本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是一種東方紅菌菌株、生防菌劑、生防發(fā)酵液及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：辣椒炭疽病是危害甜椒、辣椒生產(chǎn)的主要病害之一，可引起辣椒落葉、爛果、幼苗死亡，嚴重時會造成20％-30％的減產(chǎn)，影響辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。辣椒炭疽病與辣椒病毒病、辣椒疫病稱為辣椒的三大病害，發(fā)病嚴重、分布廣，不論是露地種植還是保護地種植，染病的機率都很高，莖葉染病易造成落葉，果實染病則失去商品價值。目前，辣椒炭疽病的防治主要集中于施用化學(xué)農(nóng)藥及抗病品種選育等農(nóng)業(yè)措施，大量化學(xué)農(nóng)藥的長期使用導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、病蟲害抗性增加、環(huán)境污染等問題，嚴重影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。而抗性育種難度大、周期長，相應(yīng)的農(nóng)業(yè)措施復(fù)雜、經(jīng)濟投入大。生物防治是利用有益生物或其他生物來消滅或抑制有害生物，受到廣泛采用和具有良好生態(tài)效益、環(huán)境效益與社會效益的一種病蟲害防治方法，因其具有對環(huán)境、生態(tài)和人類健康安全的優(yōu)點，符合農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，是當前和未來植物病害防治的發(fā)展趨勢?？蒲泄ぷ髡咴谏锓乐卫苯诽烤也∩献隽溯^為廣泛的研究。已報道的用于辣椒炭疽病生物防治的拮抗微生物主要有真菌、細菌、粘菌、海洋微生物，其中生防細菌包括芽孢桿菌、假單孢菌、海洋細菌等。它們對辣椒炭疽病菌產(chǎn)生抑制作用的機理主要是通過競爭性生長繁殖而占居生存空間的方式來阻止植物病原真菌的生長與增殖，能在植物表面迅速形成一層高密保護膜，使炭疽病菌得不到生存空間，保護了辣椒免受病原菌為害；或分泌如細菌素類、蛋白類、脂肽類、多肽類、酚類等抑菌物質(zhì)來抑制菌絲生長和病菌孢子發(fā)芽，從而達預(yù)防植物病害的發(fā)生；另外通過生防菌誘發(fā)植物自身的抗病潛能從而增強植物的抗病性。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在光合細菌的基礎(chǔ)性研究、應(yīng)用研究方面也取得很大的進展。諸多研究結(jié)果證明，光合細菌菌體富含多種生理活性物質(zhì)及促生長因子，甚至菌體分泌的胞外組份對固氮根瘤細菌也有刺激作用，能顯著提高其固氮活性；且因其含有脯氨酸、尿嘧啶、胞嘧啶等物質(zhì)，能增加多種經(jīng)濟作物的產(chǎn)量等。而且光合細菌的一些活性物質(zhì)能鈍化病原體的致病力、促進放線菌等有益微生物增殖，以及抑制病原體的生長，從而有效地抑制某些植物病害的發(fā)生與蔓延。因而，利用光合細菌防治辣椒炭疽病具有豐富的生防資源和廣闊的應(yīng)用前景。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種東方紅菌菌株、生防菌劑、生防發(fā)酵液及其制備方法和應(yīng)用，以解決上述
背景技術(shù)：
中提出的問題。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種東方紅菌菌株，所述東方紅菌菌株為東方紅菌i-1-1(rhodobiumorientisi-1-1)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccm2012368。一種東方紅菌生防菌劑，所述東方紅菌生防菌劑由上述的東方紅菌菌株經(jīng)活化、種子培養(yǎng)、生產(chǎn)培養(yǎng)制備得到。一種東方紅菌菌株的生防發(fā)酵液，所述東方紅菌菌株的生防發(fā)酵液由權(quán)利要求2所述的東方紅菌生防菌劑離心收集上清制得東方紅菌菌株的生防發(fā)酵液。一種上述的東方紅菌生防菌劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：a、活化：將東方紅菌菌株的保存種按雙層平板培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)；b、種子培養(yǎng)：將步驟a培養(yǎng)出的紅色單菌落接入至血清瓶中，以光合細菌液體培養(yǎng)基進行種子培養(yǎng)至對數(shù)生長期得到菌液；c、生產(chǎn)培養(yǎng)：將步驟b種子培養(yǎng)后得到的菌液按光合細菌菌株總體積5％的接種量接種到生產(chǎn)瓶中，以光合細菌生產(chǎn)培養(yǎng)基進行生產(chǎn)培養(yǎng)至對數(shù)生長期即制得東方紅菌生防菌劑。作為本發(fā)明進一步的方案：所述步驟b中種子培養(yǎng)的溫度為30℃～35℃，光照條件為2500lx～4000lx，ph為7.0。作為本發(fā)明進一步的方案：所述步驟c中生產(chǎn)培養(yǎng)的溫度為30℃～35℃，光照條件為2500lx～4000lx，ph為7.0。作為本發(fā)明進一步的方案：所述離心的轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心溫度為4℃，離心時間為15min。一種上述的東方紅菌生防菌劑或上述制備方法制得的東方紅菌生防菌劑的應(yīng)用，所述東方紅菌生防菌劑應(yīng)用于辣椒促生。一種上述的東方紅菌生防菌劑或上述制備方法制得的東方紅菌生防菌劑的應(yīng)用，所述東方紅菌生防菌劑應(yīng)用于拮抗辣椒炭疽菌或防控辣椒炭疽病。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明的東方紅菌i-1-1的生產(chǎn)工藝簡單、培養(yǎng)時間短、成本低，且該菌株可通過簡單、快捷、低成本的操作方法制備得到辣椒炭疽病防控的生防菌劑及生防發(fā)酵液；(2)本發(fā)明的東方紅菌i-1-1制得的生防菌劑及生防發(fā)酵液具有環(huán)境友好、對人畜無毒、對作物無藥害、施用簡單方便等特點，且不易使病蟲害產(chǎn)生耐藥性；(3)本發(fā)明的東方紅菌i-1-1制得的生防菌劑及生防發(fā)酵液既可以防治辣椒炭疽病害又能促進辣椒生長。附圖說明圖1為東方紅菌菌株的電子顯微鏡掃描圖片。圖2為東方紅菌生防菌對辣椒炭疽病雙層平板生測結(jié)果圖。圖3為東方紅菌生防菌發(fā)酵液對辣椒炭疽病的離體防治效果對比圖。圖4為東方紅菌生防菌劑在室內(nèi)盆栽條件下對辣椒的促生效果圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本專利的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。請參閱圖1-4，一種東方紅菌菌株，所述東方紅菌菌株為東方紅菌i-1-1(rhodobiumorientisi-1-1)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccm2012368，保藏單位地址位于中國武漢大學(xué)，保藏日期為2014年10月29日。一種東方紅菌生防菌劑，所述東方紅菌生防菌劑由上述的東方紅菌菌株經(jīng)活化、種子培養(yǎng)、生產(chǎn)培養(yǎng)制備得到。一種東方紅菌菌株的生防發(fā)酵液，所述東方紅菌菌株的生防發(fā)酵液由權(quán)利要求2所述的東方紅菌生防菌劑離心收集上清制得東方紅菌菌株的生防發(fā)酵液。一種上述的東方紅菌生防菌劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：a、活化：將東方紅菌菌株的保存種按雙層平板培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)；b、種子培養(yǎng)：將步驟a培養(yǎng)出的紅色單菌落接入至血清瓶中，以光合細菌液體培養(yǎng)基進行種子培養(yǎng)至對數(shù)生長期得到菌液；c、生產(chǎn)培養(yǎng)：將步驟b種子培養(yǎng)后得到的菌液按光合細菌菌株總體積5％的接種量接種到生產(chǎn)瓶中，以光合細菌生產(chǎn)培養(yǎng)基進行生產(chǎn)培養(yǎng)至對數(shù)生長期即制得東方紅菌生防菌劑。所述步驟b中種子培養(yǎng)的溫度為30℃～35℃，光照條件為2500lx～4000lx，ph為7.0。所述步驟c中生產(chǎn)培養(yǎng)的溫度為30℃～35℃，光照條件為2500lx～4000lx，ph為7.0。所述離心的轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心溫度為4℃，離心時間為15min。所述磷酸緩沖液摩爾濃度為0.01m，ph＝7.0。一種上述的東方紅菌生防菌劑或上述制備方法制得的東方紅菌生防菌劑的應(yīng)用，所述東方紅菌生防菌劑應(yīng)用于辣椒促生。一種上述的東方紅菌生防菌劑或上述制備方法制得的東方紅菌生防菌劑的應(yīng)用，所述東方紅菌生防菌劑應(yīng)用于拮抗辣椒炭疽菌或防控辣椒炭疽病。實施例1：一株東方紅菌菌株，其名稱為東方紅菌i-1-1，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為cctccm2012368，保藏單位地址位于中國武漢大學(xué)，保藏日期為2012年9月20日。參見圖1：東方紅菌菌株i-1-1為革蘭氏陰性菌，經(jīng)生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定為東方紅菌。主要生物學(xué)特征有：雙層固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d～8d，形成紅色的圓形菌落，菌落邊緣整齊光滑、菌落直徑0.2mm～0.60mm；液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d呈深紅色；在厭氧和微氧條件下生長良好；生理化特性為v-p反應(yīng)與甲基紅反應(yīng)陰性、h2s反應(yīng)、明膠液化、脲酶試驗、吲哚試驗均陽性，最適生長溫度30℃～35℃，ph＝7。實施例2：一種東方紅菌生防菌劑，采用實施例1的東方紅菌菌株i-1-1為原料，通過經(jīng)活化、種子培養(yǎng)、生產(chǎn)培養(yǎng)制備得到，其具體制備方法包括以下步驟：(1)活化：將東方紅菌i-1-1菌株的保存種按雙層平板培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)；采用的培養(yǎng)基為光合細菌固體培養(yǎng)基，配方為：(nh4)2so42g/l、ch2coona2g/l、ye1.5g/l、k2hpo40.4g/l、mgso40.5g/l、微量金屬元素貯液1.0ml(準確稱量edta2.5g、znso46.13g、mgso40.78g、cuso40.25g、cocl20.08g、feso4·7h2o7.0g溶于1l蒸餾水中)、瓊脂粉20g/l，ph＝7.0。(2)種子培養(yǎng)：將步驟(1)培養(yǎng)出的紅色單菌落接入至120ml血清瓶中，在溫度為30℃～35℃、光照條件為2500lx～4000lx、ph＝7.0條件下，用光合細菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期得到菌液。光合細菌液體培養(yǎng)基的配方為(nh4)2so42g/l、ch2coona2g/l、ye1.5g/l、k2hpo40.4g/l、mgso40.5g/l、微量金屬元素貯液1.0ml(準確稱量edta2.5g、znso46.13g、mgso40.78g、cuso40.25g、cocl20.08g、feso4·7h2o7.0g溶于1l蒸餾水中)，ph＝7.0。(3)生產(chǎn)培養(yǎng)：將步驟(2)種子培養(yǎng)后得到的菌液接種到生產(chǎn)瓶中，用光合細菌生產(chǎn)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分與上述光合細菌液體培養(yǎng)基一致)進行生產(chǎn)培養(yǎng)，菌液的接種量為所述光合細菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基總體積的5％，在溫度為30℃～35℃、光照條件為2500lx～4000lx、ph＝7.0條件下，培養(yǎng)至對數(shù)生長期即制得生防菌劑。實施例3：一種東方紅菌生防發(fā)酵液，采用實施例1的東方紅菌菌株i-1-1為原料，通過經(jīng)活化、種子培養(yǎng)、生產(chǎn)培養(yǎng)、離心制備得到，其具體制備方法包括以下步驟：取實施例1中獲得的生防菌劑，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)6d，發(fā)酵培養(yǎng)在溫度為30-35℃、光照條件為3000lx-4000lx條件下進行，發(fā)酵培養(yǎng)基成分與上述的光合細菌液體培養(yǎng)基成分相同，然后在6000rpm條件下離心5min-8min，離心收集上清液，將上清液用細菌過濾器過濾，得到無東方紅菌菌體的上清液即為生防發(fā)酵液，4℃保存?zhèn)溆?。實施?：東方紅菌i-1-1生防菌辣椒炭疽病菌絲的作用。一種實施例2的生防菌在辣椒炭疽病病防治中的應(yīng)用，具體的應(yīng)用方法為：將東方紅菌i-1-1菌株采用雙層平板法進行培養(yǎng)：下層為實施例2中的光合細菌固體培養(yǎng)基，上層為10mlpda組成雙層平板，在溫度為30℃～35℃、光照條件為2500lx～4000lx、ph＝7.0條件下培養(yǎng)，待東方紅菌i-1-1菌株布滿平板后，在平板中央接種預(yù)先培養(yǎng)5d的直徑為6mm的辣椒炭疽病菌菌餅，每平板接種一片，每處理重復(fù)3次，倒置于28℃恒溫箱中進行暗培養(yǎng)，逐日觀察菌絲的生長情況并于5d記錄菌餅直徑大小，按照下列公式計算抑菌率：抑菌率(％)＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100％(單位：cm)。參見圖2，圖2中編號1、2分別含有東方紅菌i-1-1菌株的雙層平板和空白對照處理，從圖中4中可以發(fā)現(xiàn)：對照處理的辣椒炭疽病菌發(fā)病率為63.33％。空白對照是下層為10ml光合細菌固體培養(yǎng)基和上層為10mlpda的空白雙層平板。實施例5：東方紅菌i-1-1生防菌辣椒炭疽病離體果實生測試驗。一種實施例3的生防發(fā)酵液在辣椒炭疽病病防治中的應(yīng)用，具體的應(yīng)用方法為：采集成熟果，經(jīng)表面消毒后，用hamilton微量注射器的針頭在果面上刺2個接種點，將生防發(fā)酵液：孢子＝1：1：1比例配制的孢子懸浮液(濃度為1×106個/ml)，每點注入2μl于果肉中，28℃、12h光照/d、rh≥95％的條件下培養(yǎng)，第7d調(diào)查發(fā)病情況。病斑直徑≥4mm的視為發(fā)病，統(tǒng)計發(fā)病率，即病斑數(shù)占總接種點的百分率。設(shè)4次重復(fù)，每重復(fù)至少5個果。參見圖3，圖3中編號1、2分別表示濃度為生防發(fā)酵液、空白對照處理，從圖中4中可以發(fā)現(xiàn)：對照處理的辣椒炭疽病菌發(fā)病率為95％，而發(fā)酵液處理后辣椒炭疽病發(fā)病率為25％。液體的光合培養(yǎng)基為空白對照。實施例6：東方紅菌i-1-1生防菌劑在辣椒促生中的應(yīng)用。一種實施例2的生防菌在辣椒促生中的應(yīng)用，具體的應(yīng)用方法為：在溫室中，將分別將5×106cfu/ml生防菌劑、光合細菌培養(yǎng)基和清水處理噴施于移栽3片真葉的辣椒苗，每處理10株共噴100ml至葉面滴水，重復(fù)3次。鑒定期間幼苗保持在26～28℃、10h光照/d條件下的溫室中培養(yǎng)，14d后調(diào)查。每個處理選取3株代表性植株分別測定株高和濕重。參見圖4，其中ck為清水對照，編號1、編號2分別為5×106cfu/ml生防菌和光合細菌培養(yǎng)基。從下表中可以知道施用生防菌劑處理后的辣椒株高相對于清水對照增加33.77％、辣椒單棵鮮重相對于清水對照增加32.78％。處理平均株高(cm)增高率(％)平均單棵鮮重(g)增產(chǎn)率(％)110.7333.7720.6532.7828.8214.6117.5810.5137.7-15.55-上面對本專利的較佳實施方式作了詳細說明，但是本專利并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下做出各種變化。當前第1頁12