本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域，具體涉及一種巨大芽孢桿菌QBJP-F6及其在制備功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，蔬菜工廠化育苗越來越受到人們的重視，穴盤育苗是當(dāng)前工廠化育苗的主要措施。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國需要育苗的作物面積非常大，其中水稻種植面積就超過3億畝/年，經(jīng)濟(jì)作物超過5億畝次/年。目前國內(nèi)一般以富含有機(jī)質(zhì)的材料(如泥炭、腐熟植物殘體等)為主，再配以適當(dāng)比例的輕質(zhì)無機(jī)材料，如蛭石、膨脹珍珠巖等制成育苗基質(zhì)。由于材料來源受地區(qū)和成本的限制，且泥炭為不可再生資源，限制著基質(zhì)無土育苗的可持續(xù)發(fā)展，現(xiàn)已成為草炭匱乏地區(qū)蔬菜工廠化育苗發(fā)展的瓶頸。國外工廠化育苗發(fā)展很快，進(jìn)口基質(zhì)保水性明顯優(yōu)于國產(chǎn)泥炭基質(zhì)，進(jìn)口基質(zhì)中有機(jī)質(zhì)和速效磷、鉀含量明顯高于國產(chǎn)泥炭基質(zhì)。因此提升國內(nèi)育苗基質(zhì)的整體水平變得尤為迫切。將促進(jìn)作物生長的根際微生物與不同腐熟廢棄物料(普通完全或部分替代泥炭物料研制成的基質(zhì))相結(jié)合，研制成有機(jī)活性育苗生物基質(zhì)，將打破傳統(tǒng)育苗基質(zhì)的配方及工藝，成為提升我國育苗基質(zhì)整體水平的一個重大突破。目前，國內(nèi)已有部分專家在嘗試此方面工作，主要集中在利用AM菌根接種現(xiàn)有基質(zhì)進(jìn)行育苗，雖取得一些成果，但研究均不夠系統(tǒng)深入，也沒有形成大規(guī)模推廣并被廣大農(nóng)民認(rèn)可的產(chǎn)品，因而本專利的研究變得尤為重要。

植物根際促生菌是指定殖于植物根際系統(tǒng)，并能促進(jìn)植物生長的一類微生物總稱。能依靠直接產(chǎn)生信號物質(zhì)，或者提高植物抗性、加速土壤養(yǎng)素循環(huán)等方式促進(jìn)植物生長、提高防病能力、增加作物的產(chǎn)量。因而成為許多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

植物根際(rhizosphere)是一個非常特殊的生態(tài)環(huán)境，是土壤-植物生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)交換的活躍界面，植物進(jìn)行光合作用，將光合產(chǎn)物運(yùn)至地下，促進(jìn)根際微生物的生長和代謝，而根際微生物將有機(jī)態(tài)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為無機(jī)形態(tài)，利于植物吸收，同時，很多根際微生物能分泌促進(jìn)根系生長的促生物質(zhì)、拮抗土傳病原菌的拮抗物質(zhì)。植物根際形成了根際微生物的生境，特定作物根系分泌物造就了特定的土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)。與動物不同，植物生長位點(diǎn)是固定的，植物與其他生物的互作主要依靠分泌的各種化學(xué)信號物質(zhì)。植物通過根系分泌能被土壤微生物識別的信號分子啟動微生物與植物根系的對話，這種對話又反過來使微生物產(chǎn)生一些信號來啟動微生物在根部的定殖。自然條件下，特定作物的根系分泌物被某些有益微生物所愛好，如果我們在育苗的時候能夠?qū)⑦@些特定的針對不同作物根際的功能微生物，?；钐砑拥交|(zhì)中，研制成具有不同功能的活性微生物育苗基質(zhì)，從而進(jìn)一步育出根際帶有大量活性功能微生物的優(yōu)質(zhì)種苗，必定能夠提高該類作物在大田種植中的產(chǎn)量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明第一方面，提供了一種巨大芽孢桿菌QBJP-F6，分離之江蘇省南京市六合區(qū)橫梁街道鐘林村南京秦邦吉品農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司土壤內(nèi)，該巨大芽孢桿菌QBJP-F6已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期為2016年8月22日；保藏號為CGMCC NO.12888。

菌株QBJP-F6在LB平板上菌落為淡黃色，邊緣整齊，表面光滑，凸?fàn)盥∑?。幼齡時期菌落為圓形、突起、表面光滑且有光澤、濕潤、半透明、粘稠、易挑取；隨著培養(yǎng)時間的延長菌落粘性降低，表面光澤變暗，長時間培養(yǎng)變成淺褐色，易挑取。菌體呈桿狀，末端為圓形，單個或呈短鏈排列，能運(yùn)動，大小為(1.0-1.2)μm×(1.2-3.0)μm。能夠液化明膠、水解淀粉、不還原硝酸，能夠在5％NaCl條件能生長。

菌株16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，菌株QBJP-F6與巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium IAM 13418D16273相似性在99.96％以上，結(jié)合生理生化試驗將QBJP-F6鑒定為巨大芽孢桿菌。

本發(fā)明的第二方面，提供了上述巨大芽孢桿菌QBJP-F6在制備功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，將巨大芽孢桿菌QBJP-F6進(jìn)行液體發(fā)酵，將發(fā)酵液接種至普通育苗基質(zhì)中，混合均勻得到功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)，普通育苗基質(zhì)中添加巨大芽孢桿菌QBJP-F6的發(fā)酵液所得，其中，巨大芽孢桿菌QBJP-F6保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.12888。

進(jìn)一步地，普通育苗基質(zhì)中含有機(jī)質(zhì)≥20％，總養(yǎng)分(N+P₂O₅+K₂O)1.5％～7％，水分≤55％，pH值5.5～7.5，Ec≤2.5ms/cm。只要滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的蔬菜育苗基質(zhì)均適用于本發(fā)明。

進(jìn)一步地，巨大芽孢桿菌QBJP-F6的發(fā)酵液通過以下發(fā)酵方法制備：

將巨大芽孢桿菌QBJP-F6接種到PDA培養(yǎng)液中，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的條件為：pH6.0～7.0，發(fā)酵溫度30～35℃，攪拌速度為170～200rpm/min，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵時間為43～50h，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰個/ml；

其中所用PDA培養(yǎng)基配制方法為，以配制1L培養(yǎng)基為例：200g土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min后過濾，濾液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃滅菌20min。

進(jìn)一步地，所述功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)中巨大芽孢桿菌QBJP-F6活菌數(shù)≥2.0×10⁷CFU/g基質(zhì)干重。

進(jìn)一步地，所述蔬菜包括西瓜、黃瓜、辣椒或番茄。

本發(fā)明的第四方面，提供了上述功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)的制備方法，包括如下步驟：

步驟1、制備保藏號為CGMCC NO.12888的巨大芽孢桿菌QBJP-F6發(fā)酵液；

步驟2、將步驟1制備的發(fā)酵液按基質(zhì)干重的2～10v/w％接種到普通育苗基質(zhì)，混合均勻，使其中巨大芽孢桿菌QBJP-F6活菌數(shù)≥2.0×10⁷CFU/g基質(zhì)干重，得到功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)。

進(jìn)一步地，巨大芽孢桿菌QBJP-F6的發(fā)酵液通過以下發(fā)酵方法制備：

將巨大芽孢桿菌QBJP-F6接種到PDA培養(yǎng)液中，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的條件為：pH6.0～7.0，發(fā)酵溫度30～35℃，攪拌速度為170～200rpm/min，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵時間為43～50h，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰個/ml；

其中所用PDA培養(yǎng)基配制方法為，以配制1L培養(yǎng)基為例：200g土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min后過濾，濾液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃滅菌20min。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明分離出了一種巨大芽孢桿菌QBJP-F6，該菌株能夠有效地在種苗根際定殖，菌株具有較強(qiáng)的促生功能，能夠增強(qiáng)所育種苗后期盆栽及田間種植中的生長。將巨大芽孢桿菌QBJP-F6的發(fā)酵液添加到普通育苗基質(zhì)中得到功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)，由于基質(zhì)的良好通透性和優(yōu)質(zhì)保水性，普通基質(zhì)與功能菌QBJP-F6結(jié)合后，能夠大幅度促進(jìn)QBJP-F6的存活能力，從而確保所育種苗根際帶有大量活性功能菌，產(chǎn)品中穩(wěn)定含有2.0×10⁷CFU/g(基質(zhì)干重)以上的活性功能微生物，對蔬菜苗期的促生效果好，能夠顯著促進(jìn)多種蔬菜苗期生長，能夠得到根際帶有大量活性功能微生物的優(yōu)質(zhì)種苗，能夠顯著促進(jìn)所育種苗后期栽培過程中的生長。

附圖說明

圖1為QBJP-F6在LB平板上的菌落形態(tài)。

圖2為基于菌株QBJP-F6的16S rRNA基因序列采用鄰接法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖3為生物基質(zhì)育黃瓜苗的促生效果圖(第一季)。

圖4為生物基質(zhì)育黃瓜苗的促生效果圖(第二季)。

生物材料保藏信息

QBJP-F6，分類命名為巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium；保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC；保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期為2016年8月22日；保藏編號為CGMCC NO.12888。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做更進(jìn)一步地解釋。下列實施例僅用于說明本發(fā)明，但并不用來限定本發(fā)明的實施范圍。

實施例1、菌株的分離及鑒定

取5g土壤于盛有45ml無菌水的三角瓶內(nèi)，在30℃，170r/min條件下的搖床中振蕩20min，制成土壤懸浮液，80度水浴20min后，稀釋成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5等不同梯度稀釋液后涂平板，培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)1d～2d，后挑取單菌落，經(jīng)平板純化后，共挑選12株，分別測定各菌株產(chǎn)植物生長素吲哚乙酸(IAA)的能力(方法參考文獻(xiàn)：Glickmann E,Dessaux Y.A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria.[J].Applied and environmental microbiology,1995,612)。采用同樣的方法，結(jié)果初篩和復(fù)篩，獲得一株促生能力優(yōu)異的菌株QBJP-F6，保存留待進(jìn)一步研究。

如圖1所示，菌株QBJP-F6在LB平板上菌落為淡黃色，邊緣整齊，表面光滑，凸?fàn)盥∑?。幼齡時期菌落為圓形、突起、表面光滑且有光澤、濕潤、半透明、粘稠、易挑??；隨著培養(yǎng)時間的延長菌落粘性降低，表面光澤變暗，長時間培養(yǎng)變成淺褐色，易挑取。菌體呈桿狀，末端為圓形，單個或呈短鏈排列，能運(yùn)動，大小為(1.0-1.2)μm×(1.2-3.0)μm。能夠液化明膠、水解淀粉、不還原硝酸，能夠在5％NaCl條件能生長。

如圖2所示，菌株16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，菌株QBJP-F6與巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium IAM 13418D16273相似性在99.96％以上，結(jié)合生理生化試驗將QBJP-F6鑒定為巨大芽孢桿菌。將QBJP-F6保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2016年8月16日，保藏號為CGMCC NO.12888。

實施例2、功能菌菌液的生產(chǎn)

將菌株QBJP-F6(CGMCC NO.12888)接種至PDA培養(yǎng)液中液體發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的條件為：pH7.0，發(fā)酵溫度為30℃，攪拌速度為170rpm/min，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵時間為48h，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰個/ml；

其中所用PDA培養(yǎng)液配制方法為，以配制1L培養(yǎng)基為例：200g土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min后過濾，濾液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃滅菌20min。

實施例3、功能型生物基質(zhì)研發(fā)

以菌株QBJP-F6為功能菌的生物基質(zhì)育苗效果

基質(zhì)的研發(fā)：將實施例2制備的菌株QBJP-F6發(fā)酵液接種(按基質(zhì)干重的5v/w％接菌，下同)至普通育苗基質(zhì)中，混合均勻?；|(zhì)中功能菌株QBJP-F6采用選擇性培養(yǎng)基計數(shù)，選擇性培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，瓊脂2.0％，去離子水1000mL，pH 7.2-7.4，121℃高壓滅菌20min。1％多粘菌素2mL，1％放線菌酮4mL(抗生素在培養(yǎng)基倒前冷卻后加入)。功能菌QBJP-F6菌落數(shù)以每克基質(zhì)干重計算。經(jīng)計數(shù)，生物基質(zhì)中含功能菌數(shù)約為4.1×10⁷CFU/g。

育苗試驗處理如下：1)普通育苗基質(zhì)(CK2)；2)添加未接菌空白培養(yǎng)液的育苗基質(zhì)(CK1)；3)添加菌株QBJP-F6發(fā)酵液(按基質(zhì)干重的5v/w％接菌，下同)的育苗生物基質(zhì)(QBJP-F6)。將黃瓜種子消毒浸種催芽，露白后，埋入三個處理的基質(zhì)中，每個處理30個重復(fù)。30天左右分別測定相關(guān)生長指標(biāo)：株高、莖粗、SPAD、地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重和地下部干重(表1)。并稀釋涂布計數(shù)各處理中功能菌QBJP-F6在根際的定殖數(shù)量。

同樣的處理，重復(fù)做第二季(表2)。

綜上所述，兩季苗盤育苗試驗中：相比于普通育苗基質(zhì)(CK2)及添加未接菌空白培養(yǎng)基的育苗基質(zhì)(CK1)，添加功能菌研制成的育苗生物基質(zhì)(QBJP-F6)對黃瓜苗的生長有明顯的促生效果。在功能菌方面，兩季苗盤育苗實驗中，添加菌株QBJP-F6發(fā)酵液的育苗生物基質(zhì)所育黃瓜種苗30天左右根際含有功能菌的數(shù)量分別為4.34×10⁷CFU/g、2.74×10⁷CFU/g(根際基質(zhì)干重)。

表1第一季生物基質(zhì)育苗30天對黃瓜苗期生長的影響

表2第二季生物基質(zhì)育苗30天對黃瓜苗期生長的影響