本發(fā)明屬于胚胎冷凍保存領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及CathepsinL抑制劑在胚胎冷凍保存中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在胚胎移植、體外受精、轉(zhuǎn)基因和克隆等胚胎生物技術(shù)中，往往會(huì)涉及到胚胎的冷凍保存，而如何能更好地冷凍胚胎，使得胚胎在解凍之后能夠依然能夠正常發(fā)育，一直以來備受關(guān)注。在當(dāng)前的胚胎冷凍方法中經(jīng)常采用抗凍保護(hù)劑。在冷凍液中添加抗凍保護(hù)劑是為了防止細(xì)胞冷凍損傷。抗凍保護(hù)劑多為滲透性小分子物質(zhì)，主要通過滲入細(xì)胞內(nèi)部，發(fā)生水合作用，使細(xì)胞內(nèi)溶液的黏性增加，從而保護(hù)細(xì)胞不受冷凍損傷。不同的抗凍保護(hù)劑由于其種類、濃度、分子大小、滲透能力、水活性及胞內(nèi)作用機(jī)理等各不相同，對(duì)細(xì)胞冷凍保存效果亦有差異。隨著抗凍液濃度的增加,滲入細(xì)胞內(nèi)的抗凍保護(hù)劑會(huì)隨之增多。通常，抗凍液本身具有毒性，濃度太高會(huì)在降溫前殺死細(xì)胞，而濃度過低又起不到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。同時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)也有數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過冷凍的胚胎在移植時(shí)比鮮胚的產(chǎn)子率下降很多。這也說明冷凍或者冷凍保護(hù)劑的外在處理會(huì)使胚胎的后期發(fā)育受到或多或少的影響。因此，本領(lǐng)域亟需一種新的胚胎冷凍方案，其能夠提高胚胎的抗凍性以及解凍復(fù)蘇率。另外地或可能地，該胚胎冷凍方案還可以降低抗凍保護(hù)劑的使用量，從而減少其對(duì)胚胎的毒副作用，實(shí)現(xiàn)有效的胚胎冷凍。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種新的胚胎冷凍方案，其能夠提高胚胎的抗凍性以及解凍復(fù)蘇率。另外地或可能地，該胚胎冷凍方案還可以降低抗凍保護(hù)劑的使用量，從而減少其對(duì)胚胎的毒副作用，實(shí)現(xiàn)有效的胚胎冷凍。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，先將胚胎在含CathepsinL抑制劑例如E-64d的體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間，然后再對(duì)其進(jìn)行冷凍，例如程序化冷凍，可以顯著地提高胚胎的抗凍性和解凍復(fù)蘇率?；诖税l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人得到了如下發(fā)明：第一方面，本發(fā)明提供了一種體外胚胎培養(yǎng)液，所述體外胚胎培養(yǎng)液包含CathepsinL抑制劑。第二方面，本發(fā)明提供了一種提高胚胎抗凍性和解凍復(fù)蘇率的方法，包括在冷凍胚胎之前用根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的體外胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)胚胎，優(yōu)選地培養(yǎng)1-4小時(shí)，最優(yōu)選培養(yǎng)2小時(shí)。第三方面，本發(fā)明提供了一種冷凍胚胎的方法，包括以下步驟：a)用根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的體外胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)胚胎，優(yōu)選地培養(yǎng)1-4小時(shí)，最優(yōu)選地培養(yǎng)2小時(shí)；b)將步驟a)中經(jīng)培養(yǎng)的胚胎進(jìn)行冷凍，優(yōu)選地進(jìn)行程序化冷凍。本發(fā)明人首次將CathepsinL抑制劑應(yīng)用于胚胎冷凍領(lǐng)域，并且意外地發(fā)現(xiàn)，通過在體外胚胎培養(yǎng)基中添加CathepsinL抑制劑，并將待冷凍胚胎在該添加有CathepsinL抑制劑的體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間，可以顯著地提高胚胎的抗凍性和解凍復(fù)蘇率。另外地或可能地，通過所述培養(yǎng)程序，可以減少在冷凍液中使用的抗凍保護(hù)劑的量，從而減少其對(duì)胚胎的毒副作用。具體實(shí)施方式下面對(duì)本發(fā)明的具體技術(shù)方案作進(jìn)一步清楚和完整的描述。需要理解的是，本文中具體描述的技術(shù)方案僅用于示例目的，無意于以任何方式對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍進(jìn)行限制。在不背離本發(fā)明的精神和宗旨的情況下，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改。本發(fā)明的保護(hù)范圍由隨附的權(quán)利要求書來進(jìn)行限定。如上文所述，本發(fā)明的目的在于提供一種新的胚胎冷凍方案，其能夠提高胚胎的抗凍性以及解凍復(fù)蘇率；另外地或者可能地，還可以降低抗凍保護(hù)劑的使用量，從而減少其對(duì)胚胎的毒副作用，實(shí)現(xiàn)有效的胚胎冷凍。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，通過將胚胎在添加有CathepsinL抑制劑的體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間，然后再對(duì)其進(jìn)行冷凍，例如程序化冷凍，胚胎的抗凍性和解凍復(fù)蘇率得到了顯著提高?；诖税l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人得到了如下發(fā)明：第一方面，本發(fā)明提供了一種體外胚胎培養(yǎng)液，所述體外胚胎培養(yǎng)液包含CathepsinL抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述CathepsinL抑制劑為E-64d、E-64或Z-Phe-Phe-FMK。E-64d是一種CathepsinL特異性抑制劑，也叫阿洛司他丁(Aloxistatin)，化學(xué)名為(2S,3S)-3-[[(2S)-4-甲基-1-(3-甲基丁基氨基)-1-氧代戊-2-基]氨基甲酰]環(huán)氧乙烷-2-羧酸乙酯(Ethyl(2S,3S)-3-[[(2S)-4-methyl-1-(3-methylbutylamino)-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]oxirane-2-carboxylate)，其分子量為342.43，分子式為C17H30N2O5，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：E-64是一種不可逆的選擇性組織蛋白酶L抑制劑，其化學(xué)名稱為(2R,3R)-3-[[(2S)-1-[4-(二氨基亞甲基氨基)丁基氨基]-4-甲基-1-氧代戊-2-基]氨基甲酰]環(huán)氧乙烷-2-羧酸((2R,3R)-3-[[(2S)-1-[4-(Diaminomethylideneamino)butylamino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]oxirane-2-carboxylicacid)，分子量為357.41，分子式為C15H27N5O5，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：Z-Phe-Phe-FMK是一種不可逆的滲透性組織蛋白酶L抑制劑，其分子量為462.50，分子式為C27H27FN2O4，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述CathepsinL抑制劑為E-64d。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，E-64d的濃度為0.5-3μmol/L，例如為0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0μmol/L，或由這些數(shù)字組成的任一濃度區(qū)間，例如0.5-2μmol/L或1.0-1.5μmol/L，但優(yōu)選為1.0μmol/L。除了上述的CathepsinL抑制劑之外，所述體外胚胎培養(yǎng)液還包含選自CZB培養(yǎng)基、MTF培養(yǎng)基、KSOM培養(yǎng)基、CR1培養(yǎng)基和CR2培養(yǎng)基中的任何一種培養(yǎng)基。CZB培養(yǎng)基是一種可以使多種品系的小鼠受精后胚胎發(fā)育至囊胚期的培養(yǎng)基，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于胚胎操作和各種小鼠克隆實(shí)驗(yàn)中。MTF培養(yǎng)基是一種以Krebs-Ring碳酸鹽溶液為基礎(chǔ)的著床前胚胎培養(yǎng)基，其成分相當(dāng)簡(jiǎn)單，主要包括提供能量的丙酮酸鈉、乳酸鈉和葡萄糖，并且還包括血清白蛋白。KSOM培養(yǎng)基是一種主要用于培養(yǎng)體外授精(IVF)的小鼠胚胎以及去核和電融合后重構(gòu)的B6C3F1小鼠卵子的培養(yǎng)基。CR1培養(yǎng)基和CR2培養(yǎng)基是用于豬、牛、羊等物種后期胚胎的培養(yǎng)基，根據(jù)胚胎所處具體階段不同，具體配方略有調(diào)整。在冷凍胚胎前，將胚胎在本發(fā)明第一方面的包含CathepsinL抑制劑的體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間，可以顯著地提高胚胎的抗凍性和解凍復(fù)蘇率，該解凍復(fù)蘇率可以提高例如高達(dá)10％。第二方面，本發(fā)明提供了一種提高胚胎抗凍性和解凍復(fù)蘇率的方法，包括在冷凍胚胎之前用本發(fā)明第一方面的體外胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)所述胚胎。所述培養(yǎng)可以在37℃、5％CO2和100％濕度條件下進(jìn)行，并且可以持續(xù)適當(dāng)長的一段時(shí)間，例如持續(xù)1-4小時(shí)，如1、2、3或4小時(shí)，優(yōu)選地持續(xù)2小時(shí)。所述胚胎可以是任何物種來源的胚胎。例如，所述胚胎可以是來源于哺乳動(dòng)物例如小鼠、大鼠、豬、牛、羊、或者靈長類動(dòng)物例如人的胚胎。所述胚胎可以是處于任何適合冷凍時(shí)期的胚胎。例如，所述胚胎可以是處于4-細(xì)胞期至囊胚期的胚胎。所述胚胎可以是通過任何方式例如體內(nèi)法或體外法獲得的胚胎。對(duì)于通過體內(nèi)法獲得的胚胎，可以示例的是，在非人哺乳動(dòng)物本交或人工輸精后在母體中發(fā)育到例如4-細(xì)胞期至囊胚期時(shí)通過手術(shù)或非手術(shù)法從該母體中獲取的已受精胚胎。所述非人哺乳動(dòng)物可以為例如小鼠、大鼠、豬、牛、羊或者不包括人在內(nèi)的靈長類動(dòng)物。對(duì)于通過體外法獲得的胚胎，可以示例的是，對(duì)成熟卵母細(xì)胞采取體外授精方式例如孤雌激活或單精子注射等方式獲得的受精胚胎。所述成熟卵母細(xì)胞可以來源于任何物種，例如哺乳動(dòng)物如小鼠、大鼠、豬、牛、羊、或者靈長類動(dòng)物如人。第三方面，本發(fā)明提供了一種冷凍胚胎的方法，包括以下步驟：用本發(fā)明第一方面的體外胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)胚胎；并將該經(jīng)培養(yǎng)的胚胎進(jìn)行冷凍。所述培養(yǎng)可以在37℃、5％CO2和100％濕度條件下進(jìn)行，并且可以持續(xù)適當(dāng)長的一段時(shí)間，例如持續(xù)1-4小時(shí)，如1、2、3或4小時(shí)，優(yōu)選地持續(xù)2小時(shí)。所述胚胎可以是任何物種來源的胚胎。例如，所述胚胎可以是來源于哺乳動(dòng)物例如小鼠、大鼠、豬、牛、羊、或者靈長類動(dòng)物例如人的胚胎。所述胚胎可以是處于任何適合冷凍時(shí)期的胚胎。例如，所述胚胎可以是處于4-細(xì)胞期至囊胚期的胚胎。所述胚胎可以是通過任何方式例如體內(nèi)法或體外法獲得的胚胎。對(duì)于通過體內(nèi)法獲得的胚胎，可以示例的是，在非人哺乳動(dòng)物本交或人工輸精后在母體中發(fā)育到例如4-細(xì)胞期至囊胚期時(shí)通過手術(shù)或非手術(shù)法從該母體中獲取的已受精胚胎。所述非人哺乳動(dòng)物可以為，例如，小鼠、大鼠、豬、牛、羊或者不包括人在內(nèi)的靈長類動(dòng)物。對(duì)于通過體外法獲得的胚胎，可以示例的是，對(duì)成熟卵母細(xì)胞采取體外授精方式例如孤雌激活或單精子注射等方式獲得的受精胚胎。所述成熟卵母細(xì)胞可以來源于任何物種，例如哺乳動(dòng)物如小鼠、大鼠、豬、牛、羊、或者靈長類動(dòng)物如人。可以以任何合適的方式將經(jīng)培養(yǎng)的胚胎進(jìn)行冷凍。本領(lǐng)域中采用的胚胎冷凍方法包括例如程序化冷凍法、快速冷凍法、玻璃化冷凍法等。程序化冷凍法主要采用低濃度凍結(jié)保存劑梯度脫水，經(jīng)程序冷凍儀緩慢降溫。主要操作步驟包括：將胚胎順序放入一系列逐漸增加保存劑濃度的溶液中梯度脫水，再置入程序冷凍儀快速降溫至-5℃至-7℃植冰(人工誘導(dǎo)冰晶形成)，然后使程序冷凍儀緩慢降溫至-30℃至-80℃，之后如果需要的話進(jìn)行液氮貯存。玻璃化冷凍法是Rall和Fahy于1985年提出來的胚胎冷凍方法。玻璃化冷凍技術(shù)的基本原理就是用高濃度的冷凍保護(hù)劑溶液將細(xì)胞內(nèi)水分置換出來，經(jīng)急速降溫由液態(tài)轉(zhuǎn)化為外形似玻璃狀的非晶體化固體狀態(tài)。玻璃化冷凍法的主要操作步驟簡(jiǎn)單，包括：高濃度的冷凍保護(hù)劑置換細(xì)胞內(nèi)外的溶液，快速降溫，使溶液黏稠度極度提高并固化，放置液氮保存。一步冷凍法利用高濃度的抗凍劑使胚胎在冷凍前脫水，從而減少冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。該方法的特點(diǎn)是胚胎在室溫脫水后不需要特殊的降溫程序，能在很短的時(shí)間內(nèi)完成冷凍過程，具有重要的實(shí)用價(jià)值。在本發(fā)明中采用了程序化冷凍法，但是其他方法也可以使用。在本發(fā)明中采用的程序化冷凍法大體程序如下：在保護(hù)劑濃度遞增的溶液中梯度脫水，快速降溫(例如1℃/min)至-5℃至-7℃植冰，緩慢降溫(例如0.3℃/min)至-30℃至-80℃。如果需要長期冷凍，隨后可以將胚胎放入液氮中。通過在體外胚胎培養(yǎng)基中添加CathepsinL抑制劑，并將待冷凍胚胎在該添加有CathepsinL抑制劑的體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間，可以顯著地提高胚胎的抗凍性和解凍復(fù)蘇率。另外地或可能地，通過所述培養(yǎng)程序，可以減少在冷凍液中使用的抗凍保護(hù)劑的量，從而減少其對(duì)胚胎的毒副作用。實(shí)施例1材料1.1主要儀器和設(shè)備移液器：北京百晶移液器(1mL、200μL、100μL、10μL)醫(yī)用離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠，LDZ4-0.8CO2培養(yǎng)箱：HealForce公司，HF90體視顯微鏡：江南顯微鏡廠，X11-3超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司，ZHJH-1112B電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，BS124S酸度計(jì)：Thermo公司，868精密加熱板：貝達(dá)儀器公司，MEH-2水浴鍋：北京長安科學(xué)儀器廠，HH·S1-Ni1.2主要試劑1.2.1E-64d：購自Abcam公司，貨號(hào)：ab144048，CAS編號(hào):88321-09-9，PubChem識(shí)別號(hào)：65663。1.2.2CZB培養(yǎng)基(1)CZB儲(chǔ)液100mL配方配制方法：將A液和B液混合，再用高壓后超純水定容至100mL。(2)CZB工作液5mL配方1.2.3含有E-64d的體外胚胎培養(yǎng)液(下文簡(jiǎn)寫為E-64d-CZB工作液)將E-64d用少量DMSO溶解后添加到CZB工作液中，使E-64d的終濃度達(dá)到0.5、1、1.5、2、3、5、10μmol/L。將該體外胚胎培養(yǎng)液保存在4℃。1.3試驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選用8～12周齡性成熟、體重為28g左右的ICR系小鼠，該小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。2方法2.1小鼠正常孵化囊胚的獲取及收集選擇陰門淡粉色的雌性小鼠，腹腔注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)，10IU/只。48小時(shí)后，再注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)，10IU/只。之后立即使該雌性小鼠與成年公鼠1:1合籠過夜交配，次日早8點(diǎn)檢查交配情況。見陰道栓后注射抗孕馬血清(A-PMSG)，10IU/只。于見栓的第5天上午9點(diǎn)處死小鼠，取下小鼠兩側(cè)子宮，用PBS工作液沖出子宮中的正常孵化囊胚。2.2小鼠正常孵化囊胚的冷凍將回收的正常孵化囊胚(100枚左右)用100μlPBS液滴清洗3遍，再用100μlCZB工作液清洗3遍，之后移入濃度為0、0.5、1、1.5、2、3、5、10μmol/L的E-64d-CZB工作液液滴中，培養(yǎng)箱37℃、5％的CO2空氣和100％濕度條件下體外培養(yǎng)2小時(shí)。將培養(yǎng)后的胚胎用PBS工作液洗滌2遍，然后三步法脫去PBS，再放到冷凍液(Bioniche，ViGROTM，ETHYLENEGLYCOLFREEZE(withSucrose)，Lot：150206-2P)中平衡5分鐘，用0.25ml塑料麥管裝取胚胎。將裝好的麥管置于冷凍儀中，以1℃/分鐘的速度降到-5℃，平衡10分鐘，期間用預(yù)冷的鑷子夾住裝有胚胎的麥管上端冷凍液處3-5秒出現(xiàn)冰晶即植冰完成，隨后再平衡10分鐘，以0.3℃/分鐘的速度降至-35℃。隨后，將冷凍麥管放入液氮中。解凍時(shí)，把冷凍麥管從液氮中取出，室溫下輕輕晃動(dòng)5-10秒后，投入35℃水中10-15秒取出。剪掉麥管兩端栓部，將細(xì)管里的胚胎置于表面皿中，按三步法脫去冷凍液，解凍復(fù)蘇后再放到平衡過的新CZB的滴中進(jìn)行24小時(shí)的復(fù)蘇。24小時(shí)后統(tǒng)計(jì)其解凍復(fù)蘇率。上文所述脫去PBS的三步法具體程序如下：在將胚胎浸入完全冷凍液中并裝管冷凍前，將胚胎依次在100μl的下述溶液的液滴中洗滌(每種溶液中分別洗滌3-5分鐘)：1/3冷凍液+2/3PBS、1/2冷凍液+1/2PBS、2/3冷凍液+1/3PBS。上文所述脫去冷凍液的三步法具體程序如下：將胚胎依次在100μl的下述溶液的液滴中洗滌(每種溶液中分別洗滌3-5分鐘)：2/3冷凍液+1/3PBS、1/2冷凍液+1/2PBS、1/3冷凍液+2/3PBS。3數(shù)據(jù)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方分析。4結(jié)果4.1培養(yǎng)基中添加不同濃度的E-64d對(duì)小鼠正常孵化囊胚的解凍復(fù)蘇率的影響表1.添加不同濃度的E-64d培養(yǎng)后的正常孵化囊胚的解凍復(fù)蘇率(％)E-64d濃度(μmol/L)解凍復(fù)蘇率(％)073.40±4.30B0.575.35±3.51b180.67±5.40Aa1.579.45±4.28Aa278.65±2.56b376.26±5.32b572.64±2.13B1062.58±3.72B注：數(shù)值表示方式為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。每個(gè)處理組中不同的大寫字母之間顯示為極顯著(P<0.01)；不同的小寫字母之間表示為顯著(P<0.05)；無標(biāo)注為不顯著(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。以上結(jié)果表明，胚胎在采用含E-64d的體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間之后再進(jìn)行冷凍，會(huì)影響其解凍復(fù)蘇率。從表1可以看出，在含低濃度如0.5-3μmol/L的E-64d的體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間之后，胚胎的解凍復(fù)蘇率相對(duì)于對(duì)照得到了不同程度的提高，在濃度為1μmol/L或1.5μmol/L時(shí)提高最為顯著，提高了大約10％；然而，濃度更高的E-64d卻對(duì)胚胎的解凍復(fù)蘇率幾乎沒有影響或者有負(fù)面影響，例如在E-64d的濃度為5μmol/L時(shí)，胚胎的解凍復(fù)蘇率幾乎與在不添加該抑制劑的情況下相當(dāng)，而在E-64d濃度為10μmol/L時(shí)甚至有負(fù)面影響，解凍復(fù)蘇率降低至62.58％，跟對(duì)照比降低了大約15％?？梢?，在冷凍前于體外胚胎培養(yǎng)液中添加低濃度的E-64d能顯著提高正常胚胎的解凍復(fù)蘇率。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，本發(fā)明并不限于上述示例的細(xì)節(jié)，在不背離本發(fā)明的精神和宗旨的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到本文所描述技術(shù)方案的變化方案，并且該變化方案也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍由隨附權(quán)利要求所限定。另外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書通過實(shí)施方式來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案。本說明書的這種敘述方案僅為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將本說明書當(dāng)作一個(gè)整體，各個(gè)實(shí)施方式中的技術(shù)方案可以適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其它實(shí)施方式。當(dāng)前第1頁1 2 3