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一組用于驢源性的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的特異性引物和探針的制作方法

文檔序號:11145809閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一組用于驢源性的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的特異性引物和探針,其特征在于:所述特異性引物和探針的核苷酸序列為(1)或(2)中的一種:

(1)、上游引物:5'-GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'

下游引物:5'- GGGCTGTGATGATAAAGGGTAGA -3'

探針:5'- CCTCCTATCAGCAATCCCCTACATCG-3'

所述引物和探針擴(kuò)增的目標(biāo)核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.3;

(2)、與(1)所述序列互補(bǔ)的序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物和探針,其特征在于:所述探針的5’端熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM,3’端標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。

3.驢源性的PCR檢測試劑盒,所述試劑盒為驢源性的定性或定量檢測試劑盒;其特征在于:所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物和探針;

作為優(yōu)選,所述定量檢測試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品,所述標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為:將驢源性保守基因片段插入到載體pMD18-T中,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得含有驢源性保守基因片段的重組質(zhì)粒,以此作為標(biāo)準(zhǔn)品;所述驢源性保守基因片段為序列表中SEQ ID No.2;

作為進(jìn)一步優(yōu)選,所述驢源性保守基因片段是以序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列為模板,使用下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的:

上游引物:5'- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'

下游引物:5'- ATAGGAAATACCATTCTGGCTTA -3';

作為優(yōu)選,所述PCR擴(kuò)增的條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s,35個(gè)循環(huán);72℃ 10min。

4.權(quán)利要求1或2所述的特異性引物和探針在制備定性或定量檢測驢源性的試劑盒中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用,其特征在于:所述應(yīng)用是分別以標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品DNA為模板,利用特異性引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的Ct值判定結(jié)果。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于:所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件為:94℃ 預(yù)變性2分鐘,94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號,40個(gè)循環(huán)。

7.驢源性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法,所述檢測方法不以有生命的人體或動物體為直接實(shí)施對象,其特征在于:步驟如下:

(1)制備標(biāo)準(zhǔn)品:將驢源性保守基因片段插入到載體pMD18-T中,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得含有驢源性保守基因片段的重組質(zhì)粒,以此作為標(biāo)準(zhǔn)品;所述驢源性保守基因片段為序列表中SEQ ID No.2;

(2)使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品采用相同的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增;

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制;

(4)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的Ct值進(jìn)行驢源性的快速定量檢測。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法,其特征在于:步驟(1)中所述驢源性保守基因片段是通過以下引物擴(kuò)增得到的:

上游引物為5'- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3';

下游引物為5'- ATAGGAAATACCATTCTGGCTTA -3';

作為優(yōu)選,PCR擴(kuò)增所述驢源性保守基因片段的條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s,35個(gè)循環(huán);72℃ 10min;

作為優(yōu)選,步驟(2)中所述引物和探針的用量均為1.6μl;

作為優(yōu)選,步驟(2)中所述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94℃ 預(yù)變性2分鐘,94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號,40個(gè)循環(huán)。

9.驢源性的定性PCR檢測方法,所述檢測方法不以有生命的人體或動物體為直接實(shí)施對象,其特征在于:步驟如下:

(1)使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增;

(2)通過待測樣品的Ct值對驢源性進(jìn)行定性檢測:當(dāng)Ct值小于38時(shí),為陽性;否則,為陰性;

作為優(yōu)選,步驟(1)中所述引物和探針的用量均為1.6μl;

作為優(yōu)選,步驟(1)中所述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94℃ 預(yù)變性2分鐘,94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號,40個(gè)循環(huán)。

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