本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種小麥木聚糖-阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶基因taxat的克隆與在提高植物赤霉病抗性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

赤霉病(fusariumheadblight)是由禾谷鐮刀菌引起的，危害小麥、大麥、燕麥、玉米、水稻、黑麥等禾谷類作物的重要病害之一，嚴重影響我國糧食生產(chǎn)的產(chǎn)量和品質(zhì)。赤霉病在我國長江中下游和東北地區(qū)大面積發(fā)生，在大流行年產(chǎn)量減少20-40%。近年來隨著耕作模式改變和氣候變化，赤霉病已經(jīng)向我國其他的主產(chǎn)區(qū)蔓延。此外，病麥粒攜帶的真菌毒素影響種子質(zhì)量，危害人和動物的健康，成為威脅糧食安全的隱患之一。耕作模式和栽培技術(shù)的改變難以解決病害的侵染和蔓延，使用藥劑防治對控制赤霉病大發(fā)生和大流行取得了一定的效果，但同時增加了生產(chǎn)成本，化學(xué)藥劑的使用也不可避免的導(dǎo)致環(huán)境污染。利用赤霉病抗性基因進行品種改良是減輕赤霉病危害的有效途徑。

研究表明，小麥赤霉病的抗性是由少數(shù)主效基因加眾多微效基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，已從普通小麥或近緣種中定位了超過100與赤霉病相關(guān)的抗性位點，這些抗性位點分布在除7d以外的所有20條染色體上。通過基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等分析方法表明赤霉病候選基因分布在小麥應(yīng)答禾谷鐮刀菌的各個生物學(xué)過程中，如次級代謝生物合成、細胞壁防御、降低胞內(nèi)過氧化物和轉(zhuǎn)化毒素等。

tafrog基因(alexandraetal,2015)位于a基因組第4號染色體上，克隆自抗性種質(zhì)“cm82036”，編碼一個未知功能的蛋白，與tasnrk1α互作后能一定程度上減緩赤霉病的發(fā)生。

taabcc3基因(stephanieetal,2015)在a、b、d基因組第3號染色體上各有一個拷貝，基因全長為4503bp,編碼的蛋白含有一個abc轉(zhuǎn)運酶c家族結(jié)構(gòu)域，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默證實taact基因參與taabcc3基因參與毒素的降解，能增強植物對毒素的耐受能力。

taact基因(kageetal,2016)位于d基因組第2號染色體長臂上，cdna全長為1326bp,編碼的蛋白含有一個轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默證實taact基因參與防御赤霉病菌。

pft基因(rawatetal,2016)位于b基因組第3號染色體短臂，克隆自中國赤霉病抗性品種“蘇麥3號”。pft基因全長3427bp,它含有1個5’非翻譯區(qū)，2個外顯子、1個內(nèi)含子和1個3’非翻譯區(qū)，編碼的蛋白含有2個植物凝集素結(jié)構(gòu)域和1個etx/mtx2結(jié)構(gòu)域。在基因區(qū)域發(fā)生單核苷酸突變后引起的移碼突變可使抗性植株抗性降低。

赤霉病菌在花期時侵染小麥小穗，產(chǎn)生大量的細胞壁降解酶類，如：果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶等來降解細胞壁多聚糖，從而達到在宿主上侵染和擴展的目的。降解酶類對細胞壁的降解程度受細胞壁的成分及其相對含量的影響，在宿主-病原菌互作中發(fā)揮重要的作用，但在禾谷類作物中這方面的研究還比較少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供一種編碼細胞壁木聚糖-阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶taxat基因?qū)儆谔腔D(zhuǎn)移酶家族61,其參與木聚糖的阿拉伯糖修飾反應(yīng)而影響細胞壁的成分及其含量，在細胞壁防御禾谷鐮刀菌的過程中提高植物赤霉病抗性，本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

一種提高植物赤霉病抗性的小麥基因，其核苷酸序列如seqidn0.1所示。

一種由seqidn0.1所示基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如seqidn0.2所示，即seqidno.1序列中264位到1844位基因編碼的序列。

一種含有seqidn0.1所示基因的植物表達載體pcambia2301-camv35s-taxat。

如seqidn0.1所示提高植物赤霉病抗性的小麥基因在增強植物赤霉病抗性中的應(yīng)用，其具體為，將seqidn0.1所示提高植物赤霉病抗性的小麥基因通過表達載體轉(zhuǎn)入目的植物內(nèi)，以提高植物的赤霉病抗病性。

本發(fā)明提供的提高植物赤霉病抗性的小麥基因taxat在增強植物赤霉病抗性中具有重要的應(yīng)用價值，可以通過酶切連接方法將如seqidn0.1所示的基因編碼區(qū)序列連接到植物表達載體上，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入擬南芥、小麥、玉米或其他植物細胞，可獲得表達所述基因的轉(zhuǎn)基因抗病材料，從而應(yīng)用于生產(chǎn)。本發(fā)明所述的基因構(gòu)建到植物轉(zhuǎn)化載體上，可以對所述基因或其調(diào)控序列適當(dāng)修飾，也可以用其它啟動子取代所述基因原有的啟動子，從而拓寬抗病譜或增強對病原菌的抗性。

本發(fā)明的有益效果：將克隆的抗病基因轉(zhuǎn)入感病的植物中，有助于獲得新的抗病植物?？寺〉目共』蚰茉诓煌奈锓N間轉(zhuǎn)移并利用，從而能夠克服傳統(tǒng)抗病育種中遠緣雜交的困難。此外，可以用雜交和轉(zhuǎn)化方法在植物中累加多個抗病基因，而不會產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的基因組中連鎖累贅問題，并且可以縮短育種時間，提高品種選育效率。

附圖說明

圖1為利用race技術(shù)擴增taxat基因的5’和3’片段的檢測電泳圖，泳道1和2分別為taxat基因的5’和3’片段。

圖2為植物表達載體pcambia2301-camv35s-taxat構(gòu)建的檢測電泳圖；

其中，圖2a為重組質(zhì)粒pcr檢測的電泳圖，泳道1為重組質(zhì)粒的pcr檢測電泳圖，泳道2為未重組質(zhì)粒的pcr檢測電泳圖；

圖2b為重組質(zhì)粒pcambia2301-camv35s-taxat的酶切鑒定電泳圖，泳道1為重組質(zhì)粒的酶切后電泳圖，泳道2為重組質(zhì)粒的未酶切的電泳圖。

圖3為轉(zhuǎn)基因植株的taxat基因的pcr鑒定電泳圖。

其中，泳道1-3為轉(zhuǎn)基因組植株葉片的pcr擴增產(chǎn)物，泳道4為對照野生組植株葉片的pcr產(chǎn)物，泳道5為重組質(zhì)粒pcambia2301-camv35s-taxat的pcr產(chǎn)物，泳道6為雙蒸水的pcr產(chǎn)物。

圖4為三株轉(zhuǎn)基因株系表達結(jié)果示意圖；

圖5為轉(zhuǎn)基因植株花序?qū)Σ≡目剐澡b定結(jié)果示意圖；

其中，圖5a為轉(zhuǎn)基因植株花序?qū)Σ≡目剐澡b定圖；

圖5b為對照野生型植株花序?qū)Σ≡目剐澡b定圖。

圖6為轉(zhuǎn)基因植株角果對病原菌的抗性鑒定結(jié)果示意圖；

其中，圖6a為轉(zhuǎn)基因植株角果對病原菌的抗性鑒定圖；

圖6b為對照野生型植株角果對病原菌的抗性鑒定圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例涉及的核苷酸、氨基酸序列如序列表seqidno.1-seqidno.10所示。

實施例涉及的材料來源：

蘇麥3號：由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所小麥研究室保藏；

擬南芥植物：由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所小麥研究室保藏；

赤霉菌：由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所小麥研究室保藏；

pt19-t載體：購自寶生物工程(大連)有限公司

pcambia2301-camv35s：由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所小麥研究室保藏；

實施例1taxat基因的獲得及分析

根據(jù)所得目的基因的est序列，使用primerpremier5.0設(shè)計用于5’和3’race巢式擴增的引物：5’-primer（其序列如seqidno.3所示）和3’-prime（其序列如seqidno.4所示）；

以接種赤霉菌處理8小時的蘇麥3號穗部cdna為模板，利用cdnaamplification試劑盒分別進行3’和5’race擴增：

pcr反應(yīng)體系：2×seqampbuffer25.0μl，seqampdnapolymerase1.0μl，cdna模板2.5μl，10×universalprimeramix5μl，5’或3’-primer(10μm)1μl,ddh2o15.5μl。

pcr反應(yīng)程序：94?c3分鐘；94?c30秒，55?c30秒，72?c2分鐘延伸，30個循環(huán)；72?c延伸5分鐘；

將pcr產(chǎn)物于1%瓊脂糖膠進行凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1所示，圖1中，泳道1和2分別為taxat基因的5’和3’片段，m為dnamarker。

對目的條帶進行切膠回收，克隆至pt19-t載體中，送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。經(jīng)過序列拼接得到完整的基因，申請人自命名為taxat，其核苷酸序列如seqidno.1所示，基因序列全長為2030bp。

用軟件orffinder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預(yù)測完整開放閱讀框，全長為1581bp（即seqidno.1序列中264位到1844位的序列），其編碼的氨基酸序列如seqidno.2所示。

實施例2植物表達載體的構(gòu)建

以蘇麥3號穗部cdna為模板，利用引物taxatfxba（seqidno.5所示）和taxatrsac（seqidno.6所示）擴增taxat完整的開放閱讀框，并引入限制性酶切位點xbai和saci，回收目的片段。

pcr反應(yīng)體系：10×exbuffer5μl，mgcl2(25mm)4μl,dntp（2.5mm）1.6μl，taxatfxba引物（10um）1μl，taxatrsac引物（10um）1μl，extaq0.25μl，ddh2o13.7μl。

pcr反應(yīng)程序：94?c3分鐘；94?c15秒，55?c30秒，72?c2分鐘延伸，30個循環(huán)；72?c延伸5分鐘；

使用限制性內(nèi)切酶xbai和saci分別對pcambia2301-camv35s和目的基因片段進行酶切，37℃酶切15min，再次回收。

酶切體系：目的片段200ng或載體1000ng,10×buffer2μl,xbai1μl,saci1μl,ddh2o補充至20μl；

用連接酶solutioni連接回收片段：

連接體系：solutioni5μl，pcambia2301酶切后產(chǎn)物1μl，目的基因酶切后產(chǎn)物4μl。

連接產(chǎn)物后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，在37?c培養(yǎng)箱中，平板正向放置至液體完全被固體培養(yǎng)基吸收，然后避光倒置，37?c培養(yǎng)12~14h。

通過電泳鑒定重組質(zhì)粒，電泳結(jié)果如圖2a所示，其中泳道1為重組質(zhì)粒的pcr檢測電泳圖，泳道2為未重組質(zhì)粒的pcr檢測電泳圖。

采用基因特異性引物taxatfxba和taxatrsac對重組轉(zhuǎn)化子進行菌液pcr篩選。

pcr反應(yīng)體系：10×buffer（含mg²⁺）2.0μl，dntp（2.5mm）1.6μl，菌液2.0μl（od600在0.4-0.6之間），引物taxatfxba（10um）0.1μl，引物taxatrsac（10um）0.1μl，rtaq，0.5μl，ddh2o補足至20μl。

pcr反應(yīng)條件為：94?c5分鐘；94?c30秒，55?c30秒，72?c2分鐘，30個循環(huán)；72?c延伸5分鐘。

擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

陽性重組質(zhì)粒按照質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶xbai和saci酶切鑒定重組子pcambia2301-camv35s-taxat，如圖2b所示，圖2b為重組質(zhì)粒pcambia2301-camv35s-taxat的酶切鑒定電泳圖，其中，泳道1為重組質(zhì)粒的酶切后電泳圖，泳道2為重組質(zhì)粒的未酶切的電泳圖。

以上結(jié)果表明植物表達載體pcambia2301-camv35s-taxat構(gòu)建成功，可以應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化。

實施例3擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及基因功能驗證

實驗分為轉(zhuǎn)基因組與對照野生組：

轉(zhuǎn)基因組：采用浸花法進行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化（參見cloughsj,bentaf(1998)floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantj16:735–743.），將實施例2獲得的植物表達載體pcambia2301-camv35s-taxat轉(zhuǎn)入擬南芥植物內(nèi)，經(jīng)過含卡那霉素(終濃度50mg/l)的ms培養(yǎng)基篩選后，將長出真葉并呈綠色的擬南芥植株移栽到土質(zhì)基質(zhì)上，置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)6-8周。培養(yǎng)條件為：相對濕度80%，恒溫20-24℃，光照強度80-200umol/m²/s，光照周期為8h黑暗﹑16h光照培養(yǎng)。

對照野生組：野生型種子在無抗生素平板萌發(fā)，長出真葉后移栽到土質(zhì)基質(zhì)上，置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)6-8周，培養(yǎng)條件與轉(zhuǎn)基因組一致。

1、植株葉片驗證

采集葉片，提取基因組dna，使用基因特異性引物taxatfxba（seqidno.5）和taxatrsac（seqidno.6）進行pcr驗證，

pcr反應(yīng)體系：10×buffer（含mg²⁺）2.0μl，dntp（2.5mm）1.6μl，菌液2.0μl（od600在0.4-0.6之間），taxatfxba（10um）0.1μl，taxatrsac（10um）0.1μl，rtaq0.5μl，ddh2o補足至20μl；

pcr反應(yīng)條件為：94?c5分鐘；94?c30秒，55?c30秒，72?c2分鐘，30個循環(huán)；72?c延伸5分鐘。

電泳結(jié)果如圖3所示，泳道1-3為轉(zhuǎn)化植株的pcr擴增產(chǎn)物，泳道4為對照野生組的pcr產(chǎn)物，泳道5為重組質(zhì)粒pcambia2301-camv35s-taxat的pcr產(chǎn)物，泳道6為雙蒸水的pcr產(chǎn)物。

2、轉(zhuǎn)基因表達驗證

分別以t1代擬南芥轉(zhuǎn)基因與野生型花序的cdna為模板,利用rochelightcycler96實時熒光定量pcr儀檢測目的基因的相對表達量。基因特異性引物為rtf（seqidno.7）和rtr（seqidno.8）,內(nèi)參基因為tubulin，其擴增引物為tubf（seqidno.9）和tubr（seqidno.10）。

qpcr反應(yīng)體系為：sybrpremixextaq（2×）10μl，引物1(10μm)0.4μl，引物2(10μm)0.4μl，cdna2.0μl,ddh2o7.2μl。

pcr程序：采用兩步法pcr擴增標(biāo)準程序：95℃30秒；95℃5秒，60℃30秒，共40個循環(huán)。每個樣品三次重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后獲得ct值，采用2^-δδct法對目的基因進行相對定量表達分析。

結(jié)果如圖4所示，圖4中，（1）為野生型，（2）-（4）為選取的三株轉(zhuǎn)基因株系表達結(jié)果，可見，目的基因在轉(zhuǎn)基因株系體內(nèi)能穩(wěn)定表達，表達量比野生型提高9-18倍。

3、種子染病驗證

選取t1代擬南芥轉(zhuǎn)基因與野生型種子，播種后移栽到土質(zhì)基質(zhì)上，生長至花期且有2-3個角果時即可接種赤霉病菌。

接種方法如下：調(diào)整病原菌孢子數(shù)濃度為1×10⁵個/l，采用噴霧法對花序進行接種，每株噴灑0.5ml分生孢子液，接種2天后對染病植株進行觀察。

角果柱頭端2毫米處用無菌剪刀切斷，接種孢子液滴5μl在傷口處，接種7天后觀察發(fā)病情況。接種后用塑料薄膜覆蓋保濕，22?c下黑暗培養(yǎng)2天然后移至25?c、相對濕度為80%溫箱中，光暗比16h:8h培養(yǎng)。

圖5為兩組植株花序?qū)Σ≡目剐澡b定結(jié)果圖片，其中，圖5a為轉(zhuǎn)基因組植株花序?qū)Σ≡目剐澡b定圖，圖5b為對照組野生型植株花序?qū)Σ≡目剐澡b定圖，由圖5可見，對于花序組織，對照組和轉(zhuǎn)基因植株中均能明顯看到菌絲在花序組織間擴展，但轉(zhuǎn)基因植株發(fā)病程度小于對照組。

圖6為兩組植株角果對病原菌的抗性鑒定圖片，其中，圖6a為轉(zhuǎn)基因組植株角果對病原菌的抗性鑒定圖，圖6b為對照組野生型植株角果對病原菌的抗性鑒定圖，由圖6可見，枯萎的種子周圍都有一定程度的布滿菌絲，野生型擬南芥角果整體枯萎呈現(xiàn)褐色，轉(zhuǎn)基因角果呈現(xiàn)褐綠色，說明轉(zhuǎn)基因植株對病原菌的抗性增強。

sequencelisting

<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>一種提高植物赤霉病抗性的小麥基因及其應(yīng)用

<130>10

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2030

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

gtggtatcaacgcagagtactgggggaagccaagtcctacaccgccacacctcctcgcct60

gctttctgtccccgtctctcttctatctccatgtaaagttgtgagccgtcgacgaagaaa120

caggaggcggaggaagaaacaaagaaagctcgaccgtgtcgccgggctcgtgcgcggtgc180

cggaacaggtcgtcgtcggcgtcgcacgagaggattgcctgttgtgtacgcgtcgaggtg240

ccggagggacagaggaggaggagatgggcgccggcgaggggaagcaggggaaggggcttg300

tgaggagctgggcgcagaggtacctcaacctcggcttcgtcgccggcttcctgctcgtgc360

tcctcacctacatcgtcgtcacccagcagttcgccatcacctcccccgacgctgtcccca420

cgatgacgccgcaccagaagcaggcgatcagcgcccccggcgccggcgtaacagggacgc480

cggagggtcgagttgaggagaagtctgagacgaaacctgtcgatgcttcttccggggatg540

aaactcctaaggaggagcagcaacaacaacatgatgcggagccggaatggaagaagccgg600

aagacacggtggcgacggaggaagagccccccaaaagagacgacaccgctgccgaaccgc660

tcgacaacggcaaggtggtgtgtaccacggagggccccttctccgacacgtgcgacgtct720

tcggtgacgtccggaccaacggcacagctcacaccgtcaccctcgtcccagcgaccgaga780

cggagagccgggagtggaagattcagccctacgtccgccgtggcatgtctggcatctcgg840

aggtcacggtgacgcagctcgactcgacctccgcggcatccccggcgccggcgtgcacgg900

tgacgcaccgcgtcccggccatcgtgttcgcgctcggtgggctaacaggcaactacttcc960

acgacttcagcgatgcgctggtgccactattcgtggcgtcacggcgatatggcggcgagg1020

tccagctattggccagcaacatccagccatggtggctcggcaagtacgaggccgtggtga1080

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cgagcgtcactgtcgggctacgcatgcacaaggaattcgacatcgtgccggagttggtcc1200

ccggcggcgcccccctctccatggtcgacttcaccgccttcctccgcgagacctacaccc1260

taccccgcgccgcgcccatcagccttatgaaggacatcagcccgccggaggaccaggaga1320

agaggaaaccgcggctgatgctgctccaccgtggccactaccggaagttcgtgaacgtgc1380

ctgagatcgtgaaggcggcggagaaggccgggttcgaggtgtccatcgccgacccgcggt1440

tcgacgtgcgggtggaggagctggcccggtcggtgaactcgttcgacgtgctgctgggcg1500

tgcacggcgccgggctgaccaacgccgtgttcatgcccacgggggcggtggtgatccagg1560

tggtgccgtacgggaacctagagcacatggcgaaggtggacttcggcgaccccgtggcgg1620

acatggggctccggtacctcgagtacagcatcacggcggaggagagcacgctgctggaga1680

tgctggggccggaccaccccgtgatcaaggaccccgagtcggtgcaccggagtgggtggg1740

acaaggtcgccgagtactacctcggcaagcaggacgtgcgcgttgacgtggagcgcttcg1800

cgcccacgcttgctctggccatcgaacatcttcgacagaagtagaaaattgcatgggcca1860

ccgagaattcgttttttttttgttggtacagtttcggggcattctatggcctctgaattt1920

ggtggaacatacatacatagaagaattgctggtatattggttgatttatttacctcaagt1980

gaatagaaaaattaacttgtttcagcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2030

<210>2

<211>526

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<213>人工合成

<400>2

metglyalaglygluglylysglnglylysglyleuvalargsertrp

151015

alaglnargtyrleuasnleuglyphevalalaglypheleuleuval

202530

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354045

aspalavalprothrmetthrprohisarglysglnalaileserala

505560

proglyalaglyvalthrglythrprogluglyargvalgluglulys

65707580

alagluthrlysprovalaspalaserserglyaspgluthrprolys

859095

glugluglnglnglnglnhisaspalagluproglutrplyslyspro

100105110

gluaspthrvalalathrgluglugluproprolysargaspaspthr

115120125

alaalagluproleuaspasnglylysvalvalcysthrthrglugly

130135140

propheseraspthrcysaspvalpheglyaspvalargthrasngly

145150155160

thralahisthrvalthrleuvalproalathrgluthrgluserarg

165170175

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210215220

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225230235240

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245250255

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275280285

ileargcyspheproservalthrvalglyleuargmethislysglu

290295300

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305310315320

valaspphethralapheleuarggluthrtyrthrleuproargala

325330335

alaproileserleumetlysaspileserproprogluaspglnglu

340345350

lysarglysproargleumetleuleuhisargglyhistyrarglys

355360365

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370375380

gluvalserilealaaspproargpheaspvalargvalglugluleu

385390395400

alaargservalasnserpheaspvalleuleuglyvalhisglyala

405410415

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465470475480

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<213>人工合成

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