本發(fā)明涉及肉牛育種方法技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種肉牛種牛的早期選擇技術(shù)，尤指一種基于眼肌面積為首選性狀的肉牛早期選種方法。

背景技術(shù)：

肉牛種公牛的選擇對(duì)改良和提高整個(gè)牛群的質(zhì)量尤為重要，種公牛的好壞代表將來(lái)牛群的發(fā)展方向與質(zhì)量。傳統(tǒng)的早期選種方案主要是根據(jù)其父母的遺傳品質(zhì)和個(gè)體本身發(fā)育情況兩方面分階段而定。父母的遺傳品質(zhì)主要是通過(guò)系譜檔案及生產(chǎn)記錄來(lái)進(jìn)行評(píng)定。個(gè)體發(fā)育情況主要是評(píng)價(jià)外貌特征、體重體尺與品種標(biāo)準(zhǔn)的符合度以及后裔表現(xiàn)等。整個(gè)選種工作繁瑣而且周期漫長(zhǎng)。常用肉牛的選擇方法，主要包括單項(xiàng)選擇法、獨(dú)立淘汰法和指數(shù)選擇法等3種方法。

(一)單項(xiàng)選擇法是指逐一選擇所要改良的性狀，即當(dāng)?shù)谝粋€(gè)性狀經(jīng)選擇達(dá)到育種目標(biāo)后，再選擇第二個(gè)性狀，以此類推地選擇下去直到全部性狀都得到改良。這種方法簡(jiǎn)單易行，而且就某一性狀而言，其選擇效果很好。主要缺點(diǎn)是，當(dāng)一次選擇一個(gè)性狀時(shí)，同時(shí)期其他性狀較差的牛仍會(huì)呆在群內(nèi)，影響整個(gè)牛群質(zhì)量。

(二)獨(dú)立淘汰法是指同時(shí)選擇幾個(gè)性狀，分別規(guī)定最低標(biāo)準(zhǔn)，只要有一個(gè)性狀不夠標(biāo)準(zhǔn)，即予淘汰。此法簡(jiǎn)單易行，能收到全面提高選擇效果的作用。但這種方法選擇的結(jié)果，容易將一些只有個(gè)別性狀沒有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，而其他方面都優(yōu)秀的個(gè)體淘汰，而選留下來(lái)的往往是各個(gè)性狀都表現(xiàn)中等的個(gè)體。此法缺點(diǎn)是對(duì)各個(gè)性狀在經(jīng)濟(jì)上的重要性以及遺傳力的高低都沒有給予考慮。

(三)指數(shù)選擇法

指數(shù)選擇法是根據(jù)綜合選擇指數(shù)進(jìn)行選擇。該法運(yùn)用了數(shù)量遺傳學(xué)原理，將要選擇的若干性狀的表型值，根據(jù)它們各自的遺傳力、經(jīng)濟(jì)上重要程度及性狀間的表型相關(guān)和遺傳相關(guān)給予不同的加權(quán)值，而制訂出的一個(gè)可以使個(gè)體間相互比較的數(shù)值。缺點(diǎn)是需要大量的數(shù)據(jù)及各世代的性能記錄來(lái)技術(shù)，數(shù)據(jù)的產(chǎn)生周期比較長(zhǎng)。

隨著人們對(duì)牛肉產(chǎn)品的需求驟增，對(duì)牛的生產(chǎn)性能要求越來(lái)越高，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)肉牛種源的迫切需求，傳統(tǒng)的種牛選擇方法需要牛成年以后，對(duì)外貌、體型、精液品質(zhì)等各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)以后，甚至要通過(guò)對(duì)子代的評(píng)定(后裔測(cè)定)才能對(duì)種牛進(jìn)行詳細(xì)的評(píng)價(jià)，在時(shí)間、工作繁瑣程度等方面限制了種牛的選擇效率。因此，迫切需要一種快速、有效的種牛選擇方法來(lái)加速種牛的選擇過(guò)程，提高選種的準(zhǔn)確率。

肉牛體尺、體重測(cè)定是反應(yīng)肉牛表型特征的一個(gè)直觀的指標(biāo)，直接反應(yīng)了肉牛本身的發(fā)育狀況。肉牛線性評(píng)分時(shí)發(fā)現(xiàn)體尺受品種、性別及年齡的影響較大，只反映了牛的體型及結(jié)構(gòu)情況，并不能很好的說(shuō)明肉牛的肌肉發(fā)育狀況，肉牛線性體型特征，如髻甲、肩部、腰寬、膘厚、大腿肌及民形狀的評(píng)分，是對(duì)肌肉度的直觀評(píng)定，能較客觀的說(shuō)明牛種的肌肉發(fā)育情況，而且肌肉度評(píng)分性狀在品種間的差異極顯著，而受性別的相對(duì)小一些，受年齡的影響更小，因此線性體型評(píng)分中的肌肉度評(píng)分較體尺測(cè)定性狀更能說(shuō)明肉牛的肌肉發(fā)育情況，在無(wú)法進(jìn)行屠宰的情況下，可利用線性評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)估。

王淑輝等(2008)為了對(duì)肉牛進(jìn)行早期選擇并適時(shí)屠宰，該文通過(guò)超聲波活體檢測(cè)技術(shù)獲得6種國(guó)內(nèi)常用肉牛雜交品種和本土品種(60頭)8月齡、22月齡眼肌面積和背膘厚數(shù)據(jù)，集中育肥屠宰后，用50頭幼齡牛和成年牛超聲測(cè)定的眼肌面積、背膘厚及體重建立了成年牛宰后性狀(眼肌面積、背膘厚、產(chǎn)肉性狀(高檔肉質(zhì)量、后部肉質(zhì)量、優(yōu)質(zhì)肉質(zhì)量和胴體質(zhì)量))的數(shù)學(xué)預(yù)測(cè)模型，并對(duì)加入體重資料前后的預(yù)測(cè)模型進(jìn)行檢驗(yàn)分析。結(jié)果表明，屠宰后眼肌面積、背膘厚預(yù)測(cè)模型的決定系數(shù)小于0.75，但產(chǎn)肉性狀預(yù)測(cè)模型的決定系數(shù)均大于0.75，經(jīng)10頭牛數(shù)據(jù)驗(yàn)證，所有模型預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異，說(shuō)明利用超聲波技術(shù)測(cè)得幼齡?；虺赡昱５难奂∶娣e和背膘厚預(yù)測(cè)屠宰后眼肌面積、背膘厚和產(chǎn)肉性狀是可行的。傳統(tǒng)的選種過(guò)程中父母的遺傳品質(zhì)主要是通過(guò)系譜檔案及生產(chǎn)記錄來(lái)進(jìn)行評(píng)定。隨著基因標(biāo)記的廣泛研究與應(yīng)用，其在種牛遺傳評(píng)價(jià)中發(fā)揮了不可替代的積極作用。分子標(biāo)記技術(shù)已成為21世紀(jì)牛遺傳改良的重要手段和方法，特別是良種選育，標(biāo)記輔助選擇可以在肉牛的生命早期開始，不必等生產(chǎn)性能完全表現(xiàn)出來(lái)就對(duì)生產(chǎn)性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，預(yù)測(cè)后期種用價(jià)值?？梢栽趦尚灾型瑫r(shí)選擇任何生產(chǎn)性狀，突破了限性性狀只能從單種性狀選擇的局限，可用于合并兩個(gè)或更多品種的優(yōu)良生產(chǎn)性狀座位，可在品種內(nèi)選擇改良。比如說(shuō)在肉質(zhì)要求不斷提高的今天，研究心臟脂肪酸結(jié)合蛋白基因?qū)εＨ獾哪鄱?、大理石花紋的調(diào)控機(jī)理，對(duì)肉牛高檔肉、雪花肉等生產(chǎn)潛力提前預(yù)測(cè)，對(duì)于培育我國(guó)的高檔肉牛品種有著重要的意義。MAS縮短了世代間隔，提高了選擇強(qiáng)度，增加了選擇的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳幼春，曹紅鶴。肉用牛線性體形評(píng)分法[J]。現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，1995(3):9-9。

[2]陳幼春。現(xiàn)代肉牛生產(chǎn)[M]。中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2012。

[3]吳企勝，李正萱。肉用種公牛外貌評(píng)定方法初探[J]。中國(guó)畜牧雜志，1998，34(4):39-40。

[4]Goyache F,Jjdel C,Quevedo J R,et al.Using artificial intelligence to design and implement a morphological assessment system in beef cattle.[J].Animalence,2001,73(4):49-60。

[5]魏成斌，施巧婷，馮亞杰等。肉牛背膘與眼肌的超聲波活體測(cè)定操作方法[C]。中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)——中國(guó)獸醫(yī)臨床大會(huì)。2010。

[6]王淑輝，許尚忠，周正奎等，用超聲波活體檢測(cè)建立肉牛宰后性狀的預(yù)測(cè)模型[J]。農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008,24(2):237-240。

[7]陳宏，黃永震，周揚(yáng)等。中國(guó)肉牛育種技術(shù)演變[J]。中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2015,41(4):1-4。

[8]吳常信。動(dòng)物育種中數(shù)量性狀選擇方法進(jìn)展[J]。中國(guó)家禽。2015,37(13):1-4。

[9]桑國(guó)俊。肉牛DNA標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)[J]。畜牧獸醫(yī)雜志。2012,31(1):41-43。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于眼肌面積為首選性狀的肉牛早期選種方法，解決傳統(tǒng)育種技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中育種效果不佳的問(wèn)題。提早選種時(shí)間，加快遺傳進(jìn)展。本發(fā)明中，延黃牛、草原紅牛的眼肌面積遺傳力分別為0.63和0.65；6月齡眼肌面積與不同月齡的體重、眼肌面積和凈肉量均呈較強(qiáng)的遺傳相關(guān)(0.657-0.715)，證明了眼肌面積可以作為肉用性狀早期選擇的典型指標(biāo)，進(jìn)而以眼肌面積來(lái)評(píng)價(jià)種牛的肉用性能。本發(fā)明基于考慮各項(xiàng)指標(biāo)的全面性與可行性，根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重，本發(fā)明創(chuàng)立了以眼肌面積為首選性狀的早期選種技術(shù)體系，在早選體系中強(qiáng)調(diào)眼肌面積、基因標(biāo)記、體重指數(shù)、體尺指數(shù)、外貌指數(shù)5個(gè)性狀指標(biāo)的綜合值，根據(jù)各個(gè)性狀指標(biāo)所占比例綜合評(píng)分，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)提前選擇種牛的目的，縮短選擇時(shí)間，增加選種的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明的上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

基于眼肌面積為首選性狀的肉牛早期選種方法，包括如下步驟：

(1)利用超聲波技術(shù)對(duì)待測(cè)犢牛進(jìn)行眼肌面積檢測(cè)，計(jì)算眼肌面積數(shù)值；

(1.1)在待選犢牛群體中對(duì)犢牛進(jìn)行保定，以確保其自然站立；在將動(dòng)物移至保定架或保定欄的過(guò)程中，要避免產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)；

(1.2)測(cè)量時(shí)探頭放上耦合劑，剪掉測(cè)量部位毛，探頭直接放在體表；腰肌面積在橫斷面第十二、十三肋間測(cè)量，腰肌面積是一個(gè)圓周測(cè)量；在識(shí)別超聲影像時(shí)首先確定皮膚界面、脂間結(jié)締組織和背最長(zhǎng)肌肌膜所產(chǎn)生的3～4條強(qiáng)回聲影帶，然后確定眼肌四周肌膜的強(qiáng)回聲影像，以確定眼肌面積周界；觀察并調(diào)節(jié)屏幕影像，調(diào)節(jié)灰度、對(duì)比度、增益度，使近場(chǎng)增大，遠(yuǎn)場(chǎng)減小，獲得理想影像時(shí)即凍結(jié)影像，并加注說(shuō)明資料影像打印或存貯處理；圖像讀取時(shí)先確定上下界即橢圓短軸，然后確定兩端界點(diǎn)即為橢圓長(zhǎng)軸；此時(shí)屏幕上顯示的平方厘米值就是近似橢圓形的眼肌的面積；

(2)利用HRM技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行基因分型；

(2.1)設(shè)計(jì)目標(biāo)基因序列的擴(kuò)增引物，確立最佳PCR反應(yīng)條件；

(2.2)進(jìn)行HRM分型，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化曲線區(qū)分出不同的基因型，然后從每個(gè)基因型中選取2-3個(gè)樣品進(jìn)行普通的PCR擴(kuò)增；

(2.3)PCR產(chǎn)物回收、測(cè)序，判斷目標(biāo)基因型；

(3)待選牛體重測(cè)定；

為空腹24小時(shí)后的體重；

(4)待選牛體尺測(cè)量；

體尺測(cè)量指標(biāo)涉及體長(zhǎng)、胸圍；

(5)依照牛體型外貌評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)待選牛外貌進(jìn)行評(píng)分；

(6)根據(jù)上述步驟(1)至步驟(5)的測(cè)定結(jié)果，建立早選指數(shù)計(jì)算公式；

早選指數(shù)ESI＝眼肌面積×0.35+基因標(biāo)記×0.25+體重指數(shù)×0.20+體軀指數(shù)×0.15+外貌指數(shù)×0.05；結(jié)合上述5項(xiàng)指標(biāo)的加權(quán)值，依據(jù)早選指數(shù)公式

得出早選指數(shù)值，然后根據(jù)早選指數(shù)進(jìn)行排序，選留數(shù)值高的個(gè)體；公式中，P_n為該性狀的個(gè)體表型值，為該性狀的個(gè)體表型值的平均值，w_i為個(gè)體性狀的經(jīng)濟(jì)重要性，h²為遺傳力。

步驟(2.1)所述的設(shè)計(jì)目標(biāo)基因序列的擴(kuò)增引物，確立最佳PCR反應(yīng)條件，具體是：

H-FABP基因5‘UTR上游引物序列：5’-TCTGCGTCTTTCCCAACCTA-3’

H-FABP基因5‘UTR下游引物序列：5’-GGCTCCCCAACCT GAC-3’

通過(guò)梯度PCR試驗(yàn)確定最佳試驗(yàn)溫度，在200μL的PCR離心管中加入PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系：2×PCR mix 10μL，上下游引物各0.2μL，DNA 0.5μL，用雙蒸水ddH2O補(bǔ)齊至20μL；其中，2×PCR mix表示2倍PCR反應(yīng)體系混合溶液；

將PCR管置于PCR儀中，設(shè)定反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4min；95℃變性40s；設(shè)置55℃-65℃梯度退火30s；70℃延伸30s，從第二步開始35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存；取5μL PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后，用濃度為1％瓊脂糖凝膠在1×TAE中電泳檢測(cè)30min；根據(jù)條帶亮度及清晰度確定最終退火溫度；其中，6×上樣緩沖液表示6倍上樣緩沖液；1×TAE緩沖液的配置：先配置50×TAE緩沖液:Tris 242g，冰乙酸57.1m1,0.5M EDTA(pH 8.0)100m1，加水至1000ml，然后稀釋50倍以后即可得到1×TAE緩沖液；

在96孔PCR管中加入HRM反應(yīng)擴(kuò)增體系：取2×Master Mix 10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl2 2μL(2.5mM)，DNA 1μL(試驗(yàn)前將DNA稀釋至50ng/μL)，用ddH₂O補(bǔ)齊至20μL；其中，2×Master Mix表示2倍熒光定量PCR反應(yīng)體系混合溶液；MgCl₂ 2μL(2.5mM)表示2.5毫摩爾每升的MgCl₂溶液2微升；

冰上操作，充分混勻后封膜離心30s，放入熒光定量PCR儀；

PCR反應(yīng)條件為：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，從第二步開始45個(gè)循環(huán)；95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后溫度以5℃/s的速率從65℃遞增到95℃，最后溫度降到40℃。

步驟(2.2)所述的進(jìn)行HRM分型，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化曲線區(qū)分出不同的基因型，然后從每個(gè)基因型中選取2-3個(gè)樣品進(jìn)行普通的PCR擴(kuò)增，具體是：

在200μL的PCR離心管中加入PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer with MgCl2 6.25μL，dNTP Mixture(10mm)2.25μL，下游引物各1μL，Taq DNA polymerase(2U/μL)1.5μL，DNA 1μL，最后用ddH₂O補(bǔ)齊至50μL；其中，10×PCR Buffer with MgCl₂表示含有MgCl₂的10倍PCR緩沖液；dNTP Mixture(10mM)表示10毫摩爾每升的dNTP混合液；Taq DNA polymerase(2U/μL)表示2單位每微升的taqDNA酶；ddH₂O表示雙蒸水；

將PCR管置于PCR儀中，設(shè)定反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4min；95℃變性40s；退火30s；70℃延伸30s，從第二步開始35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存；取5μL PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后，用1％瓊脂糖凝膠在1×TAE中電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物清晰且與預(yù)期大小一致的個(gè)體為符合要求個(gè)體。

步驟(2.3)所述的PCR產(chǎn)物測(cè)序，判斷目標(biāo)基因型，具體是：取每個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物10μL送測(cè)序公司測(cè)序；測(cè)序后，結(jié)合測(cè)序結(jié)果與分型的HRM標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(附圖3)作為基因分型的判斷依據(jù)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線圖進(jìn)行HRM基因分型，而后進(jìn)行后期的計(jì)算。

本發(fā)明的有益效果在于：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以眼肌面積為首選性狀，綜合考慮了影響種牛評(píng)價(jià)的各項(xiàng)因素，制定了綜合選擇指數(shù)。綜合考慮多個(gè)性狀的評(píng)價(jià)，避免了錯(cuò)留單一性狀高而其它性狀低的個(gè)體，提高了整體的質(zhì)量；綜合選擇對(duì)各個(gè)性狀在經(jīng)濟(jì)上的重要性以及遺傳力的高低都予以了充分考慮，經(jīng)智能選擇后避免了優(yōu)秀個(gè)體因某一性狀而淘汰；以眼肌面積和基因標(biāo)記為主導(dǎo)，可以在6月齡時(shí)進(jìn)行提前評(píng)定、選擇，降低了選種周期，增加了準(zhǔn)確性。依據(jù)綜合選擇指數(shù)對(duì)種牛進(jìn)行早期選擇，縮短了世代間隔，進(jìn)而提高了育種效率，后備種牛初選時(shí)間從18月齡提前到了6月齡，提早1年。對(duì)整個(gè)肉牛育種領(lǐng)域的早期選種提供了實(shí)踐依據(jù)。實(shí)用性強(qiáng)。

附圖說(shuō)明

此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。

圖1為本發(fā)明的眼肌面積檢測(cè)示意圖；

圖2為本發(fā)明的H-FABP基因PCR電泳檢測(cè)圖(擴(kuò)增產(chǎn)物251bp)；

圖3為本發(fā)明的H-FABP基因HRM曲線圖及不同基因型對(duì)應(yīng)測(cè)序結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容及其具體實(shí)施方式。

參見圖1至圖3所示，本發(fā)明的基于眼肌面積為首選性狀的肉牛早期選種方法，在待選犢牛群體中：

(1)利用超聲波技術(shù)對(duì)待測(cè)犢牛進(jìn)行眼肌面積檢測(cè)，計(jì)算眼肌面積數(shù)值；

(1.1)對(duì)犢牛進(jìn)行保定，以確保其自然站立。在將動(dòng)物移至保定架或保定欄的過(guò)程中，要盡量減少產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。

(1.2)測(cè)量時(shí)探頭放上耦合劑，剪掉測(cè)量部位毛，探頭直接放在體表。腰肌面積在橫斷面第十二、十三肋間測(cè)量，腰肌面積是一個(gè)圓周測(cè)量。在識(shí)別超聲影像時(shí)首先確定皮膚界面、脂間結(jié)締組織和背最長(zhǎng)肌肌膜所產(chǎn)生的3～4條強(qiáng)回聲影帶，然后確定眼肌四周肌膜的強(qiáng)回聲影像，以確定眼肌面積周界。觀察并調(diào)節(jié)屏幕影像，適當(dāng)調(diào)節(jié)灰度、對(duì)比度、增益度，盡量使近場(chǎng)增大，遠(yuǎn)場(chǎng)減小，獲得理想影像時(shí)即凍結(jié)影像，并加注說(shuō)明資料影像打印或存貯處理。圖像讀取時(shí)先確定上下界即橢圓短軸，然后確定兩端界點(diǎn)即為橢圓長(zhǎng)軸。此時(shí)屏幕上顯示的平方厘米值就是近似橢圓形的眼肌的面積。如圖1所示。

(2)利用HRM技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行基因分型；

設(shè)計(jì)目標(biāo)基因序列的擴(kuò)增引物，確立最佳PCR反應(yīng)條件。

進(jìn)行HRM分型，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化曲線區(qū)分出不同的基因型，然后從每個(gè)基因型中選取2-3個(gè)樣品進(jìn)行普通的PCR擴(kuò)增。

PCR產(chǎn)物回收、測(cè)序，判斷目標(biāo)基因型。

以H-FABP基因?yàn)槔?，本部分檢測(cè)通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

H-FABP基因5‘UTR上游引物序列：5’-TCTGCGTCTTTCCCAACCTA-3’

H-FABP基因5‘UTR下游引物序列：5’-GGCTCCCCAACCT GAC-3’

通過(guò)梯度PCR試驗(yàn)確定最佳試驗(yàn)溫度，在200μL的PCR離心管中加入PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系：2×PCR mix 10μL，上下游引物各0.2μL，DNA 0.5μL，用雙蒸水ddH₂O補(bǔ)齊至20μL；其中，2×PCR mix表示2倍PCR反應(yīng)體系混合溶液；

將PCR管置于PCR儀中，設(shè)定反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4min；95℃變性40s；設(shè)置55℃-65℃梯度退火30s；70℃延伸30s，從第二步開始35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存；取5μL PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后，用濃度為1％瓊脂糖凝膠在1×TAE中電泳檢測(cè)30min；根據(jù)條帶亮度及清晰度確定最終退火溫度；其中，6×上樣緩沖液表示6倍上樣緩沖液；1×TAE緩沖液的配置：先配置50×TAE緩沖液:Tris 242g，冰乙酸57.1m1,0.5M EDTA(pH 8.0)100m1，加水至1000ml，然后稀釋50倍以后即可得到1×TAE緩沖液；

在96孔PCR管中加入HRM反應(yīng)擴(kuò)增體系：取2×Master Mix 10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl2 2μL(2.5mM)，DNA 1μL(試驗(yàn)前將DNA稀釋至50ng/μL)，用ddH₂O補(bǔ)齊至20μL；其中，2×Master Mix表示2倍熒光定量PCR反應(yīng)體系混合溶液；MgCl₂ 2μL(2.5mM)表示2.5毫摩爾每升的MgCl₂溶液2微升；

冰上操作，充分混勻后封膜離心30s，放入熒光定量PCR儀。

PCR反應(yīng)條件為：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，從第二步開始45個(gè)循環(huán)。95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后溫度以5℃/s的速率從65℃遞增到95℃，最后溫度降到40℃。

反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)HRM標(biāo)準(zhǔn)化曲線區(qū)分出三種不同的基因型(見附圖3)，然后從每個(gè)基因型中選取2-3個(gè)樣品進(jìn)行普通的PCR擴(kuò)增。

在200μL的PCR離心管中加入PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer with MgCl2 6.25μL，dNTP Mixture(10mm)2.25μL，下游引物各1μL，Taq DNA polymerase(2U/μL)1.5μL，DNA 1μL，最后用ddH₂O補(bǔ)齊至50μL；其中，10×PCR Buffer with MgCl₂表示含有MgCl₂的10倍PCR緩沖液；dNTP Mixture(10mM)表示10毫摩爾每升的dNTP混合液；Taq DNA polymerase(2U/μL)表示2單位每微升的taqDNA酶；ddH₂O表示雙蒸水。

將PCR管置于PCR儀中，設(shè)定反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4min；95℃變性40s；退火30s；70℃延伸30s，從第二步開始35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。取5μL PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后，用1％瓊脂糖凝膠在1×TAE中電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物清晰且與預(yù)期大小一致的個(gè)體為符合要求個(gè)體，取10μLPCR產(chǎn)物送測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序后，結(jié)合測(cè)序結(jié)果與分型的HRM標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(附圖3)作為基因分型的判斷依據(jù)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線圖進(jìn)行HRM基因分型，而后進(jìn)行后期的計(jì)算。

(3)待選牛體重測(cè)定；

測(cè)定空腹24小時(shí)后的犢牛體重，利用地磅、稱重籠在同一時(shí)間測(cè)三次，取平均值。

(4)待選牛體尺測(cè)量；

犢牛自然站立，測(cè)定胸圍、體長(zhǎng)指標(biāo)，做好記錄。

體長(zhǎng)：肩端至坐骨端的距離，測(cè)三次取平均值。

胸圍：肩腳后角處體軀的垂直周徑，測(cè)三次取平均值。

(5)依照牛體型外貌評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)待選牛外貌進(jìn)行評(píng)分

根據(jù)外貌線性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)外貌進(jìn)行評(píng)分，并記錄。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見附表1。

(6)早選指數(shù)計(jì)算、排序

根據(jù)步驟(1)至步驟(5)測(cè)定結(jié)果，各性狀表型值進(jìn)行加權(quán)(個(gè)體表型值/群體均值，基因標(biāo)記以基因型頻率為表型值)，按照“早選指數(shù)ESI＝眼肌面積×0.35+基因標(biāo)記×0.25+ 體重指數(shù)×0.20+體軀指數(shù)×0.15+外貌指數(shù)×0.05”進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)所得數(shù)值進(jìn)行排序，根據(jù)排序結(jié)果對(duì)待選種牛進(jìn)行取舍。

實(shí)施例1：對(duì)10頭6月齡草原紅牛進(jìn)行早期選種，實(shí)現(xiàn)如下：

按照上述方法測(cè)定眼肌面積、基因標(biāo)記、體重、體尺、外貌評(píng)分5項(xiàng)指標(biāo)。

據(jù)各指標(biāo)進(jìn)行綜合計(jì)算、比較。

首先設(shè)定：眼肌面積(EMA)的經(jīng)濟(jì)重要性w_i為：0.35，遺傳力h²為：0.621；體重(BW)的經(jīng)濟(jì)重要性w_i為：0.20，遺傳力h²為：0.614；體軀指數(shù)(BT)指數(shù)的經(jīng)濟(jì)重要性w_i為：0.15，遺傳力h²為：0.423；FA的經(jīng)濟(jì)重要性w_i為：0.05，遺傳力h²為：0.206；基因型取值A(chǔ)A為1，AB為0.5，BB為0；體軀指數(shù)(BT)＝胸圍(CW)/體長(zhǎng)(BL)×100。

使用R project開源軟件，版本號(hào)為3.3.2(https://www.r-project.org/)，進(jìn)行編程計(jì)算ESI指數(shù)。Num＝個(gè)體數(shù)，編號(hào)分別為N1,N2…N10…，EMA,BW,BL,CW,FA分別是表型性狀值，GENO為基因型，ESI值即為公式中的I值

計(jì)算公式如下：

公式中，P_n為該性狀的個(gè)體表型值，為該性狀的個(gè)體表型值的平均值，w_i為個(gè)體性狀的經(jīng)濟(jì)重要性，h²為遺傳力。

早選指數(shù)計(jì)算結(jié)果：14.126375，12.123034，11.543484，9.893413，13.766669，11.381278，13.348411，12.411759，14.334776，11.651005；根據(jù)指數(shù)計(jì)算結(jié)果按牛號(hào)個(gè)體排序：9、1、5、7、8、2、10、3、6、4，也就是說(shuō)按照這個(gè)結(jié)果個(gè)體9的指數(shù)最高、個(gè)體4的指數(shù)最低。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡對(duì)本發(fā)明所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

附表1種牛體型評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

來(lái)源：全國(guó)肉牛遺傳改良計(jì)劃——肉牛性能測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。