本發(fā)明涉及一種從環(huán)境樣品中提取純化和檢測大腸桿菌的方法，屬于生物技術領域。

背景技術：

隨著科技的進步，pcr技術逐漸被應用到環(huán)境微生物中特定細菌的檢測中，如土壤、未經(jīng)處理的生活廢棄物、醫(yī)院廢棄物、工廠廢棄物、垃圾和人畜糞便以及大氣中的漂浮物和氣溶膠等環(huán)境中的微生物檢測。

隨著規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖場數(shù)量的增加，畜禽的糞便和污水排放量劇增，環(huán)境污染問題越來越突出，一些致病性微生物如豬副豬嗜血桿菌、沙門桿菌等混跡其間，將對人畜健康造成極大的危害，也會給養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展帶來無法估量的經(jīng)濟損失。因此，需要對養(yǎng)殖場環(huán)境病原微生物進行實時監(jiān)測，以防止動物疫病的爆發(fā)與蔓延。

迄今，對病原菌的檢測和鑒定大多采用傳統(tǒng)的方法，即對病料進行病原培養(yǎng)分離，配合血清型鑒定來診斷畜禽疾病。該方法雖然比較準確，但耗時費力，鑒定時間長(一般需要2～4天)，易受細菌生理條件和抗生素使用限制，常導致培養(yǎng)假陰性，很難滿足臨床要求。

pcr技術以其敏感性強，特異性好，檢測時間短等特點被廣泛應用于許多病原菌的快速鑒定。但對于環(huán)境中的病原菌而言，環(huán)境中存在大量干擾物質(zhì)影響pcr檢測，如腐殖質(zhì)等。所以傳統(tǒng)的解決辦法就是采用去除腐殖質(zhì)試劑對樣品進行洗滌，去除腐殖質(zhì)，然后用裂解試劑裂解環(huán)境中的細菌，析出dna復合物，用蛋白酶去除dnp中的蛋白質(zhì)，析出dna，再經(jīng)純化，洗滌作為dna檢測的樣品試劑。此類方法存在繁瑣的dna的提取純化過程，且常常會導致提取失敗。目前市場上有針對具體病原菌dna提取的試劑盒，但步驟繁多，且價格昂貴，難以推廣進行日常使用。

菌落pcr因為不用提取細菌dna而直接進行檢測而廣受追捧，但如何提取純化能直接用于pcr檢測的環(huán)境樣品中的病原菌，仍然是一個很難解決的問題。

因此，在生產(chǎn)實踐中，亟需快速檢測鑒定技術來幫助廣大基層獸醫(yī)工作者來快速診斷檢測，為盡早防治病原菌的侵襲提供寶貴的時間。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種檢測環(huán)境樣品中大腸桿菌的方法，它包括如下步驟：

(1)從環(huán)境樣品中提取純化總細菌，重懸菌液備用；

(2)將重懸菌液直接上機進行菌落pcr擴增大腸桿菌的任一段特定的dna序列，用于擴增的上游引物序列如seqno.1所示，下游引物序列如seqno.2所示；

(3)檢測擴增產(chǎn)物，與陽性對照比較，判斷提取純化的總細菌中是否含有大腸桿菌。

本方法可用于多種環(huán)境中的大腸桿菌的檢測，如土壤、未經(jīng)處理的生活廢棄物、醫(yī)院廢棄物、工廠廢棄物、垃圾和人畜糞便以及大氣中的漂浮物和氣溶膠等環(huán)境中微生物的提取純化。本發(fā)明一個具體實施方式中，用于檢測的環(huán)境樣品為養(yǎng)殖環(huán)境中的糞樣、墊草、墊土(即土壤)。

seqno.1和seqno.2所示的堿基序列為：

seqno.1：5’-gggagcaaacaggattaga-3’，

seqno.2：5’-agggccatgatgacttga-3’。

進一步地，總細菌的提取方法包括如下步驟：

(1)取環(huán)境樣品，加入水或緩沖液，混勻；

(2)加入苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，待溶劑分層，移取上層備用；

(3)將移取的上層進行離心，棄上清，保留沉淀；

(4)將沉淀洗滌至基本無色，用水或緩沖液重懸菌液即可。

所述“溶劑分層”，是指步驟(2)引入的有機溶劑與步驟(1)中引入的水或緩沖液，由于兩者不能完全互溶而分為兩層(也可以稱為兩相)，本發(fā)明中取上層(主要是水相)。但有機溶劑與水或緩沖液可能會有一定互溶比例，因此，不排除各相溶劑中均含有一定量的有機溶劑和水。本發(fā)明中溶劑分層，可以采取多種方式，如靜置、離心等。

優(yōu)選地，加入環(huán)境樣品中或重懸沉淀的為pbs緩沖液。

優(yōu)選地，步驟(2)中，苯酚-氯仿-異戊醇混合液中，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1～100:24:1。

優(yōu)選地，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1。

優(yōu)選地，步驟(4)中，洗滌液為tenpp緩沖液，tenpp緩沖液組成為：50mmol/ltris，20mmol/ledta，100mmol/lnacl，1％pvpp，ph10.0。

本發(fā)明還提供了一種檢測大腸桿菌的試劑盒，包括序列如seqno.1和seqno.2所示的引物對，擴增來自大腸桿菌的基因。

本發(fā)明進一步提供了seqno.1和seqno.2所示的核苷酸序列的用途，可用于擴增或擴增后檢測來自大腸桿菌的基因。

優(yōu)選地，加入環(huán)境樣品中和重懸沉淀(總細菌)的水為無菌水(如ddh2o)或無菌生理鹽水，緩沖液為pbs緩沖液或tris-hcl緩沖液。

進一步優(yōu)選地，加入環(huán)境樣品中和重懸沉淀(總細菌)的為pbs緩沖液，其效果略優(yōu)于水和其他緩沖液。

優(yōu)選地，環(huán)境樣品和pbs緩沖液的質(zhì)量體積比為1g：3ml。

優(yōu)選地，步驟(2)中，加入的苯酚-氯仿-異戊醇混合液與pbs緩沖液的體積比為5:3。

通常洗滌3～5次沉淀即可洗至基本無色，重懸菌液可用無菌水或各種常用的緩沖液，如pbs緩沖液，tris緩沖液等。

優(yōu)選地，上述需離心的各步驟中，離心轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心時間為2～5min。

若環(huán)境中的總細菌較少，或為了提高本發(fā)明方法的檢測靈敏度，可在步驟(2)移取上層后向下層樣品(主要是有機相)中再加入pbs緩沖液，混勻，離心，移取上清備用；此步驟可再重復1～2次；合并前面移取的上層，然后進行步驟(3)及后面的操作。

本發(fā)明方法利用特定配比的有機溶劑、水或緩沖液將細菌從環(huán)境樣品中提取出來，再通過洗滌進一步純化，可用于快速高效地提取純化環(huán)境樣品中的總細菌，繼而用于pcr檢測。

環(huán)境中的總細菌既包括革蘭氏陰性菌，又包括革蘭氏陽性菌，二者的主要區(qū)別在于細胞壁。革蘭氏陽性菌不能通過熱裂解來直接進行菌落pcr檢測，還需要用蛋白酶對細胞壁進行破壁，析出細菌dna，再進行pcr檢測，類似于傳統(tǒng)pcr檢測方法。本發(fā)明提取純化的總細菌中，雖含有革蘭氏陽性菌，但在后續(xù)pcr實驗過程中，不引入其他的裂解步驟，革蘭氏陽性菌的存在對革蘭氏陰性菌的菌落pcr檢測方法并無影響。所以，本發(fā)明方法特別適合用于環(huán)境樣品中的革蘭氏陰性菌的pcr檢測。

本發(fā)明利用特定序列的引物對，檢測重復性好，靈敏高，特異性好。

附圖說明

圖1苯酚-氯仿-異戊醇濃度篩選實驗結(jié)果圖

圖2墊土中大腸桿菌菌落pcr檢測圖

具體實施方式

下面以具體實施例的方式對本發(fā)明進一步進行說明，但不應理解為對本發(fā)明的限制。

材料與試劑

(1)所用菌株

腸毒性大腸桿菌cvcc196購至中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

(2)主要試劑

2×pcrmix、marker、苯酚、氯仿、異戊醇、pbs緩沖液，pvpp等，均購自tiangen公司；土壤dna提取試劑盒、細菌總dna提取試劑盒(用于墊草中細菌dna提取)購自omega公司，其他試劑均為分析純。

(3)引物：

表1引物序列表

由英駿生物技術有限公司合成。

實施例1苯酚-氯仿-異戊醇混合液配比的篩選

1材料：

待檢細菌：大腸桿菌cvcc196；載體：土壤。

2實驗方法：

以空白樣品為陰性對照(第1組)，同時采用相應dna提取試劑盒為陽性對照(第2組)。

實驗組共有7組，苯酚-氯仿-異戊醇配比(體積比)分別為：第3組100:0:0；第4組100:24:1；第5組：75:48:2；第6組25:24:1；第7組50:72:3；第8組25:96:4；第9組0:24:1。各組采用相同的細菌起始濃度，3×10⁶cfu/g。

將待檢細菌加入土壤中，然后用本發(fā)明方法從混有細菌的土壤中將細菌提取純化出來，進行菌落pcr檢測。

具體過程為：稱取0.1g墊土于1mlep管中，加入300μlpbs緩沖液(ph7.2～7.4，nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l)，渦旋混勻，加入苯酚-氯仿-異戊醇500ml，渦旋混勻，12000rpm離心2～5min，移取上層于另一干凈滅菌ep管中。再加入300μlpbs緩沖液，渦旋混勻，12000rpm離心2～5min，移取上層于上次的ep管中，重復一次上述操作，合并三次的上層。將合并的菌液(上層)12000rpm離心5min，棄上清。將沉淀用500μltenpp緩沖液(20mmol/ledta，50mmol/ltris,1％pvpp，100mmol/lnacl，ph10.0)洗滌3～5次至上清基本無色。用50μlddh2o重懸菌液。取此菌液1μl進行后續(xù)pcr檢測。

pcr反應體系及條件：

反應體系(25μl)：2×pcrmix12.5μl，模板1μl，上、下游引物各1μl，用ddh2o補足至25μl。反應條件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，共30個循環(huán)；72℃10min。

凝膠電泳檢測：

pcr產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3實驗結(jié)果

如圖1所示(lanem為marker，lane1為陰性對照，lane2為陽性對照，lane3-9為不同有機相配比，分別為100:0:0，100:24:1，75:48:2，25:24:1，50:72:3，25:96:4，0:24:1。)第3、4、5、6、7組和陽性對照組都能檢出大腸桿菌的條帶。而酚配比高時，有機相與水相分層不好，不利于操作，所以最佳有機相配比為25:24:1。

實施例2pcr擴增及凝膠電泳法檢測養(yǎng)殖場環(huán)境樣品中提取純化的病原菌

1.材料：

1.1所用菌株：大腸桿菌cvcc196。

1.2環(huán)境載體：土壤(墊土)。

1.2引物，見表1：

2、方法：

2.1pcr反應體系及條件

反應體系(25μl):2×pcrmix12.5μl，模板1μl，上、下游引物各1μl，用ddh2o補足至25μl。反應條件:94℃5min；94℃30s，55℃30s(布氏桿菌采用60℃30s)，72℃1min，共30個循環(huán)；72℃10min。

2.2凝膠電泳檢測

pcr產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.4本發(fā)明方法提取純化大腸桿菌用于pcr檢測的有效性和敏感性試驗

將大腸桿菌cvcc196新鮮菌液計數(shù)后進行10倍系列稀釋，取1×10⁰，1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7稀釋度各10μl加入0.1g土壤樣品中，用本發(fā)明實施例1的方法提取純化總細菌(酚-氯仿-異戊醇配比為25:24:1)，并檢測pcr敏感性。以空白樣品為陰性對照，同時采用相應dna提取試劑盒為陽性對照，對比本發(fā)明方法的有效性和敏感性。

2.結(jié)果

如圖2所示，本方法能從環(huán)境樣品中提取出這些細菌，完成菌落pcr檢測。

圖中l(wèi)anem為marker，marker條帶從上到下為2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。lane1-8為采用本發(fā)明方法進行的pcr檢測結(jié)果。lane9-16為采用標準dna提取試劑盒提取dna后進行pcr檢測結(jié)果。lane1、lane9為標準菌液，lane2-8和lane10-16的對應菌液濃度相同。lane8和lane16的墊土中大腸桿菌濃度為3×10⁷cfu/g，lane8-2為10倍濃度稀釋，lane2和lane10為30cfu/g。

圖2結(jié)果表明，本發(fā)明方法能從環(huán)境研品種提取檢測到大腸桿菌的濃度下限為3×10⁵cfu/g，和市售泥土dna提取試劑盒檢測結(jié)果相當。

上述表明，本發(fā)明方法簡化了pcr檢測的前處理步驟，省去了繁瑣的dna提取步驟，直接用本方法處理得到的稀釋菌液或菌落為模板，采用特定序列的引物對進行pcr擴增，重復性好，靈敏高，特異性好，檢測時間短，節(jié)省人力物力，大大降低了檢測成本。

sequencelisting

<110>四川省畜牧科學研究院

<120>一種從環(huán)境樣品中提取純化和檢測大腸桿菌的方法

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<213>上游引物

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<212>dna

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<400>2

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