替換，僅將適配體的四條莖部互補堿基序列全部簡單替換為G-C堿基對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該替換對親和活性無明顯影響；同時對于適配體的四個環(huán)部結(jié)構(gòu)域，僅進行簡單隨機剪裁，亦未發(fā)現(xiàn)親和活性優(yōu)的剪裁序列(Nucleic Acids Res.2015,43(20):9587-9599)。又例如，Esposito等針對15nt長的凝血酶適配體TBA，創(chuàng)建了14條在不同位點極性反轉(zhuǎn)(自5’-3’翻轉(zhuǎn)為3’-5’)序列，雖可進行結(jié)構(gòu)闡釋，但并未發(fā)現(xiàn)活性更優(yōu)的適配體(Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2007,26(8-9):1145-1149)。上述方法很難在有限的序列范圍內(nèi)，得到親和活性更優(yōu)、特異性更強的優(yōu)化適配體(Improved aptamer)序列。

還有Nonaka等學(xué)者將基于遺傳算法的虛擬篩選引入post-SELEX領(lǐng)域，賦予下一代文庫中高親和力序列更高的出現(xiàn)幾率，組合隨機突變位點，從3代50多條等長突變序列里篩選到較之原VEGF適配體序列的親和性高10倍的適配體(Anal.Chem.2013,85,1132-1137)。但仍無法回答適配體序列是否保守的問題，也無法確定那些是關(guān)鍵堿基。說明當(dāng)前在post-SELEX中普遍沿用的試錯法等進行結(jié)構(gòu)剪裁或定點突變的方法，工作效率較低、難度較大，尚無系統(tǒng)的理論指導(dǎo)和較好的解決方案。

在篩選和優(yōu)化適配體時，需要表征和評價適配體與靶分子間親和力。目前，用于表征和評價適配體與靶分子間親和力的方法，主要包括表面等離子體共振法(Surface Plasmon Resonance，SPR)、生物膜干涉法(Bio-Layer Interferometry，BLI)、等溫滴定量熱法(Isothermal Calorimetry，ITC)、凝膠電泳淌度變動分析法(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)、微量熱泳動法(Microscale Thermophoresis，MST)、后向散射干涉法(Backscattering Interferometry，BSI)以及熒光各向異性法(Fluorescence polarization，F(xiàn)P)等，依據(jù)結(jié)合作用前后的特征值變化來判定適配體與靶分子間親和力。EMSA、FP、MST均需對靶分子或配體進行熒光或放射性標(biāo)記；ITC屬于免標(biāo)記分析技術(shù)，但靈敏度較低、需用樣品量較大；SPR、BLI、BSI和基于分子自發(fā)熒光的MST等則因其免標(biāo)記、靈敏度高等備受關(guān)注。SPR和BLI除了能夠提供親和力數(shù)據(jù)外，還可以同時提供動力學(xué)數(shù)據(jù)，可實現(xiàn)高通量測定。SPR和BLI均需對靶分子進行固定，通過讀取表面固定后的靶分子和溶液中的配體間作用后的表面等離子體共振信號強度的變化、或表面厚度的增加而實施測定。

在使用SPR技術(shù)時，需要對靶分子的固定方式、相互作用的溶液體系、相互作用后的再生條件等關(guān)鍵因素進行考察和優(yōu)化，在建立合適、穩(wěn)定、高靈敏的SPR方法體系后，方能進行后續(xù)的適配體序列篩選評價等工作。

為了篩選、優(yōu)化親和力更優(yōu)、無冗余序列的最短適配體活性序列，需要找尋并開 發(fā)合適的裁剪方法對全長適配體(或待優(yōu)化適配體序列)進行結(jié)構(gòu)剪裁，還需要建立合適、穩(wěn)定、高靈敏的表征和評價方法，從而能夠高效地評價所剪裁序列和靶分子間的親和力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種構(gòu)建適配體組合文庫的方法。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種基于上述構(gòu)建適配體組合文庫的方法構(gòu)建的適配體組合文庫。

本發(fā)明的又一個目的是提供一種通過上述構(gòu)建適配體組合文庫的方法所構(gòu)建的適配體組合文庫篩選適配體的方法。

本發(fā)明的又一個目的是提供通過上述篩選方法篩選的適配體。

本發(fā)明的又一個目的是提供通過上述篩選方法所篩選的適配體的用途。

本發(fā)明的再一個目的是提供含有通過上述篩選方法所篩選的適配體的試劑盒。

本發(fā)明的再一個目的是提供含有通過上述篩選方法所篩選的適配體的組合物。

本發(fā)明的再一個目的是提供含有通過上述篩選方法所篩選的適配體的芯片。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種構(gòu)建適配體組合文庫的方法，包括以下步驟：

提供具有N個堿基的待優(yōu)化適配體，以待優(yōu)化適配體作為初始序列；

構(gòu)建第一分子群，其包含n₁個分子，所述n₁個分子各自為初始序列的5’末端截短體，并且每一個分子相對于初始序列具有不同的5’末端截短長度；

構(gòu)建第二分子群，其包含n₂個分子，所述n₂個分子各自為初始序列的3’末端截短體，并且每一個分子相對于初始序列具有不同的3’末端截短長度；

構(gòu)建第三分子群，其包含n₃個分子，所述n₃個分子各自為初始序列的5’和3’末端同時截短的截短體，在一個分子中5’和3’末端截短長度相同，并且每一個分子相對于初始序列具有不同的末端截短長度；

任選地，構(gòu)建第四分子群，其包含n₄個分子，

當(dāng)初始序列能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時，所述n₄個分子各自為初始序列的環(huán)部序列延長體，所述環(huán)部序列延長體不包括初始序列的莖部序列，在5’末端包含1～n₄個第一序列(例如由A和G組成的序列，例如AG)，且在3’末端包含1～n₄個第二序列，所述第二序列是第一序列的反向互補序列(例如由C和T組成的序列，例如CT)，在一個分子中5’末端包含的第一序列和3’末端包含的第二序列數(shù)量相同，并且每一個分子相對于初始序列具有不同的末端延長長度；

當(dāng)初始序列不能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時，所述n₄個分子各自為初始序列的延長體，所述延長體的5’末端包含1～n₄個第一序列(例如由A和G組成的序列，例如AG)，且在3’末端包含1～n₄個第二序列，所述第二序列為第一序列的反向互補序列(例如由C和T組成的序列，例如CT)，在一個分子中5’末端包含的第一序列和3’末端包含的第二序列數(shù)量相同， 并且每一個分子相對于初始序列具有不同的末端延長長度，

所述第一序列的長度可以為1個或多個堿基，例如，1、2、3或4個堿基；

其中，N為大于零的整數(shù)(例如，30～130之間的整數(shù))，

n₁、n₂、n₃、n₄各自獨立地為大于零且小于或等于N的整數(shù)(例如，5～80之間的整數(shù))。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的構(gòu)建適配體組合文庫的方法，其中，

第一分子群的構(gòu)建方法為：從5’末端對初始序列進行截短，共進行n₁次，每次截短1個或多個(例如，1、2、3、4個)堿基，由此獲得n₁個5’末端截短的分子，構(gòu)成第一分子群；

第二分子群的構(gòu)建方法為：從3’末端對初始序列進行截短，共進行n₂次，每次截短1個或多個(例如，1、2、3、4個)堿基，由此獲得n₂個3’末端截短的分子，構(gòu)成第二分子群；

第三分子群的構(gòu)建方法為：從5’和3’末端同時對初始序列進行截短，共進行n₃次，每次對5’和3’末端同時截短1個或多個(例如，1、2、3、4個)堿基，由此獲得n₃個5’和3’末端同時截短的分子，構(gòu)成第三分子群；

第四分子群的構(gòu)建方法為：

當(dāng)初始序列能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時，保持初始序列的環(huán)部序列不變，將莖部序列去除，在環(huán)部序列的5’末端添加第一序列(例如由A和G組成的序列，例如AG)，且在環(huán)部序列的3’末端添加第二序列，所述第二序列為第一序列的反向互補序列(例如由C和T組成的序列，例如CT)，重復(fù)進行n₄次，由此獲得n₄個5’和3’末端同時延長的分子，構(gòu)成第四分子群；

當(dāng)初始序列不能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時，在初始序列的5’末端添加第一序列(例如由A和G組成的序列，例如AG)，且在3’末端添加第二序列，所述第二序列為第一序列的反向互補序列(例如由C和T組成的序列，例如CT)，重復(fù)進行n₄次，由此獲得n₄個5’和3’末端同時延長的分子，構(gòu)成第四分子群。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的構(gòu)建適配體組合文庫的方法，其中第一分子群、第二分子群或第三分子群中長度最短的分子，其為具有10～40個堿基，例如，20～30個堿基。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的構(gòu)建適配體組合文庫的方法，其中所述待優(yōu)化適配體為特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體，例如，SEQ ID NO.1所示的全長適配體。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的構(gòu)建適配體組合文庫的方法，其中所述待優(yōu)化適配體為特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體，例如，SEQ ID NO.1所示的全長適配體，其中N＝39，n₁＝9，n₂＝9，n₃＝9，n₄＝8，所述第一序列的長度為1個堿基、2個堿基或3個堿基。

本發(fā)明還提供一種適配體組合文庫，包括：

第一分子群，其包含n₁個分子，所述n₁個分子各自為初始序列的5’末端截短體，并 且每一個分子相對于初始序列具有不同的5’末端截短長度；

第二分子群，其包含n₂個分子，所述n₂個分子各自為初始序列的3’末端截短體，并且每一個分子相對于初始序列具有不同的3’末端截短長度；

第三分子群，其包含n₃個分子，所述n₃個分子各自為初始序列的5’和3’末端同時截短的截短體，在一個分子中5’和3’末端截短長度相同，并且每一個分子相對于初始序列具有不同的末端截短長度；以及

任選地，第四分子群，其包含n₄個分子，

當(dāng)初始序列能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時，所述n₄個分子各自為初始序列的環(huán)部序列延長體，所述環(huán)部序列延長體不包括初始序列的莖部序列，在5’末端包含1～n₄個第一序列(例如由A和G組成的序列，例如AG)，且在3’末端包含1～n₄個第二序列，所述第二序列是第一序列的反向互補序列(例如由C和T組成的序列，例如CT)，在一個分子中5’末端包含的第一序列和3’末端包含的第二序列數(shù)量相同，并且每一個分子相對于初始序列具有不同的末端延長長度；

當(dāng)初始序列不能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時，所述n₄個分子各自為初始序列的延長體，所述延長體的5’末端包含1～n₄個第一序列(例如由A和G組成的序列，例如AG)，且在3’末端包含1～n₄個第二序列，所述第二序列為第一序列的反向互補序列(例如由C和T組成的序列，例如CT)，在一個分子中5’末端包含的第一序列和3’末端包含的第二序列數(shù)量相同，并且每一個分子相對于初始序列具有不同的末端延長長度，

所述第一序列的長度可以為1個或多個堿基，例如，1、2、3、4個堿基；

其中，N為大于零的整數(shù)(例如，30～130之間的整數(shù))，

n₁、n₂、n₃、n₄各自獨立地為大于零且小于或等于N的整數(shù)(例如，5～80之間的整數(shù))，

所述初始序列為待優(yōu)化適配體。

在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的適配體組合文庫，其中所述待優(yōu)化適配體為特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體，例如，SEQ ID NO.1所示的全長適配體。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的適配體組合文庫，由SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.36所示序列構(gòu)成。

本發(fā)明還提供一種篩選適配體的方法，該方法使用前述本發(fā)明任意項所述的適配體組合文庫篩選所需適配體，例如，能夠特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體。

在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法，其包括：

(1)提供適配體組合文庫；

(2)將適配體組合文庫中的每一個分子與靶蛋白(例如EPO蛋白)接觸；

(3)檢測適配體組合文庫中每一個分子與靶蛋白之間的親和力。

在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法，該方法采用表面等離子體共振法(SPR法)檢測每一個分子與靶蛋白之間的親和力。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的適配體篩選方法，包括以下步驟：

1)將靶蛋白固定于芯片(例如SA芯片)表面；

2)進行SPR動力學(xué)分析，進樣，使所述適配體組合文庫中的分子與固定在芯片表面的靶蛋白結(jié)合，生成復(fù)合物，進樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，得到各序列單點RU值變化曲線，根據(jù)響應(yīng)值(RU值)判斷待篩選適配體是否具有活性，RU值大于0的適配體具有活性；

3)對于具有活性的分子，進行多循環(huán)動力學(xué)分析(MCK分析)，得到解離常數(shù)K_D，根據(jù)K_D數(shù)值的大小判斷每個分子與靶蛋白之間的親和力，K_D數(shù)值越小，親和力越強。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法或任意上文適用的實施方式，其中，步驟1)是將所述靶蛋白偶聯(lián)生物素后固定在芯片表面，例如，所述靶蛋白在氨基酸殘基的氨基末端、羧基末端或糖基的唾液酸末端與生物素共價偶聯(lián)，優(yōu)選靶蛋白與生物素共價偶聯(lián)的化學(xué)計量比為1:1。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法或任意上文適用的實施方式，其中，步驟2)所述適配體組合文庫中的分子于90～98℃(例如95℃)變性5～10min(例如5min)，自然冷卻至室溫，再進樣，進樣溫度為20～30℃(例如25℃)，進樣結(jié)合時間為60～180秒(例如120秒)，解離時間為120～600秒(例如300秒)，流速為20～50μL/min(例如30μL/min)，所用緩沖液為Tris-T緩沖液。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法或任意上文適用的實施方式，本發(fā)明所述的適配體篩選方法，其中，步驟3)中所述MCK分析，將所述適配體組合文庫中的分子于90～98℃(例如95℃)變性5～10min(例如5min)，自然冷卻至室溫，再進樣，進樣溫度為20～30℃(例如25℃)，進樣結(jié)合時間為60～180秒(例如120秒)，解離時間為120～600秒(例如300秒)，流速為20～50μL/min(例如30μL/min)，MCK分析過程中所用緩沖液為Tris-T緩沖液。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法或任意上文適用的實施方式，其中所述的Tris-T緩沖液的配方為：20mM Tris，140mM NaCl，5mM MgCl2，5mM KCl，Tween 20，以HCl調(diào)至pH為7.4-7.6。其中，Tween 20濃度范圍為0.005％～0.1％，例如為0.05％。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法或任意上文適用的實施方式，其中，芯片的再生條件可以為高離子強度的鹽，例如1～3M NaCl，例如3M NaCl；也可以為酸性條件，例如pH為1.5～2.5的10mM甘氨酸，例如pH為2.5的10mM甘氨酸；還可以為堿性條件，例如1-15mM NaOH，例如5mM NaOH。優(yōu)選的再生條件為5mM NaOH，再生時間為15秒。

本發(fā)明還提供一種能夠特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體，其選自SEQ ID NO.4～9所示的序列，以及如式I至式VII所示的序列，

N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGGTTTGGG(式I)

AGAGAGAGAGAGAGA-N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGG-TTTGGG-TCTCTC TCTCTCTCT(式II)

GAGAGAGAGAGA-N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGGTTT-GGG-TCTCTCTCTCTC(式III)

GAGAGAGAGA-N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGGTTT-GGG-TCTCTCTCTC(式IV)

AGAGAGA-N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGGTTTGGG-TCTCTCT(式V)

GAGAGA-N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGGTTTGGG-TCTCTC(式VI)

AGAGA-N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGGTTTGGG-TCTCT(式VII)

其中，N為G、A、C或T；Y為C或T。

本發(fā)明還提供所述能夠特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體用于檢測EPO蛋白的用途。

本發(fā)明還提供用于檢測EPO蛋白的組合物、試劑盒或芯片，其中含有上述本發(fā)明所述的能夠特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體。

本發(fā)明還提供一種檢測EPO蛋白的方法，包括：

(1)提供待測樣品；

(2)使權(quán)利要求16所述的適配體與待測樣品接觸；

(3)檢測適配體與EPO之間的結(jié)合。

本發(fā)明中，所述的待優(yōu)化適配體，可以是任何與靶分子形成高親和力或高特異性結(jié)合的適配體，例如能夠特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體。

本發(fā)明中，所述的EPO蛋白可以是天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白或rHuEP O-β蛋白，也可以是去糖基化的上述EPO蛋白。

發(fā)明詳述

發(fā)明人選擇重組人促紅細胞生成素-α(recombinant human Erythropoietin-α，rHuEPO-α，簡稱EPO-α)的單鏈DNA適配體828r作為初始序列或模式分子(參見CN102191250A；Bioorg.Med.Chem.2010，18，8016-8025)，具體說明本發(fā)明的所述構(gòu)建適配體組合文庫的方法，基于上述構(gòu)建適配體組合文庫的方法構(gòu)建的適配體組合文庫，以及通過所構(gòu)建的適配體組合文庫篩選所需適配體的方法。

該EPO-α的單鏈DNA適配體的如SEQ ID NO:1所示，其序列長度為39nt，在本發(fā)明中將其命名為828r-39nt(簡稱39nt)。39nt的二級結(jié)構(gòu)呈莖環(huán)狀，其與EPO-α間的解離常數(shù)K_D通過EMSA法測定為K_{D(39nt/EPO-α)}＝39±27nM，其與EPO-α間的具體作用位點尚不明確。

發(fā)明人則巧妙地借助了組合化學(xué)思路，提出“序列中相鄰堿基位點極可能通過堿基堆積影響空間相互作用”的假說，發(fā)明設(shè)計了四組步進型序列，構(gòu)成步進型適配體組合文庫。該文庫中的四組序列分別命名為向左收縮(Left contraction)分子群、向右收縮(Right contraction)分子群、兩端收縮(Inner contraction)分子群、和兩端擴展(又稱莖部延長，Stem-nbp)分子群。

其中，向左收縮分子群是指在初始序列39nt的基礎(chǔ)上，從其5’末端逐級剪裁掉相鄰的兩個堿基，構(gòu)成從Left contraction 37、35、33、……、一直到Left contraction 21(簡稱L37、L35、L33、……、L21)等9條序列。向右收縮分子群則正好相反，是在初始序列807-39nt的基礎(chǔ)上，從其3’末端逐級剪裁掉相鄰的兩個堿基，構(gòu)成從Right contraction 37、35、33、……、一直到Right contraction 21(簡稱R37、R35、R33、……、R21)等9條序列。兩端收縮分子群是指在初始序列39nt的基礎(chǔ)上，從其5’和3’末端兩側(cè)各逐級剪裁掉單個堿基，構(gòu)成從Inner contraction 37、35、33、……、一直到Inner contraction 21(簡稱In37、In35、In33、……、In21)等9條序列。如此三組各9條序列，共得到27條序列(參見圖1)。莖部延長分子群則指在保持適配體環(huán)部序列不變的情況下，其莖部序列改為第一序列(例如包含G和A的序列，例如GA、AGA、AGAGA、GAGAGA、AGAGAGA、GAGAGAGAGA、GAGAGAGAGAGA、AGAGAGAGAGAGAGA、)……第二序列(例如包含C和T的序列，例如TC、TCT、TCTCT、TCTCTC、TCTCTCT、TCTCTCTCTC、TCTCTCTCTCTC、TCTCTCTCTCTCTCT)互補堿基，構(gòu)成從Stem-2bp、3bp、5bp、6bp、7bp、10bp、12bp到Stem-15bp等8條序列。如此構(gòu)成的適配體步進型組合文庫，僅用了35條序列，即涵蓋了能產(chǎn)生特異親和作用的大多數(shù)可能范圍，同時能夠明確特異性適配體中關(guān)鍵堿基位點的作用。這就為得到最短適配體，及探討可能的結(jié)合機制奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明人使用上述所構(gòu)建的步進型適配體組合文庫篩選親和活性高的特異性結(jié)合EPO-α蛋白的適配體。篩選時，采用SPR法表征和評價適配體與靶分子間親和力。具體地，所使用的儀器可以是Biacore T100、T200(美國GE公司)、ProteOn XPR36(美國伯樂公司)、Reichert4SPR(美國Reichert公司)等。

在測定親和活性時，采用鏈霉親和素包被的葡聚糖芯片(簡稱SA芯片)固定靶蛋白EPO-α。將EPO-α與生物素共價偶聯(lián)后，固定在SA芯片表面。

EPO-α與生物素共價偶聯(lián)后的產(chǎn)物稱為生物素化EPO-α。EPO-α可以通過多種方式與生物素共價偶聯(lián)，共價偶聯(lián)的方式取決于EPO-α分子結(jié)構(gòu)中的末端基團類型。例如，所述EPO-α可以通過其氨基酸殘基的末端氨基偶聯(lián)生物素，或是其氨基酸殘基的末端羧基偶聯(lián)生物素，或是可以通過其糖基的末端唾液酸基團偶聯(lián)生物素。

偶聯(lián)試劑的結(jié)構(gòu)中一般分為生物素基團、反應(yīng)基團以及連接臂部分。適當(dāng)?shù)倪B接臂長度可以有效克服固定時的空間位阻?？梢愿鶕?jù)EPO-α末端基團的類型選擇不同的偶聯(lián)試劑。

例如，當(dāng)EPO-α的氨基酸殘基末端為氨基基團時，選擇的生物素偶聯(lián)試劑可以為不同形式的琥珀酰亞胺化生物素，例如Sulfo-NHS-LC-Biotin(Sulfosuccinimidyl-6-[biotin-amido]hexanoate，6-[生物素酰胺基]己酸磺酸基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin(Sulfosuccinimidyl-6-[biotin-amido]-6-hexanamido hexanoate，6-[生物素酰胺基]-6-己酰氨基己酸-磺酸基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、NHS-LC-Biotin(Succinimidyl 6-(biotinamido)hexanoate，6-[生物素酰胺基]己酸-N-羥基琥 珀酰亞胺酯)、NHS-LC-LC-Biotin(Succinimidyl-6-(biotin-amido)-6-hexanamido hexanoate，6-[生物素酰胺基]-6-己酰氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、NHS-PEG4-Biotin(生物素四聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯)、NHS-PEG12-Biotin(生物素十二聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯)等。

當(dāng)EPO-α的氨基酸殘基末端為羧基基團時，選擇的生物素偶聯(lián)試劑可以為末端氨基化生物素，例如，Amine-PEG3-Biotin(生物素三聚乙二醇胺)、Biocytin Hydrazide(生物素酰肼)等，偶聯(lián)時需同時加入碳二亞胺(EDC)。

當(dāng)EPO-α的糖基末端為唾液酸時，選擇的生物素偶聯(lián)試劑可以為生物素化的肼，例如Biocytin Hydrazide(生物素酰肼)、Biotin-LC-Hydrazide(6-(biotinamido)hexanehydrazide，6-[生物素酰胺]-己酰肼)、Biotin-PEG4-Hydrazide(生物素四聚乙二醇酰肼)，偶聯(lián)時需先將唾液酸基團以高碘酸鈉氧化成醛。

在一個優(yōu)選的實施方案中，EPO-α與偶聯(lián)試劑以1:1摩爾比共價偶聯(lián)，稱為單分子生物素化EPO-α蛋白，簡稱Bio-EPO-α。

在一個優(yōu)選的實施方案中，EPO-α的氨基酸殘基末端為氨基基團時，選取偶聯(lián)試劑Sulfo-NHS-LC-Biotin與EPO-α共價偶聯(lián)，得到單分子生物素化的NH₂-Bio-EPO-α。EPO-α的氨基酸殘基末端為羧基基團時，選取偶聯(lián)試劑Biotin Hydrazide與EPO-α共價偶聯(lián)，得到單分子生物素化的COOH-Bio-EPO-α。EPO-α的糖基末端為唾液酸基團時，選取偶聯(lián)試劑Biocytin Hydrazide與EPO-α共價偶聯(lián)，得到單分子生物素化的Sialyl-Bio-EPO-α。

在芯片表面固定靶蛋白時，根據(jù)不同的實驗?zāi)康?，可以選擇不同水平的靶蛋白濃度。在進行多循環(huán)動力學(xué)(MCK)分析時，選擇適宜濃度，使目標(biāo)分析物的最大結(jié)合量(Rmax)≧30響應(yīng)單位(RU)即可。而若進行穩(wěn)態(tài)分析，則靶蛋白濃度可以更高，以使固定量達到飽和。Rmax＝配體固定量×(目標(biāo)分析物的分子量/配體的分子量)×結(jié)合計量比。

在芯片表面固定靶蛋白時，還需要考察并優(yōu)化固定時間、流速等條件。在本發(fā)明的一個實施例中，首先以50mM NaOH、1M NaCl溶液進行通道初始化，進樣3次，流速為20μL/min，每次進樣的時間為60秒，然后用70％甘油水溶液對芯片進行歸一化處理。然后在將1μM的單分子生物素化的Sialyl-Bio-EPO或NH₂-Bio-EPO-α，在流速10μL/min，進樣時間60秒的條件下，固定于SA芯片上。再生條件為5mM NaOH，流速30μL/min，再生時間為15秒。

在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明利用單點進樣方式進行SPR動力學(xué)分析實驗，即單點篩選法，篩選出各適配體分子群中與EPO-α具有親和力的序列(又稱活性序列)，具體表現(xiàn)為結(jié)合-解離曲線(即進樣后，響應(yīng)值(RU值)的變化曲線)具有正響應(yīng)。單點進樣，也就是單一濃度進樣，能夠直觀地表示出樣品是否與靶蛋白存在結(jié)合活性的響應(yīng)(即RU值>0))。

SPR動力學(xué)分析能夠確定在一個給定的時間跨度內(nèi)，適配體與固定在芯片上的靶蛋白 形成的復(fù)合物是否能夠結(jié)合和完全解離，進樣后，適配體和靶蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，響應(yīng)值(RU值)增加；然后結(jié)束進樣，注入空白緩沖溶液，復(fù)合物解離，RU值下降。

采用單點法篩選具有活性的適配體序列時，進樣后，所述適配體組合文庫中的待篩選適配體與固定在芯片表面的靶蛋白結(jié)合，生成復(fù)合物，進樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，得到各序列單點RU值變化曲線，根據(jù)響應(yīng)值(RU值)判斷待篩選適配體是否具有活性，RU值大于0的適配體具有活性。

對于具有活性的適配體序列，再進行多循環(huán)動力學(xué)分析(MCK分析)，得到親和力參數(shù)解離常數(shù)K_D，以及動力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合速率常數(shù)K_a和解離速率常數(shù)K_d。其中K_D＝K_d/K_a。根據(jù)K_D數(shù)值的大小判斷待篩選適配體與靶蛋白之間的親和力，K_D數(shù)值越小，親和力越強，從而篩選出親和力強的適配體序列。

在進行單點篩選或者進行MCK分析時，所述適配體組合文庫中的待篩選適配體在進樣前，均先于90～98℃(例如95℃)變性5～10min(例如5min)，自然冷卻至室溫，然后再進樣。進樣溫度為20～30℃(例如25℃)，進樣結(jié)合時間為60～180秒(例如120秒)，解離時間為120～600秒(例如300秒)，流速為20～50μL/min(例如30μL/min)，所用緩沖液為Tris-T緩沖液。再生條件為5mM NaOH，流速30μL/min，再生時間為15秒。

其中所述的Tris-T緩沖液的配方為：20mM Tris，140mM NaCl，5mM MgCl2，5mM KCl，Tween 20，以HCl調(diào)至pH7.4-7.6。其中，Tween 20濃度范圍為0.005％～0.1％，優(yōu)選為0.05％。

在進行單點篩選時，所述步進型適配體組合文庫中的各序列進樣濃度可以為200～1000nM，例如500nM。

在一個具體的實施方案中，單點篩選可以通過以下具體步驟得以實現(xiàn)：

1)各適配體分子群的各序列進樣濃度為500nM。各序列首先于95℃，5min變性后，自然冷卻至室溫。緩沖液Tris-T緩沖液的配方為：20mM Tris，140mM NaCl，5mM MgCl₂，5mM KCl，0.05％Tween 20，以HCl調(diào)至pH 7.4-7.6；

2)進行SPR動力學(xué)分析實驗(n≧2)，依據(jù)每條適配體序列的RU值篩選出具有活性的適配體序列，RU值>0的適配體序列具有活性。實驗時，進樣溫度選擇25℃，進樣結(jié)合時間120s，解離時間300s，流速30μL/min；

3)再生條件可以為高離子強度的鹽，例如1～3M NaCl；也可以為酸性條件，例如10mM甘氨酸，pH 1.5～2.5；還可以為堿性條件，例如1-15mM NaOH。優(yōu)選再生條件為5mM NaOH，再生時間設(shè)為15秒。

在進行MCK分析時，可以根據(jù)待分析適配體序列與EPO-α的單點結(jié)合的RU值，選擇合適的濃度梯度范圍進行MCK分析。例如500nM的Stem-3bp，其RU值較低，僅為3，所選擇的濃度梯度則酌情選擇為較高濃度范圍，例如125nM～2000nM(各點間為倍增關(guān)系)；而500nM的Stem-7bp，其RU值較高，為80RU，選擇的濃度梯度為12.5nM ～400nM。

在一個具體的實施方案中，MCK分析通過以下具體步驟得以實現(xiàn)：

1)各序列首先于95℃，5min變性后，自然冷卻至室溫。結(jié)合緩沖液為Tris-T緩沖液。

2)進行MCK分析，進樣結(jié)合時間設(shè)為120s，解離時間300s，流速30μL/min；再生條件為5mM NaOH，15秒。

3)對MCK結(jié)果進行非線性擬合，得出K_a，K_d和K_D值。

在進行MCK分析時，還需從擬合結(jié)果符合度判斷該非線性擬合結(jié)果是否正常。擬合結(jié)果符合度由U值和Chi²值決定。U值一般需≦15，說明擬合符合度較高；U值越低，符合度越高，U值最低為1；Chi²一般需≦0.1Rmax，說明擬合符合度較高。

采用本發(fā)明所述的適配體的篩選方法對所構(gòu)建的步進型適配體組合文庫進行篩選，結(jié)果表明：

1)向左收縮分子群，僅L37、L35、L33為活性序列，其K_D值分別為320±30nM、360±110nM和390±30nM，呈現(xiàn)從低到高逐漸增加的特征；

2)向右收縮分子群，僅R37、R35、R33、R31為活性序列，其K_D值分別為560±170nM、1300±150nM和140±40nM、130±30nM，基本呈現(xiàn)從高到低逐漸降低的特征；

3)兩端收縮分子群，In37、In35、In33、In31、In29、In27、In25有活性，但活性差別較大。其K_D值分別為310±120nM(In37)、390±40nM(In35)、750±30nM(In33)、390±50nM(In31)、200±1nM(In29)、52±4nM(In27)和2060±125nM(In25)，其K_D值從In37到In33逐漸升高，然后至In27又逐漸降低，In27的K_D值降低最為明顯，而后In25的K_D值又急劇升高，In23、In21的親和活性基本喪失；In 27是所有剪裁序列中親和活性最高的序列；

4)莖部延長分子群，所有8條序列均有活性，其K_D值分別為390±50nM(Stem-2bp)、440±40nM(Stem-3bp)、80±10nM(Stem-5bp)、40±2nM(Stem-6bp)、30±5nM(Stem-7bp)、40±20nM(Stem-10bp)、40±0.1nM(Stem-12bp)、50±20nM(Stem-15bp)。其中僅Stem-2bp、Stem-3bp的親和活性較低，其K_D值從2bp一直到7bp逐漸降低，從7bp到15bp，其K_D值基本一致。親和活性最高的為Stem-7bp。同時，Stem-7bp、Stem-6bp、Stem-10bp、Stem-12bp、Stem-15bp的親和活性均優(yōu)于39nt。

可以看出，通過對本發(fā)明提供的步進型適配體組合文庫進行親和力及動力學(xué)評價，可迅速篩選得到親和力更強、序列更短的適配體序列In 27。

另外，根據(jù)上述4組適配體分子群的親和力及動力學(xué)特征，也可以判斷適配體序列中是否存在關(guān)鍵識別位點。向左收縮分子群中，僅有能夠形成高級結(jié)構(gòu)G-四聚體結(jié)構(gòu)(GQ)的L37、L35、L33存在親和識別能力，并且隨著莖部結(jié)構(gòu)的縮短，親和活性也逐漸下降。

向右收縮分子群中，亦只有能夠形成高級結(jié)構(gòu)GQ的R37、R35、R33、R31具有親和活性，特別地，該分子群中，7A8A堿基是否充分暴露對親和活性有較大的影響。7A8A的 完全暴露(R33)較之被掩蔽(R35、R37)時，適配體的活性基本恢復(fù)。而7A8A去除前后(R33、R31)，活性基本相同。

而兩端收縮分子群中，隨著莖部的縮短，親和活性逐漸降低，而保留了整個環(huán)部的In27親和力完全恢復(fù)，提示可能形成了新的高級結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明還針對所得到的最短適配體In27，構(gòu)建了其定點突變分子群，以明確具體堿基位點對結(jié)合的貢獻。In27的二級序列特征為，僅保留了39nt的環(huán)部序列；其一級結(jié)構(gòu)序列特征為，--GG---------GGGG--GG--GGG；結(jié)合其圓二色譜結(jié)果，推測In27可能形成了以GQ為骨架的三級結(jié)構(gòu)。

將最短適配體In27的堿基序列劃分為GQ骨架結(jié)構(gòu)和除GQ骨架外的5個結(jié)構(gòu)域(Domain)。從而構(gòu)建了各定點突變分子群，共7組，分別命名為D1、D2、D3&4、D5、GQ和簡并序列定點突變分子群，共31條序列。其中：

D1定點突變分子群包括：1A堿基改為C/T/G/X、2A堿基改為T/G、以及1A2A堿基同時改為T堿基等7條序列；

D2定點突變分子群包括：6C堿基改為T/A/G/X、8G堿基改為T堿基、6C8G同時改為T堿基、11T堿基改為X(X代表該位點的堿基缺失)，以及10T11T堿基同時改為X等8條序列；

D3&4定點突變分子群包括：18T堿基改為A堿基、以及23T堿基改為A堿基等2條序列；

D5定點突變分子群包括：27G堿基改為A/T/X等3條序列；

GQ定點突變分子群包括：25G改為T/X(X代表該位點的堿基缺失)，即25T、25X；在6位的C改為T的前提下，14G、15G、16G、17G中的G堿基分別改為T堿基，即為14T、15T、16T、17T，以及14G15G、15G16G、16G17G、14G17G中的兩個G堿基均改為T堿基，即14T15T、15T16T、16T17T、14T17T等10條序列；

簡并序列分子群包括1A6C堿基同時改為T堿基，即1T6T、1A6C27G堿基分別改為1T16T27A堿基、以及1A27G堿基改為1T27A堿基等3條序列。

利用單點篩選法，對所述定點突變分子群進行其親和活性的篩選和評價。

結(jié)果表明，GQ骨架對識別非常重要，25G參與了GQ中GG骨架的形成，14-17位的G堿基均可能與GQ骨架相關(guān)；D2結(jié)構(gòu)域是最短適配體In27與EPO-α發(fā)生相互作用的主要結(jié)構(gòu)域；D2、D3、D4環(huán)上的序列保守性較高，除6C外，其他堿基不能任意改動。該結(jié)果表明了In27的高度保守性。

從而可得到其簡并序列為：

¹NAGGT⁶YTGT¹⁰TTTTGGGGTT²⁰GGTTTGGG

其中，N代表A、G、T或C，Y代表C或T。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果包括以下一個或多個方面：

1)本發(fā)明提供的構(gòu)建適配體組合文庫的方法，采用高效的結(jié)構(gòu)剪裁方式構(gòu)建內(nèi)含較少序列的組合文庫，所構(gòu)建的適配體組合文庫涵蓋了能產(chǎn)生特異親和作用的大多數(shù)可能范圍，為得到最短適配體，及探討可能的結(jié)合機制奠定了基礎(chǔ)。

2)本發(fā)明提供的適配體篩選方法，使用本發(fā)明提供的適配體組合文庫篩選適配體，可篩選出親和力更優(yōu)、無冗余序列的最短適配體活性序列，并能夠明確特異性適配體中關(guān)鍵堿基位點的作用。

3)應(yīng)用本發(fā)明提供的適配體篩選方法，篩選得到了親和力更優(yōu)的序列：Stem-7bp、Stem-6bp、Stem-10bp、Stem-12bp、Stem-15bp、In27，其中In27為無冗余序列的最短適配體活性序列。這些序列可以用于檢測EPO蛋白。

4)對于篩選得到的該最短適配體序列In27，結(jié)合該序列的特征，利用定點堿基突變，闡明了關(guān)鍵堿基對結(jié)合的貢獻。

5)得到最短適配體In27的簡并序列。In27及其簡并序列均具備和EPO-α間良好的親和活性，適于用作親和傳感功能元件。

附圖說明

圖1.步進型適配體組合文庫的序列構(gòu)成圖；

圖2.各定點突變分子群序列構(gòu)成圖；

圖3A.EPO-α的氨基酸殘基末端為氨基基團時，與生物素共價偶聯(lián)的反應(yīng)流程圖；

圖3B.EPO-α的氨基酸殘基末端為羧基基團時，與生物素共價偶聯(lián)的反應(yīng)流程圖；

圖3C.EPO-α的糖基末端為唾液酸基團時，與生物素共價偶聯(lián)的反應(yīng)流程圖；

圖4.在SA芯片上固定Bio-EPO-α(1μM)后的適配體序列(500nM，39nt)的結(jié)合響應(yīng)，其中：

(A)為在SA芯片上固定Bio-NH₂-EPO-α?xí)r的RU值變化曲線，RU_stability＝2342，固定條件：進樣流速為10μL/min，進樣時間為60秒；

(B)為500nM 39nt作為分析物評價Bio-NH₂-EPO的固定效果時的RU值變化曲線；

(C)為在SA芯片上固定Bio-Sialyl-EPO-α?xí)r的RU值變化曲線，RU_stability＝2342，固定條件：進樣流速為10μL/min，進樣時間為60秒；

(D)為500nM 39nt作為分析物評價Sialyl-NH₂-EPO的固定效果時的RU值變化曲線；

圖5A.SA芯片上固定Bio-NH₂-EPO-α?xí)r，39nt的結(jié)合解離譜圖；

圖5B.SA芯片上固定Sialyl-Bio-EPO-α?xí)r，39nt的的結(jié)合解離譜圖；

圖6.向左收縮適配體分子群各序列的單點RU值變化曲線；

圖7.向右收縮適配體分子群各序列的單點RU值變化曲線；

圖8.兩端收縮適配體分子群各序列的單點RU值變化曲線；

圖9.兩端延展適配體分子群各序列的單點RU值變化曲線；

圖10為In27在含不同濃度K⁺的Tris-HCl緩沖液中的圓二色譜圖；

圖11A.GQ定點突變適配體分子群中，14-17位的G堿基的定點突變單點篩選結(jié)果，參比序列為In27，每條序列濃度為500nM；

圖11B.圖11A中方框部分的局部放大圖，可以看到25位G堿基的定點突變單點篩選結(jié)果；

圖12.D1定點突變適配體分子群各序列的單點篩選結(jié)果，參比序列為In27，每條序列濃度為500nM；

圖13.D2定點突變適配體分子群各序列的單點篩選結(jié)果，參比序列為In27，每條序列濃度為500nM；

圖14.D3&4定點突變適配體分子群各序列的單點篩選結(jié)果，參比序列為In27，每條序列濃度為500nM；

圖15.D5定點突變適配體分子群各序列的單點篩選結(jié)果，參比序列為In27，每條序列濃度為500nM；

圖16.簡并序列適配體分子群各序列的單點篩選結(jié)果，參比序列為In27，每條序列濃度為500nM；

圖17A.在SA芯片上固定3’-Biotin-39nt時，EPO-α的MCK譜圖，每條序列濃度為500nM；

圖17B.在SA芯片上固定3’-Biotin-12T-In27時，EPO-α的MCK譜圖，每條序列濃度為500nM。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細敘述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件和制造商建議的條件進行，所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的產(chǎn)品。

本發(fā)明的實施例中采用SPR法表征和評價適配體與靶分子間親和力。具體地，所使用的儀器是BIAcore T100生物大分子相互作用儀，購自美國GE公司。

實驗時，樣品以恒定的流速和濃度流過芯片表面，樣品中的待分析物(例如本發(fā)明所構(gòu)建的適配體步進型組合文庫中的適配體)和固定在芯片表面的分子(例如NH₂-Bio-EPO-α或Sialyl-Bio-EPO-α)發(fā)生結(jié)合形成復(fù)合物，芯片表面物質(zhì)的質(zhì)量發(fā)生改變，儀器記錄下對應(yīng)的響應(yīng)值(Response Unit，以下簡稱RU值)的變化。結(jié)束進樣后，使空白緩沖液流過芯片表面，復(fù)合物發(fā)生解離，芯片表面物質(zhì)的質(zhì)量再次發(fā)生改變，儀器記錄對應(yīng)的RU值的變化。

該技術(shù)能夠跟蹤記錄樣品中的待分析物與芯片表面的分子結(jié)合、解離整個過程的變化，記錄RU值的變化，生成結(jié)合-解離曲線。通過多循環(huán)動力學(xué)(Multiple Cycle Kinetics，MCK)分析，還能提供動力學(xué)數(shù)據(jù)(例如，結(jié)合速率常數(shù)K_a、解離速率常數(shù)K_d)以及親和力數(shù)據(jù)(例如，解離常數(shù)K_D，K_D＝K_d/K_a)。

待分析的適配體序列與偶聯(lián)在芯片表面的分子結(jié)合后，RU值>0的適配體序列具有活性。對于具有活性的適配體序列，進行MCK分析，可以得到各條適配體序列與EPO-α間的親和力及動力學(xué)參數(shù)。親和力以解離常數(shù)K_D表征，K_D越低，則親和力越高。動力學(xué)參數(shù)中，結(jié)合速率常數(shù)K_a表示分析物與配體分子間形成復(fù)合物的快慢，其數(shù)值相當(dāng)于1M的分析物與配體混合時形成的復(fù)合物的數(shù)量，單位為M^-1s^-1；解離速率常數(shù)K_d表示復(fù)合物解離的快慢，其數(shù)值相當(dāng)于復(fù)合物每秒解離的比例，單位為s^-1)。依活性不同，各條適配體與EPO-α的K_D值一般在nM～μM范圍。

本發(fā)明實施例中所用的緩沖液如下：

1)5×PBS緩沖液，其配方為：0.75M NaCl，0.1M Na₃PO₄，pH值為7.2；

2)1×PBS緩沖液，其配方為：0.15M NaCl，0.02M Na₃PO₄，pH值為7.2；

3)5×Tris-HCl緩沖液，其配方為100mM Tris，700mM NaCl，25mM MgCl₂，25mM KCl，pH值為7.4-7.6；

4)Tris-T緩沖液，其配方為20mM Tris，140mM NaCl，5mM MgCl₂，5mM KCl，0.05wt％Tween 20，以HCl調(diào)至pH 7.4-7.6。

實施例1適配體步進型組合文庫的構(gòu)建

如圖1所示，選擇SEQ ID NO:1所示的EPO-α的單鏈DNA適配體作為初始序列，分別構(gòu)建向左收縮分子群、向右收縮分子群、兩端收縮分子群和莖部延長分子群，由這四個分子群共同構(gòu)成適配體步進型組合文庫。

1)向左收縮分子群的構(gòu)建

在初始序列39nt的基礎(chǔ)上，從其5’末端逐級剪裁掉相鄰的兩個堿基，得到如表1中所示的Left contraction 37、35、33、……、一直到Left contraction 21(分別簡稱L37、L35、L33、……、L21)等9條序列。

2)向右收縮分子群的構(gòu)建

向右收縮分子群則正好相反，在初始序列39nt的基礎(chǔ)上，從其3’末端逐級剪裁掉相鄰的兩個堿基，得到如表1中所示的Right contraction 37、35、33、……、一直到Right contraction 21(分別簡稱R37、R35、R33、……、R21)等9條序列。

3)兩端收縮分子群的構(gòu)建

兩端收縮分子群是在初始序列39nt的基礎(chǔ)上，從其5’和3’末端兩側(cè)分別逐級剪裁掉一個堿基，得到如表1中所示的Inner contraction 37、35、33、……、一直到Inner contraction21(分別簡稱In37、In35、In33、……、In21)等9條序列。

4)莖部延長分子群的構(gòu)建

莖部延長分子群則是在保持適配體環(huán)部序列不變的情況下，其莖部序列改為包含G和A的第一序列……包含C和T的第二序列互補堿基，其中第一序列分別為：GA、AGA、AGAGA、GAGAGA、AGAGAGA、GAGAGAGAGA、GAGAGAGAGAGA、AGAGAGAGAGAGAGA，第二序列分別為：TC、TCT、TCTCT、TCTCTC、TCTCTCT、TCTCTCTCTC、TCTCTCTCTCTC、TCTCTCTCTCTCTCT。得到如表1中所示的Stem-2bp、Stem-3bp、Stem-5bp、Stem-6bp、Stem-7bp、Stem-10bp、Stem-12bp、Stem-15bp(分別簡稱為S2bp、S3bp、S5bp、S6bp、S7bp、S10bp、S12bp、S15bp)等8條序列。

本實施例所構(gòu)建的適配體步進型組合文庫，僅用了35條序列，即涵蓋了能產(chǎn)生特異親和作用的大多數(shù)可能范圍。使用上述步進型組合文庫篩選適配體，可以確定特異性適配體中關(guān)鍵堿基的位點，從而得到親和活性更優(yōu)、特異性更強的優(yōu)化適配體序列。

上述適配體步進型組合文庫由上海生工生物工程公司合成。

表1步進型組合文庫的序列表

實施例2EPO-α的氨基酸殘基末端為氨基基團時，與生物素的共價偶聯(lián)

EPO-α的氨基酸殘基末端為氨基基團時，與生物素共價偶聯(lián)的反應(yīng)流程如圖3A所示。

稱取偶聯(lián)試劑(Sulfo-NHS-LC-Biotin，購自美國Thermo公司)0.35mg，252μL 5×PBS緩沖液，1008μL滅菌超純水，配制成1260μL的0.5mM Sulfo-NHS-LC-Biotin溶液，該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，并且避光操作。取15.5μL的EPO-α蛋白原液(3.25g/L，深圳賽保爾生物藥業(yè)公司贈送)，加入20μL 5×PBS和64.5μL滅菌超純水，配制成100μL的0.5g/L EPO-α溶液。向該100μL 0.5mg/mL的EPO-α溶液中，加入6.25μL的0.5mM Sulfo-NHS-LC-Biotin溶液，混勻后，于室溫振蕩溫育30min。溫育反應(yīng)完成后，進行純化，將反應(yīng)液加入到脫鹽小柱(如Zeba Spin脫鹽小柱，購自Thermo公司)中，除去剩余的未反應(yīng)分子。重復(fù)純化2次。

將純化后的溶液離心濃縮至50μL，并利用紫外可見分光光度法，以HABA/Avidin法表征，得到生物素的標(biāo)記個數(shù)為1，即得到了單分子生物素化的NH₂-Bio-EPO-α。用紫外可見分光光度法對該NH₂-Bio-EPO-α的濃度進行測定，濃度計算公式為：蛋白濃度(mg/mL)＝1.55A₂₈₀-0.76A₂₆₀)，計算得到的濃度為1.04g/L，回收率為103％。

實施例3EPO-α的氨基酸殘基末端羧基基團時，與生物素的共價偶聯(lián)

EPO-α的氨基酸殘基末端為羧基基團時，與生物素共價偶聯(lián)的反應(yīng)流程如圖3B所示。

稱取偶聯(lián)試劑(Biotin Hydrazide，購自美國Sigma Aldrich公司)0.34mg，229μL滅菌超純水，配制成4mM Biotin Hydrazide溶液，該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，并且避光操作。取4mM Biotin Hydrazide溶液50μL，加入100μL的0.5M 2-(N-嗎啡啉)-乙磺酸溶液(MES溶液，pH＝5.0)和350μL滅菌超純水，配制成0.4mM Biotin Hydrazide溶液，緩沖體系為0.1M MES(pH 5.2)。稱取碳二亞胺(EDC)5.57mg，加入1166μL滅菌超純水配制成25mM EDC溶液。取40μL的25mM EDC溶液，加入200μL的0.5M MES溶液(pH＝5.0)，760μL滅菌超純水配制成1mM EDC溶液，緩沖體系為0.1M MES(pH 5.2)。 取15.5μL的EPO-α蛋白原液(3.25g/L)，加入20μL的0.5M MES緩沖液和64.5μL滅菌超純水配制為100μL的0.5g/L EPO-α溶液。向該100μL 0.5g/L的EPO-α溶液中，加入7.5μL的0.4mM Biotin Hydrazide溶液和15μL的1mM EDC溶液混勻后，于室溫振蕩溫育2h。溫育反應(yīng)完成后，進行純化，將反應(yīng)液加入到脫鹽小柱(如Zeba Spin脫鹽小柱，購自Thermo公司)中，除去剩余的未反應(yīng)分子，并把反應(yīng)緩沖體系換成PBS緩沖液。重復(fù)純化2次，得到純化后的溶液。

將純化后的溶液離心濃縮至50μL，并利用紫外可見分光光度法，以HABA/Avidin法表征，得到生物素的標(biāo)記個數(shù)為1，即得到了單分子生物素化的COOH-Bio-EPO-α。用紫外可見分光光度法對該COOH-Bio-EPO-α的濃度進行測定，濃度計算公式同實施例1，計算得到的濃度為1.07g/L，回收率為109％。

實施例4EPO-α的糖基末端為唾液酸基團時，與生物素的共價偶聯(lián)

EPO-α的糖基末端為唾液酸基團時，與生物素共價偶聯(lián)的反應(yīng)流程如圖3C所示。

避光稱取8.96mg高碘酸鈉(NaIO₄)，加入873.8μL滅菌超純水，得到終濃度為50mM的NaIO₄儲備液，取4μL的50mM NaIO₄儲備液加入40μL的0.5M醋酸鈉(NaAc)溶液(pH＝5.5)，156μL滅菌超純水配制成1mM NaIO₄溶液，緩沖體系為0.1M NaAc(pH5.5)。取15.5μL的EPO-α蛋白原液(3.25g/L)，加入20μL 0.5M NaAc溶液和64.5μL滅菌超純水配制成100μL的0.5g/L EPO-α溶液。向該100μL的0.5g/L EPO-α溶液中，加入2.35μL的1mM NaIO₄溶液混勻，于4℃避光振蕩溫育30min。溫育反應(yīng)完成后，進行純化，將反應(yīng)液加入到脫鹽小柱(如Zeba Spin脫鹽小柱，購自Thermo公司)中，除去剩余的未反應(yīng)分子，并把反應(yīng)緩沖體系換成PBS緩沖液。重復(fù)純化2次，得到純化后的EPO-α反應(yīng)液。

避光稱取0.31mg偶聯(lián)試劑Biocytin Hydrazide，加入333.8μL的PBS緩沖液，得到終濃度為2.5mM的Biocytin Hydrazide溶液。向純化后的EPO-α反應(yīng)液中，加入4.7μL的2.5mM Biocytin Hydrazide溶液，混勻，于室溫下避光振蕩溫育2小時。溫育反應(yīng)完成后，進行純化，將反應(yīng)液加入到脫鹽小柱(如Zeba Spin脫鹽小柱，購自Thermo公司)中，除去剩余的未反應(yīng)分子。重復(fù)純化2次，得到純化后的溶液。

將純化后的溶液離心濃縮至50μL。并利用紫外可見分光光度法，以HABA/Avidin法表征，得到生物素的標(biāo)記個數(shù)為1，即得到了單分子生物素化的Sialyl-Bio-EPO-α。用紫外可見分光光度法對該Sialyl-Bio-EPO-α的濃度進行測定，濃度計算公式同實施例1，計算得到的濃度為1.38mg/mL，回收率為137％。

實施例5SA芯片上NH₂-Bio-EPO-α的固定

取2.7μL的NH₂-Bio-EPO-α儲備液(該儲備液用超純水配置，濃度為36.5μM)，加入20μL的5×Tris-HCl緩沖液和77.3μL純化水，即得到1μM的NH₂-Bio-EPO-α溶液。

取用一塊新的SA芯片，首先以50mM NaOH，1M NaCl溶液進行通道初始化。進樣3次，流速為20μL/min，每次進樣的時間為60秒。然后用70％甘油水溶液對SA芯片進行歸一化處理。

在流速為10μL/min的條件下進樣，進樣時間為60秒，將1μM的NH₂-Bio-EPO-α(制備方法見實施例2)固定于SA芯片的通道2上。進樣過程中，Bio-NH₂-EPO-α與SA芯片形成生物素-鏈霉親和素強非共價結(jié)合，RU值上升。進樣結(jié)束時，RU值上升至最大值。然后再以空白緩沖液沖洗SA芯片表面，除去附著的Bio-NH₂-EPO-α，RU值會略有下降。RU值變化曲線參見圖4中的(A)，上升后的最大RU值減去下降后的RU值，即得到響應(yīng)穩(wěn)定性(stability)RU值為2342，即，RU_stability＝2342。

以通道1為參比通道，使用500nM的39nt，對通道2上固定的Bio-NH₂-EPO-α蛋白的活性進行評價。進樣的流速為30μL/min，進樣時間為120秒。進樣后，39nt與Bio-NH₂-EPO-α蛋白形成非共價結(jié)合，RU值上升。進樣結(jié)束時，RU值上升至最大值。然后再以空白緩沖液沖洗SA芯片表面，非共價結(jié)合物解離，RU值下降。RU值變化曲線(即結(jié)合-解離曲線)參見圖4中的(B)，39nt與Bio-NH₂-EPO-α蛋白結(jié)合的過程中，RU最大值減去RU最小值即為相應(yīng)穩(wěn)定性ΔRU，2-1通道的響應(yīng)穩(wěn)定性ΔRU為30。說明該固定方式下，EPO-α和39nt間保留著親和活性。

再生條件為5mM NaOH，流速30μL/min，再生時間為15秒。

實施例6SA芯片上Sialyl-Bio-EPO-α的固定

取1.8μL的Sialyl-Bio-EPO-α儲備液(該儲備液用超純水配置，濃度為54.3μM)，加入20μL的5×Tris-HCl緩沖液和78.2μL純化水，即得到1μM Sialyl-Bio-EPO溶液。

取用一塊新的SA芯片，首先以50mM NaOH、1M NaCl溶液進行通道初始化。進樣3次，流速為20μL/min，每次進樣的時間為60秒。然后用70％甘油水溶液對芯片進行歸一化處理。

在流速為10μL/min的條件下進樣，進樣時間為60秒，將1μM的Sialyl-Bio-EPO-α(制備方法見實施例4)固定于SA芯片通道4上。RU值變化曲線參見圖4中的(C)，響應(yīng)穩(wěn)定性(stability)RU值上升了1159，即，RU_stability＝1159。

以通道3為參比通道，使用500nM的39nt，對通道4上固定的Sialyl-Bio-EPO-α蛋白的活性進行評價。進樣的流速為30μL/min，進樣時間為120秒。RU值變化曲線參見圖4中的(D)，4-3通道的響應(yīng)穩(wěn)定性ΔRU為50。說明該固定方式下，EPO-α和39nt間仍然保留著親和活性。

再生條件為5mM NaOH，流速30μL/min，再生時間為15秒。

實施例7 39nt的MCK分析

取2μL的100μM 39nt儲備液(該儲備液用超純水配置)，加入4μL的5×Tris-HCl 緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，以及12μL滅菌超純水，得到10μM的39nt溶液。取該39nt溶液20μL，加入380μL的Tris-T緩沖液，即得到500nM的39nt溶液。采用Tris-T緩沖液倍比稀釋的方法，制備得到濃度分別為25、50、100、200、400nM的39nt溶液，于95℃下變性5分鐘，再自然冷卻至室溫。

在SA芯片上，使用NH₂-Bio-EPO-α(通道2)和Sialyl-Bio-EPO-α(通道4)，進行EPO-α和39nt間的親和力和動力學(xué)分析。結(jié)合時間為120秒，解離時間為300秒，流速為30μL/min。再生條件為5mM NaOH，進樣時間為15秒，流速為30μL/min。包含以空白溶劑為零點在內(nèi)的39nt六個濃度的進樣順序為0、25nM、50nM、100nM、200nM、400nM，得到結(jié)合解離譜圖，如圖5A和圖5B所示，其中圖5A為通道2(固定NH₂-Bio-EPO-α)得到的結(jié)合解離譜圖，圖5B為通道4(固定Sialyl-Bio-EPO-α)得到的結(jié)合解離譜圖。

采用Biacore數(shù)據(jù)分析軟件對圖5A和圖5B所示的結(jié)合解離譜圖進行非線性擬合。結(jié)果表明，利用通道2-1數(shù)據(jù)得到39nt與EPO-α相互作用的解離常數(shù)K_D＝55nM，結(jié)合速率常數(shù)K_a＝1.6×10⁴M^-1s^-1，解離速率常數(shù)K_d＝8.9×10^-4s^-1(U-value＝1，Chi²＝0.13)。利用通道4-3數(shù)據(jù)得到39nt與EPO-α相互作用的解離常數(shù)K_D＝52nM，結(jié)合速率常數(shù)K_a＝1.8×10⁴M^-1s^-1，解離速率常數(shù)K_d＝9.3×10^-4s^-1(U-value＝1，Chi²＝0.07)。上述結(jié)果表明以NH₂-Bio-EPO-α和Sialyl-Bio-EPO-α為固定方式時，兩者符合度較好，也說明了SPR方法已經(jīng)成功建立。

較之Sialyl-Bio-EPO-α，NH₂-Bio-EPO-α對5mM NaOH為再生條件的耐受性更高。

實施例8向左收縮適配體分子群在SA芯片上的單點活性評價及活性序列的MCK分析

待評價的適配體序列為：向左收縮適配體分子群中的所有序列，包括L21、L23、L25、L27、L29、L31、L33、L35、L37，以及參比序列39nt，共10條序列。分別量取2μL上述10條序列的儲備液(該儲備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲備液。取20μL的各序列中間儲備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的向左收縮適配體分子群中的各序列以及參比序列39nt作為分析物，采用單點篩選法進行SPR動力學(xué)分析。具體實驗條件同實施例7。進樣后，待分析物與SA芯片上的EPO-α結(jié)合，生成復(fù)合物，進樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，各序列單點RU值變化曲線圖如圖6所示。

結(jié)果表明，僅有能夠形成高級結(jié)構(gòu)G-四聚體(以下簡稱GQ)結(jié)構(gòu)的L37、L35、L33存在親和識別能力，并且隨著莖部結(jié)構(gòu)的縮短，響應(yīng)值也逐漸下降。

針對L37、L35、L33這三條活性序列，分別選取濃度為31.25-1000nM(L37)；62.5-2000 nM(L35)；62.5-2000nM(L33)，進行MCK分析。具體SPR條件同實施例7。得到親和力和動力學(xué)參數(shù)，如表2所示。結(jié)果表明，其K_D值分別為320±30nM、360±110nM和390±30nM，呈現(xiàn)從低到高逐漸增加的特征。

表2向左收縮適配體分子群的親和力和動力學(xué)參數(shù)

實例9向右收縮適配體分子群在SA芯片上的單點活性評價及活性序列的MCK分析

待評價的適配體序列為：向右收縮適配體分子群中的所有序列，包括R21、R23、R25、R27、R29、R31、R33、R35、R37，以及參比序列39nt，共10條序列。分別量取2μL上述10條序列的儲備液(該儲備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲備液。取20μL的各序列中間儲備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的向右收縮適配體分子群中的各序列以及參比序列39nt為分析物，采用單點篩選法進行SPR動力學(xué)分析。具體實驗條件同實施例7。進樣后，待分析物與SA芯片上的EPO-α結(jié)合，生成復(fù)合物，進樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，各序列單點RU值變化曲線圖如圖7所示。

結(jié)果表明，只有能夠形成高級結(jié)構(gòu)GQ的R37、R35、R33、R31具有親和活性，特別地，該分子群中，7A8A位點的堿基是否充分暴露對響應(yīng)值有較大的影響。7A8A位點的的堿基完全暴露(R33)較之被掩蔽(R35、R37)時，適配體的活性基本恢復(fù)。而7A8A位點的堿基去除前(R33)和去除后(R31)，響應(yīng)值基本相同。

針對R37、R35、R33、R31這三條活性序列，分別選取濃度為31.25-1000nM(R37)；125-4000nM(R35)；31.25-1000nM(R33)；31.25-1000nM(R31)，進行MCK分析。具體SPR條件同實施例7。得到親和力和動力學(xué)參數(shù)，如表3所示。結(jié)果表明，其K_D值分別為560±170nM、1300±150nM、140±40nM和130±30nM，呈現(xiàn)從高到低逐漸降低的特征。

表3向右收縮適配體分子群的親和力和動力學(xué)參數(shù)

實施例10兩端延展適配體分子群在SA芯片上的單點活性評價及活性序列的MCK分析

待評價的適配體序列為：兩端延展適配體分子群中的所有序列，包括Stem-2bp、Stem-3bp、Stem-5bp、Stem-6bp、Stem-7bp、Stem-10bp、Stem-12bp、Stem-15bp，以及參比序列39nt，共10條序列。分別量取2μL上述10條序列的儲備液(儲備液的濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列儲備液。取20μL的各序列儲備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的兩端延展適配體分子群中的各序列以及參比序列39nt為分析物，采用單點篩選法進行SPR動力學(xué)分析。具體實驗條件同實施例7。進樣后，待分析物與SA芯片上的EPO-α結(jié)合，生成復(fù)合物，進樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，各序列單點RU值變化曲線圖如圖8所示。

結(jié)果表明，從Stem-2bp到Stem-7bp，隨著莖部的延長，響應(yīng)值逐漸升高。而從Stem-7bp一直到Stem-15bp，響應(yīng)值則逐漸下降。除Stem-5bp外，其它序列的響應(yīng)值均高于陽性序列39nt。而親和活性的最大增強出現(xiàn)于Stem-7bp。

針對兩端延展適配體分子群中的所有序列，分別選取濃度為31.25-1000nM(2bp)、125-4000nM(3bp)、31.25-500nM(5bp)、31.25-500nM(6bp)、31.25-500nM(7bp)、31.25-500nM(10bp)、31.25-500nM(12bp)、31.25-500nM(15bp)，進行MCK分析。具體SPR條件同實施例7。得到親和力和動力學(xué)參數(shù)，如表4所示。結(jié)果表明，K_D值從Stem-2bp一直到Stem-7bp逐漸降低，然從Stem-7bp到Stem-15bp，其K_D值基本趨平。親和活性最高的為Stem-7bp。同時，Stem-7bp、Stem-6bp的親和活性均優(yōu)于39nt。

表4兩端延展適配體分子群的親和力和動力學(xué)參數(shù)

實施例11兩端收縮適配體分子群在SA芯片上的單點活性評價及活性序列的MCK分析

待評價的適配體序列為：兩端收縮適配體分子群中的所有序列，包括In21、In23、In25、In27、In29、In31、In33、In35、In37，以及參比序列39nt，共10條序列。分別量取2μL上述10條序列的儲備液(該儲備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中 間儲備液。取20μL的各序列中間儲備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的兩端收縮適配體分子群中的各序列以及參比序列39nt為分析物，采用單點篩選法進行SPR動力學(xué)分析。具體實驗條件同實施例7。進樣后，待分析物與SA芯片上的EPO-α結(jié)合，生成復(fù)合物，進樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，各序列單點RU值變化曲線圖如圖9所示。

實驗結(jié)果表明，隨著莖部的縮短，響應(yīng)值逐漸降低，而保留了整個環(huán)部的In27親和力完全恢復(fù)，提示可能形成了新的高級結(jié)構(gòu)。

針對In37、In35、In33、In31、In29、In27、In25這七條活性序列，分別選取濃度為31.25-1000nM(In37、In31)、125-4000nM(In35、In33、In25)、62.5-2000nM(In29)、12.5-400nM(In27)，進行MCK分析。具體SPR條件同實施例7。得到親和力和動力學(xué)參數(shù)，如表5所示。結(jié)果表明，K_D值從In37到In33逐漸升高，然后又逐漸降低，In27的K_D值降低最為明顯，而后In25的K_D值又急劇升高，In 27是所有剪裁序列中親和活性最高的序列。

表5兩端收縮適配體分子群的親和力和動力學(xué)參數(shù)

實施例12采用圓二色譜測定In27可能形成的高級結(jié)構(gòu)

分別取0.6OD(0.6OD相當(dāng)于0.6*33μg＝19.8μg)的In27凍干粉溶解于含有不同濃度K⁺的三種Tris-HCl(20mM Tris，140mM NaCl，5mM MgCl₂，以HCl調(diào)至pH 7.4-7.6)緩沖液中，其中KCl分別為0、5、100mM。設(shè)定溫度為25℃，進行圓二色譜測定，得到如圖10所示的圓二色譜圖。所用儀器為MOS-450多功能圓二色光譜儀，法國BioLogic Science Instruments公司，比色池光程1cm。

從圖10所示的圓二色譜圖可以看出，在不同濃度K⁺的Tris-HCl緩沖液中，In27均在260nm處形成了負峰，在290nm處形成了正峰，符合反平行G-四聚體(GQ)的高級構(gòu)象特征。說明In27在Tris-HCl緩沖液中形成了反平行G四聚體結(jié)構(gòu)。K⁺具有誘導(dǎo)促進G-四聚體高級結(jié)構(gòu)形成的作用，但該圓二色譜圖中可以看出，K⁺的濃度為0和5mM時，所形成的譜圖幾乎重合，說明In27自身便可形成G-四聚體，且該高級結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，K⁺存在與否對In27的高級結(jié)構(gòu)影響不顯著。

實施例13構(gòu)建In27的定點突變適配體分子群

針對最短適配體In27，構(gòu)建其定點突變分子群，以明確In27與EPO-α特異性結(jié)合時，具體堿基位點的貢獻。

In27的二級序列特征為：僅保留了39nt的環(huán)部序列，其一級結(jié)構(gòu)序列特征為，--GG---------GGGG--GG--GGG；結(jié)合其圓二色譜結(jié)果，推測In27可能形成了以GQ為骨架的三級結(jié)構(gòu)。

除In27上的GG骨架外，其它序列按-GG(G)-為間隔，劃分為D1～5個結(jié)構(gòu)域(Domain)，進行定點突變。如圖2所示，構(gòu)建了各定點突變分子群，共6組，分別命名為GQ、D1、D2、D3&4、D5和簡并序列定點突變分子群，共31條序列。突變遵循的大原則是：基于經(jīng)驗的試錯法，其目的在于找到簡并序列，使該優(yōu)化適配體能夠有更廣泛的適用性。考慮到G-C配對，不引入C堿基；考慮到G四聚體高級結(jié)構(gòu)的連接子一般為Tn或T+A等有序結(jié)構(gòu)，將非T堿基換為T；對于有序結(jié)構(gòu)如從第9位T開始的T5G4T2G2T3G3(此處“T5G4T2G2T3G3”是指連續(xù)的5個T、4個G等等)，僅采取連續(xù)T截短、T突變?yōu)锳等處理；對于前8位中的非G堿基，基本上采用窮舉法。

如表6中所示，

D1定點突變適配體分子群包括：1A堿基改為C/T/G/X、2A堿基改為T/G、以及1A2A堿基同時改為T堿基等7條序列；

D2定點突變適配體分子群包括：6C堿基改為T/A/G/X、8G堿基改為T堿基、6C8G同時改為T堿基、11T堿基改為X，以及10T11T堿基同時改為X等8條序列；

D3&4定點突變適配體分子群包括：18T堿基改為A堿基、以及23T堿基改為A堿基等2條序列；

D5定點突變適配體分子群包括：27G堿基改為A/T/X等3條序列；

GQ定點突變適配體分子群包括：25G改為T/X(X代表無)，即25T、25X；在6位的C改為T的前提下，14G、15G、16G、17G中的G堿基分別改為T堿基，即為14T、15T、16T、17T，以及14G15G、15G16G、16G17G、14G17G中的兩個G堿基均改為T堿基，即14T15T、15T16T、16T17T、14T17T等10條序列；

簡并序列適配體分子群包括1A6C堿基同時改為T堿基，即1T6T；1A6C27G堿基分別改為1T6T27A堿基；以及1A27G堿基改為1T27A堿基等3條序列。

上述適配體步進型組合文庫由上海生工生物工程公司合成。

表6In27的定點突變適配體分子群

注：表6中，“～”表示該位置的堿基缺失。

實施例14GQ定點突變分子群在SA芯片上的單點活性評價

GQ定點突變適配體分子群中的所有序列，包括如SEQ ID NO.57～SEQ ID NO.66所示的In27-6T14T、In27-6T15T、In27-6T16T、In27-6T17T、In27-6T1415TT、In27-6T1516TT、In27-6T1617TT、In27-6T1417T、In27-6T25X、In27-6T25T，以及參比序列In27(如SEQ ID NO.33所示)，共11條序列，分別量取2μL上述11條序列的儲備液(該儲備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲備液。取20μL的各序列中間儲備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自 然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的GQ定點突變適配體分子群中的各序列以及參比序列In27為分析物，采用單點篩選法進行SPR動力學(xué)分析。具體實驗條件同實施例7。進樣后，待分析物與SA芯片上的EPO-α結(jié)合，生成復(fù)合物，進樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，各序列單點RU值變化曲線如圖11A和圖11B所示。

結(jié)果表明，與In27相比，對14到17位上的G堿基進行突變，其響應(yīng)值都大大降低，說明在第三對GG骨架的形成可能具有一定的流動性。而In27-25X和In27-25T活性也基本喪失，說明25G可能參與了第四對GG骨架形成。

實施例15D1定點突變適配體分子群在SA芯片上的單點活性評價

D1定點突變適配體分子群中的所有序列，包括如SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.43所示的In27-1X、In27-1T、In27-1G、In27-1C、In27-2G、In27-2T、In27-1T2T，以及參比序列In27、39nt，共9條序列，分別量取2μL上述9條序列的儲備液(該儲備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲備液。取20μL的各序列中間儲備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的D1定點突變適配體分子群中的各序列以及參比序列In27、39nt為分析物，采用單點篩選法進行SPR動力學(xué)分析。具體實驗條件同實施例7。各序列單點RU值變化曲線如圖12所示。

結(jié)果表明，與In27相比，In27-1T的響應(yīng)值略有升高，In27-1G與In27的響應(yīng)值基本持平，In27-1C的響應(yīng)值與39nt基本持平。而In27-2G、In27-2T和In27-1T2T的響應(yīng)值下降明顯。說明在D1結(jié)構(gòu)域中1A能改為其它三種堿基而不影響活性，而2A堿基具有特異性。

實施例16D2定點突變適配體分子群在SA芯片上的單點活性評價

D2定點突變適配體分子群中的所有序列，包括如SEQ ID NO.44～SEQ ID NO.51所示的In27-6X、In27-6T、In27-6A、In27-6G、In27-8T、In27-6T8T、In27-11X、In27-10X11X，以及參比序列In27，共9條序列，分別量取2μL上述9條序列的儲備液(100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲備液。取20μL的各序列中間儲備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的D2定點突變適配體分子群中各序列以及參比序列In27為分析物，采用單點篩選法進行SPR動力學(xué)分析。具體實 驗條件同實施例7。各序列單點RU值變化曲線如圖13所示。

結(jié)果表明，與In27相比，In27-6T(RU 60)的親和活性略高，而In27-6A(RU 30)和In27-6G(RU 29)的響應(yīng)值有所下降。In27-6X(RU 15)、In27-11X(RU 3)和In27-10X11X(RU 5)的響應(yīng)值下降明顯，且與其它序列的動力學(xué)特征不同，這三條序列結(jié)合和解離的速率都非常迅速。從而說明D2結(jié)構(gòu)域是重要的識別位點，其11個堿基形成的結(jié)構(gòu)保證了識別活性的發(fā)揮。

實施例17D3&D4定點突變適配體分子群在SA芯片上的單點活性評價

D3&D4定點突變適配體分子群中的所有序列，包括如SEQ ID NO.52～SEQ ID NO.53所示的In27-18A、In27-23A，以及參比序列In27，共3條序列，分別量取2μL上述3條序列的儲備液(該儲備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲備液。取20μL的各序列中間儲備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的D3&D4定點突變適配體分子群中的各序列以及參比序列In27為分析物，采用單點篩選法進行SPR動力學(xué)分析。具體實驗條件同實施例7。各序列單點RU值變化曲線如圖14所示。

結(jié)果表明，與In27相比，In27-18A(RU 8)以及In27-23A(RU 8)的響應(yīng)值下降明顯。說明D3和D4結(jié)構(gòu)域在識別過程中發(fā)揮著一定的作用。

實施例18D5定點突變適配體活性簇分子群在SA芯片上的單點活性評價

D5定點突變適配體分子群中的所有序列，包括如SEQ ID NO.54～SEQ ID NO.56所示的In27-27X、In27-27A、In27-27T，以及參比序列In27，共4條序列，分別量取2μL上述4條序列的儲備液(該儲備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲備液。取20μL的各序列中間儲備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的D5定點突變適配體分子群中的各序列以及參比序列In27為分析物，采用單點篩選法進行SPR動力學(xué)分析。具體實驗條件同實施例7。各序列單點RU值變化曲線如圖15所示。

結(jié)果表明，與In27相比，In27-27X(RU 6)、In27-27T(RU 5)和In27-27A(RU 3)的響應(yīng)值下降明顯。說明27G堿基具有特異性。

實施例19簡并序列適配體分子群在SA芯片上的單點活性評價

簡并序列適配體分子群中的所有序列，包括如SEQ ID NO.67～SEQ ID NO.69所示的In27-1T6T、In27-1T27A、In27-1T6T27A，以及參比序列In27，共4條序列，分別量取2μL上述4條序列的儲備液(該儲備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲備液。取20μL的各序列中間儲備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的簡并序列適配體分子群中的各序列以及參比序列In27為分析物，采用單點篩選法進行SPR動力學(xué)分析。具體實驗條件同實施例7。各序列單點RU值變化曲線如圖16所示。

結(jié)果表明，與In27相比，1T6T的響應(yīng)值明顯升高，同時1T6T的響應(yīng)值介于1T和6T之間。1T27A和1T27A6T響應(yīng)值下降明顯，再次說明27位堿基(G)在識別過程中發(fā)揮了重要的作用，而與兩端1T27A的配對無關(guān)。

實施例20以In27為識別元件，與EPO-α進行親和識別檢測

取2μL的3’-dT₁₂-Biotin-In27(由上海生工生物工程有限公司合成，在In27的3’端修飾上一個Biotin分子)儲備液(該儲備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入5×Tris-HCl緩沖液8μL，4μL的1wt％Tween 20，26μL滅菌超純水，得到5μM的3’-dT₁₂-Biotin-In27中間儲備液。取4μL的中間儲備液(5μM)，加入396μL的Tris-T緩沖液，得到50nM的固定溶液，于95℃下變性5min，4℃放置。

依上述方法，配置400μL的50nM的3’-Biotin-39nt(由上海生工生物工程有限公司合成，在39nt的3’端修飾上一個Biotin分子)的固定溶液。

取用一塊新的SA芯片，固定前處理同實施例5。將50nM的3’-Biotin-39nt固定溶液，在流速10μL/min，進樣時間300秒的條件下，固定于SA芯片通道2上，此時響應(yīng)穩(wěn)定性(stability)RU值上升了1550。將50nM的3’-dT₁₂-Biotin-In27固定溶液，在流速10μL/min，進樣時間300秒的條件下，固定于SA芯片通道4上，此時響應(yīng)穩(wěn)定性(stability)RU值上升了1800。

在SA芯片上，使用3’-Biotin-39nt(通道2)和3’-dT₁₂-Biotin-In27(通道4)，進行EPO-α和39nt及In27間的親和力和動力學(xué)分析。結(jié)合時間為120秒，解離時間為300秒，流速為30μL/min。再生條件為5mM NaOH，進樣時間15秒，流速為30μL/min。包含以空白溶劑為零點在內(nèi)的EPO-α六個濃度的進樣順序為0、0、6.25、12.5、25、50、100、200nM，得到結(jié)合解離譜圖，如圖17A和圖17B所示。

非線性擬合結(jié)果表明，39nt與EPO-α相互作用的解離常數(shù)K_D＝55nM，結(jié)合速率常數(shù)K_a＝2.7×10⁴M^-1s^-1，解離速率常數(shù)K_d＝1.4×10^-4s^-1(U-value＝1，Chi²＝0.23)；In27與EPO-α相互作用的解離常數(shù)K_D＝78nM，結(jié)合速率常數(shù)K_a＝2.2×10⁴M^-1s^-1，解離速率常數(shù)K_d＝1.7×10^-4s^-1(U-value＝1，Chi²＝0.06)。說明In 27作為識別元件，很好地實現(xiàn)了對EPO-α蛋白的親和識別與檢測。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所

<120> 一種適配體組合文庫、其構(gòu)建方法及用途

<130> IDC160136

<160> 69

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 1

gattgaaagg tctgtttttg gggttggttt gggtcaata 39

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 2

gaaaggtctg tttttggggt tggtttgggt c 31

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 3

agaaaggtct gtttttgggg ttggtttggg tct 33

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 4

agagaaaggt ctgtttttgg ggttggtttg ggtctct 37

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 5

gagagaaagg tctgtttttg gggttggttt gggtctctc 39

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 6

agagagaaag gtctgttttt ggggttggtt tgggtctctc t 41

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 7

gagagagaga aaggtctgtt tttggggttg gtttgggtct ctctctc 47

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 8

gagagagaga gaaaggtctg tttttggggt tggtttgggt ctctctctct c 51

<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 9

agagagagag agagaaaggt ctgtttttgg ggttggtttg ggtctctctc tctctct 57

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 10

gattgaaagg tctgtttttg gggttggttt gggtcaa 37

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 11

gattgaaagg tctgtttttg gggttggttt gggtc 35

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 12

gattgaaagg tctgtttttg gggttggttt ggg 33

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 13

gattgaaagg tctgtttttg gggttggttt g 31

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 14

gattgaaagg tctgtttttg gggttggtt 29

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 15

gattgaaagg tctgtttttg gggttgg 27

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 16

gattgaaagg tctgtttttg gggtt 25

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 17

gattgaaagg tctgtttttg ggg 23

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 18

gattgaaagg tctgtttttg g 21

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 19

ttgaaaggtc tgtttttggg gttggtttgg gtcaata 37

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 20

gaaaggtctg tttttggggt tggtttgggt caata 35

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 21

aaggtctgtt tttggggttg gtttgggtca ata 33

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 22

ggtctgtttt tggggttggt ttgggtcaat a 31

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 23

tctgtttttg gggttggttt gggtcaata 29

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 24

tgtttttggg gttggtttgg gtcaata 27

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 25

tttttggggt tggtttgggt caata 25

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 26

tttggggttg gtttgggtca ata 23

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 27

tggggttggt ttgggtcaat a 21

<210> 28

<211> 37

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 28

attgaaaggt ctgtttttgg ggttggtttg ggtcaat 37

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 29

ttgaaaggtc tgtttttggg gttggtttgg gtcaa 35

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 30

tgaaaggtct gtttttgggg ttggtttggg tca 33

<210> 31

<211> 31

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 31

gaaaggtctg tttttggggt tggtttgggt c 31

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 32

aaaggtctgt ttttggggtt ggtttgggt 29

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 33

aaggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 34

aggtctgttt ttggggttgg tttgg 25

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 35

ggtctgtttt tggggttggt ttg 23

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 36

gtctgttttt ggggttggtt t 21

<210> 37

<211> 26

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 37

aggtctgttt ttggggttgg tttggg 26

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 38

taggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 39

gaggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 40

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 40

caggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 41

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 41

agggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 42

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 42

atggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 43

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 43

ttggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 44

<211> 26

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 44

aaggttgttt ttggggttgg tttggg 26

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 45

aaggtttgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 46

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 46

aaggtatgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 47

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 47

aaggtgtgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 48

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 48

aaggtctttt tttggggttg gtttggg 27

<210> 49

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 49

aaggtttttt tttggggttg gtttggg 27

<210> 50

<211> 26

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 50

aaggtctgtt ttggggttgg tttggg 26

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 51

aaggtctgtt tggggttggt ttggg 25

<210> 52

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 52

aaggtctgtt tttggggatg gtttggg 27

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 53

aaggtctgtt tttggggttg gtatggg 27

<210> 54

<211> 26

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 54

aaggtctgtt tttggggttg gtttgg 26

<210> 55

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 55

aaggtctgtt tttggggttg gtttgga 27

<210> 56

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 56

aaggtctgtt tttggggttg gtttggt 27

<210> 57

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 57

aaggtttgtt ttttgggttg gtttggg 27

<210> 58

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 58

aaggtttgtt tttgtggttg gtttggg 27

<210> 59

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 59

aaggtttgtt tttggtgttg gtttggg 27

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 60

aaggtttgtt tttgggtttg gtttggg 27

<210> 61

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 61

aaggtttgtt tttttggttg gtttggg 27

<210> 62

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 62

aaggtttgtt tttgttgttg gtttggg 27

<210> 63

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 63

aaggtttgtt tttggttttg gtttggg 27

<210> 64

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 64

aaggtttgtt ttttggtttg gtttggg 27

<210> 65

<211> 26

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 65

aaggtttgtt tttggggttg gtttgg 26

<210> 66

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 66

aaggtttgtt tttggggttg gttttgg 27

<210> 67

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 67

taggtttgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 68

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 68

taggtctgtt tttggggttg gtttgga 27

<210> 69

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 69

taggtttgtt tttggggttg gtttgga 27