本發(fā)明涉及腫瘤診斷、治療、預測預后領域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測clic3異常為手段的腫瘤診斷、預測預后方法；及激活clic3基因或蛋白質的腫瘤治療劑。

背景技術：

肺癌是嚴重威脅人類生命和健康的重大疾病。2011年世界衛(wèi)生組織(who)國際癌癥研究機構iarc公布的2008全球統計資料結果顯示：肺癌是發(fā)病率和死亡率都高居榜首的惡性腫瘤。每年全球新發(fā)病例數160.8萬，死亡病例數137.7萬，占全部惡性腫瘤的12.7％和18.2％。美國癌癥協會公布的統計結果顯示：預計在2012年，美國新發(fā)肺癌病例數將達到22.6萬，因肺癌死亡病例數將達到16萬。在我國，由衛(wèi)生部主持的全國第三次死因回顧抽樣調查結果顯示：肺癌為樣本地區(qū)惡性腫瘤死亡原因之首，粗死亡率為30.83/10萬，其中男性41.34/10萬，女性19.84/10萬；在男性、女性中均為首位癌癥死亡原因。隨著全球老齡化的加速和環(huán)境污染加劇等因素，肺癌發(fā)病必將繼續(xù)呈上升趨勢，因此，對肺癌的診斷治療研究的進展需求，必定越來越強烈。

腫瘤標記物是指腫瘤細胞或者組織由于癌基因或其他腫瘤相關基因及其產物異常表達所產生的生物活性物質或其本身由癌組織脫落，而在正常組織或良性疾病時有一定程度表達或產量甚微。它反映了癌的發(fā)生發(fā)展過程，可在腫瘤患者組織、體液及排泄物中檢出，廣泛應用于腫瘤的診斷，監(jiān)測復發(fā)、轉移，預后，預測療效等。目前已經應用于肺癌臨床輔助診斷的標記物只有蛋白標記物，如cea、ca125、cyfra21-1、雖然目前以上蛋白標記物已經用于肺癌的輔助診斷，但其診斷效率低下，達不到臨床需求。因此，開發(fā)新的診斷標記物和診斷方法已迫不及待。

在分子水平上尤其是在基因水平上進行腫瘤的早期診斷已經成為了腫瘤診斷領域的發(fā)展趨勢，在肺癌診斷方面，申請?zhí)枮椋?01510220102.9、201510233085.2、201510243857、201610202285.6、201610200867、201610200574.2、201610200855.8專利文獻均披露了可以用于肺癌診斷的基因標志物。本申請是在現有技術的啟示下尋找新的可以用于肺癌診斷的生物標志物。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過檢測clic3基因或蛋白表達差異來診斷肺腺癌的方法。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過檢測clic3基因或蛋白表達差異來預測肺腺癌預后的方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種通過激活clic3基因或clic3蛋白來治療肺腺癌的方法。

本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于篩選治療肺腺癌的藥物的方法。

本發(fā)明的目的之五在于提供一種用于治療肺腺癌的藥物。

為了實現上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：

本發(fā)明提供了檢測clic3的產品在制備肺腺癌診斷工具中的應用。

進一步，所述檢測clic3的產品包括檢測clic3基因表達量的產品。

更進一步，所述檢測clic3的產品包括能夠定量clic3基因mrna的產品，和/或能夠定量clic3蛋白的產品。

本發(fā)明的定量clic3基因mrna的產品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能：如pcr、如southern雜交、northern雜交、點雜交、熒光原位雜交(fish)、dna微陣列、aso法、高通量測序平臺等。使用該產品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。

包含在上述產品中的核酸可以通過化學合成來獲得，或通過從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設計用于擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。

進一步，所述pcr方法為已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，擴增不應突變系統)法、rt-pcr(逆轉錄酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。擴增的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特異性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可擴增片段長度多態(tài)性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(單鏈構象多態(tài)性)法來檢測。

所述能夠定量clic3基因mrna的產品包括實時定量pcr中使用的特異擴增clic3基因的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

產品中包括的引物可以通過通過化學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來適當地設計，并通過化學合成來制備。

上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來恰當設計，并通過化學合成來制備，或者可以通過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設計用于擴增期望核酸序列的引物擴增它來制備。

本發(fā)明的定量clic3蛋白的產品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫測定法、免疫組織化學法、western印跡等。

本發(fā)明的定量clic3蛋白的產品包括特異性結合clic3蛋白的抗體或其片段?？梢允褂萌魏谓Y構、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結合靶蛋白質即可。本發(fā)明的檢測產品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的?？贵w片段指保留抗體對抗原的結合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、單鏈fv(scfv)、二硫化物鍵合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v區(qū)(雙抗體)、或含有cdr的肽。本發(fā)明的定量clic3蛋白的產品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞。

抗體可以通過本領域技術人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個或部分靶蛋白質的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免疫動物后，從經過免疫的動物獲得免疫細胞并融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的clic3蛋白或其部分對獲得的抗體實施抗原特異性純化來獲得針對clic3蛋白的單克隆抗體。可以如下制備多克隆抗體：用與上文相同的抗原免疫動物，從經過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對血清實施抗原特異性純化?？梢酝ㄟ^用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體的序列信息來獲得抗體片段。

標記物與抗體或其片段的結合可以通過本領域普遍知道的方法來實施。例如，可以如下熒光標記蛋白質或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質或肽，添加用dmso、緩沖劑、等準備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標記可使用商品化的標記試劑盒，諸如生物素標記試劑盒，如生物素標記試劑盒-nh2、生物素標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；堿性磷酸酶標記試劑盒諸如堿性磷酸酶標記試劑盒-nh2、堿性磷酸酶標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；過氧化物酶標記試劑盒諸如過氧化物酶標記試劑盒-nh2、過氧化物酶標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；藻膽蛋白標記試劑盒諸如藻膽蛋白標記試劑盒-nh2、藻膽蛋白標記試劑盒-sh、b-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2，b-藻紅蛋白標記試劑盒-sh、r-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2、r-藻紅蛋白標記試劑盒sh(dojindolaboratories)；熒光標記試劑盒諸如熒光素標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)555標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)647標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗體標記試劑盒、qdot(tm)抗體標記試劑盒(invitrogencorporation)和ez-標記物蛋白質標記試劑盒(funakoshicorporation)。為了正確標記，可以使用適宜的儀器來檢測經過標記的抗體或其片段。

作為依照本發(fā)明的檢測產品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經過處理的材料。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣品來自受試者的組織。

進一步，所述定量clic3基因或clic3蛋白的產品可以是檢測clic3基因或clic3蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。

本發(fā)明還提供了一種診斷肺腺癌的工具，所述工具能夠檢測clic3基因表達量。

進一步，所述工具包括包括能夠定量clic3基因mrna的試劑，和/或能夠定量clic3蛋白的試劑。

更進一步，所述能夠定量clic3基因mrna的試劑是實時定量pcr中使用的特異擴增clic3基因的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

進一步，所述診斷肺腺癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷肺腺癌的工具，隨著高通量測序技術的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知clic3基因的異常與肺腺癌相關也屬于clic3的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內。

本發(fā)明的檢測產品、診斷工具中使用的抗clic3抗體或其片段所識別的氨基酸的數目沒有特別限制，只要抗體能夠結合clic3即可。

本發(fā)明還提供了一種診斷肺腺癌的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲取受試者的樣品；

(2)檢測受試者樣品中clic3基因或蛋白的表達水平；

(3)將測得的clic3基因或蛋白的表達水平與受試者的患病與否關聯起來。

(4)與對照相比，clic3基因或蛋白的表達水平降低，則該受試者被判斷患有肺腺癌、或者肺腺癌患者被判斷為復發(fā)、或者肺腺癌患者被判斷為預后不良。

本發(fā)明還提供了一種肺腺癌的治療方法，所述方法包括激活clic3基因或clic3蛋白。

進一步，所述方法包括促進clic3基因的表達，或促進clic3蛋白的表達或增強clic3蛋白的活性。

本發(fā)明還提供了一種腫瘤藥物的篩選方法，可以通過在對癌細胞添加測試藥物后或在對腫瘤模型動物施用測試藥物后的某個時期測量clic3基因或者clic3蛋白的表達水平來測定腫瘤藥物改善腫瘤預后的效果。更具體地說，當clic3基因或者clic3蛋白的表達水平在添加或施用測試藥物后升高時或者恢復正常水平時，可選擇該藥物作為改善腫瘤預后的治療藥物。

本發(fā)明還提供了一種治療肺腺癌的藥物，所述藥物包含clic3的激活劑。

發(fā)明的clic3的激活劑不受限制，只要所述激活劑能夠促進或增強clic3或涉及clic3上游或下游途徑的物質的表達或活性，且對于治療腫瘤有效的藥物即可。

本發(fā)明還提供了上述激活劑在制備治療肺腺癌的藥物中的應用。

進一步，所述激活劑包括clic3基因、clic3蛋白、促進型mirna、促進型轉錄調控因子、或促進型靶向小分子化合物。

本發(fā)明的激活劑一方面可以用于補充內源性的clic3蛋白的缺失或不足，通過提高clic3蛋白的表達，從而治療因clic3蛋白缺乏導致的肺腺癌。另一方面可以用于增強clic3蛋白的活性，從而治療肺腺癌。

本發(fā)明的藥物可以作為醫(yī)藥單獨施用或與其它藥物一起施用?？梢耘c本發(fā)明的藥物一起施用的其它藥物不受限制，只要它不損害本發(fā)明的治療性或預防性藥物的效果即可，優(yōu)選的是，用于治療或預防腫瘤的藥物可以包括例如烷化劑，諸如異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺、達卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法侖、和雷莫司汀；抗代謝物，諸如依諾他濱、卡培他濱、卡莫氟、克拉屈濱、吉西他濱、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽(cytarabineocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奧替拉西鉀、去氧氟尿苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氟達拉濱、培美曲塞、噴司他丁、巰嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物堿，諸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他賽、nogitecan、帕利他賽、長春瑞濱、長春地辛、和長春堿；抗癌抗生素，諸如放線菌素d、阿柔比星、氨柔比星、伊達比星、表柔比星、凈司他丁stimalamer、柔紅霉素、多柔比星、吡柔比星、博來霉素、培洛霉素、絲裂霉素c、和米托蒽醌；基于鉑的藥物，諸如奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、和奈達鉑；激素藥物，諸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡魯胺、氟他胺、潑尼松龍、磷雌酚、米托坦、甲睪酮、甲羥孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和來曲唑；生物反應修飾劑，諸如干擾素α、干擾素β、干擾素γ、白介素、烏苯美司、干bcg、和香菇多糖；和分子靶向藥物，諸如伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗、奧佐米星、他米巴羅汀、曲妥單抗、維a酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔單抗等。

本發(fā)明的藥物可根據需要制備成各種劑型。包括但不限于，經皮、粘膜、鼻、口頰、舌下或經口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。

本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預防效果即可，包括但不限于靜脈內，腹膜內，眼內，動脈內，肺內，口服，小泡內，肌肉內，氣管內，皮下的，通過皮膚，通過胸膜，局部的，吸入，通過粘膜，皮膚，腸胃，關節(jié)內，心室內，直腸，陰道，顱骨內，尿道內，肝內，瘤內。在某些情況下，可以系統地給藥。在某些情況下是局部地給藥。

本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預防效果即可，可以依據癥狀、性別、年齡等來恰當的確定。本發(fā)明的治療藥物或預防藥物的劑量可以使用例如對疾病的治療效果或者預防效果作為指標來確定。

在本發(fā)明的上下文中，“診斷肺腺癌”包括判斷受試者是否已經患有肺腺癌、判斷受試者是否存在患有肺腺癌的風險、判斷肺腺癌患者是否已經復發(fā)與轉移、判斷肺腺癌患者對藥物治療的反應性、或者判斷肺腺癌患者的預后情況。

本文所用的“治療”涵蓋患有相關疾病或病癥的哺乳動物例如人類中治療相關的疾病或疾病狀態(tài)，并且包括：

(1)預防疾病或疾病狀態(tài)在哺乳動物中發(fā)生，尤其是當該哺乳動物易感于所述疾病狀態(tài)，但尚未被診斷出患有這種疾病狀態(tài)時；

(2)抑制疾病或疾病狀態(tài)，即阻止其發(fā)生；或者

(3)緩解疾病或疾病狀態(tài)，即使疾病或疾病狀態(tài)消退。

術語“治療”通常涉及治療人類或動物(例如，被獸醫(yī)所應用)，其中可達到某些預期的治療效果，例如，抑制病癥的發(fā)展(包括降低發(fā)展速度、使發(fā)展停止)、改善病癥和治愈病癥。還包括作為預防措施(例如預防)的治療。對還沒有發(fā)展為病癥但有發(fā)展為該病癥危險的患者的用途，也包括在術語“治療”中。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明的發(fā)現了一種診斷肺腺癌的分子標志物，使用該分子標志物可以在肺腺癌發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。

本發(fā)明的包括clic3基因或蛋白的激活劑的治療藥物可用作新的肺腺癌的治療藥物。

附圖說明

圖1顯示利用qpcr在mrna水平上檢測clic3基因差異表達情況的統計圖；

圖2顯示利用免疫印跡在蛋白水平上檢測clic3基因差異表達情況的統計圖；

圖3顯示利用qpcr在mrna水平上檢測clic3基因過表達情況的統計圖；

圖4顯示利用免疫印跡在蛋白水平上檢測clic3基因過表達情況的統計圖；

圖5顯示clic3基因過表達對肺腺癌細胞增殖影響的統計圖。

具體的實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選差異表達基因

1、取材：

8例原發(fā)肺腺癌患者的手術切除癌組織和癌旁組織作為實驗樣本。所有癌組織均術后病理證實為肺腺癌。全部原發(fā)肺腺癌患者術前均未行放、化療，全部病例臨床資料完整。

2、組織rna的獲取

從組織樣品中提取totalrna，利用nanodrop2000對所提rna的濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna完整性，agilent2100測定rin值。單次建庫要求rna總量5ug,濃度≥200ng/μl,od260/280介于1.8～2.2之間。

3、去除rrna

細胞內一部分(>24％)的長鏈非編碼rna都是缺少傳統polya尾的，因此采用去除rrna的方式建庫可以獲得更加全面的lncrna信息。

4、片段化rna

illumina平臺是針對短序列片段進行測序，去除rrna得到的mrna和lncrna是完整的rna序列，平均長度可能達幾kb，因此需要對其進行隨機打斷。利用金屬離子，可以將rna隨機斷裂成200bp左右的小片段。

5、反轉合成cdna

在逆轉錄酶的作用下，利用隨機引物，以mrna為模板反轉合成一鏈cdna，進行二鏈合成時，dntps試劑中用dutp代替dttp，使cdna第二鏈中堿基包含a/u/c/g。

6、連接adaptor

雙鏈的cdna結構為粘性末端，加入endrepairmix將其補成平末端，隨后在3’末端加上一個a堿基，用于連接y字形的接頭。

7、ung酶消化cdna二鏈

在pcr擴增前，用ung酶將cdna第二鏈消化，從而使文庫中僅包含cdna第一鏈。

8、illuminahiseq4000上機測序

文庫富集，pcr擴增15個cycles；

2％瓊脂糖膠回收目的條帶(certifiedlowrangeultraagarose)；

tbs380(picogreen)定量，按數據比例混合上機；

cbot上進行橋式pcr擴增，生成clusters；

hiseq4000測序平臺，進行2*150bp測序。

9、原始測序數據過濾

將序列末端(5’端和3’端)低質量(質量值小于20)的堿基修剪掉；

去除含n比率超過10％的reads；

10、mrna差異表達分析

分析軟件：cuffdiff:(http://cufflinks.cbcb.umd.edu/)

cuffdiff是cufflinks套件里用來計算差異表達的一個工具，cuffdiff利用tophat比對的結果，調用cufflinks計算每個基因/轉錄本的表達量。通常采用默認參數運行軟件，同時根據實際情況，如測序數據量，基因組情況對參數做適當的調整。

顯著差異mrna篩選條件：p-value<0.05，兩組的count平均值之差大于10。

11、結果

測序結果顯示：與癌旁組織相比，肺腺癌組織中差異表達基因為1321個，其中上調的為587個，下調的為734個。

實施例2大樣本驗證篩選出的差異表達基因

基于前期高通量轉錄組深度測序的結果，根據pvalue的大小，我們選擇clic3基因進行驗證。

1、樣本收集

按照實施例1的方法收集肺腺癌組織及其對應的癌旁組織各45例。

2、在mrna水平上進行驗證

2.1提取組織rna

步驟同實施例1。

2.2逆轉錄

反轉錄使用primescript1^ststrandcdnasynthesiskit試劑盒，操作步驟如下進行：

(1)在微量離心管中加入以下反應液體，如表1所示：

表1反應液體

(2)70℃孵育5min，迅速冷卻至4℃；

在微量離心管內加入以下反應試劑，制成反應體系：

表2反應體系的配制

輕輕震蕩，快速離心后，42℃反應1h，70℃10min終止反應，4℃冷卻，-20℃保存。

采用sybppremixextap^tmii試劑盒，在eppendorfreal-timepcr分析儀進行，具體操作如下：

(1)在冰上配制以下pcr反應液：

表3pcr反應液的配制

引物序列設計如下：

clic3基因：

5’-ctgcccatcctgctctat-3’(seqidno.1)；

5’-cagcgtctcctccagaaa-3’(seqidno.2)

β-actin：

5’-gtggggcgccccaggcacca-3’(seqidno.3)；

5’-ctccttaatgtcacgcacgattt-3’(seqidno.4)

(2)上機，執(zhí)行下述程序：95℃預變性3min；95℃變性15s。59℃退火20s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)。

結果釆用相對定量法，運用公式2^-△△ct計算。實驗重復3次。

△ct＝ct(a)-ct(β-actin)

△△ct＝△ct(實驗組)-△ct(對照組)

結果如圖1所示，與癌旁組織相比，肺腺癌組織中clic3基因的mrna水平明顯下降，差異具有統計學意義(p<0.05)。

3、在蛋白水平上進行驗證

按照ripa蛋白裂解液試劑盒說明書提取各組蛋白，使用bca蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品中蛋白濃度。以常規(guī)western-blot方法檢測clic3蛋白變化，各組實驗均重復3次，以β-actin為內參，做clic3蛋白條帶吸光度定量分析，表達量以clic3蛋白/β-actin吸光度的比值代表。

結果如圖2所示，與癌旁組織相比，肺腺癌組織中clic3蛋白水平顯著降低，差異具有統計學意義(p<0.05)。

實施例3clic3基因過表達

1、質粒構建

根據clic3基因的編碼序列設計擴增引物，引物的設計為本領域技術人員所熟知。從成人胎腦的cdna文庫(clontech公司，貨號：638831)中擴增全長的clic3基因的編碼序列，上述cdna序列插入到真核細胞表達載體pcdna3.1中，連接獲得的重組載體pcdna3.1-clic3用于后續(xù)實驗。

2、肺腺癌細胞的培養(yǎng)與轉染

2.1細胞培養(yǎng)

將肺腺癌細胞株a549于rpmi1640培養(yǎng)基和10％胎牛血清中培養(yǎng)。

2.2細胞轉染

(1)轉染前一天將0.5-2*10⁵個腫瘤細胞懸浮于500μl不含抗生素的培養(yǎng)基，接種至24孔培養(yǎng)板。

(2)轉染當天細胞密度應達80％-90％，準備以下復合物a：將1μg質粒dna稀釋于無血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻；復合物b：取4μllipofectamine2000稀釋于無血清培養(yǎng)基中，混勻。

(3)將復合物a和b混合，輕輕混勻，室溫孵育。

(4)將100μl脂質體復合體加入腫瘤細胞中，上下左右輕輕混勻，將細胞放入37℃含5％co2培養(yǎng)箱孵育5-7小時。

(5)加1ml含有2倍正常血清和抗生素濃度的生長培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細胞18-24小時。

3、利用qpcr實驗檢測pcdna3.1-clic3的過表達情況

3.1提取細胞總rna利用常規(guī)方法進行操作。

3.2逆轉錄

步驟同實施例2。

3.3qpcr

步驟同實施例2。

3.4結果

結果如圖3所示，pcdna3.1-clic3能夠成功過表達，差異具有統計學意義(p<0.05)。

3、westernblot實驗檢測pcdna3.1-clic3過表達情況

步驟同實施例2。

結果如圖4所示，與轉染pcdna3.1組相比，轉染pcdna3.1-clic3的細胞中clic3蛋白的含量明顯增加，差異具有統計學意義(p<0.05)。

實施例4clic3基因的表達對肺腺癌細胞增殖能力的測定

1、步驟：

將轉染24小時后的肺腺癌細胞a549接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2*10³個細胞/孔/200μl，細胞分組如下：

實驗組1(對照組)：肺腺癌細胞轉染pcdna3.1；

實驗組2：肺腺癌細胞轉染pcdna3.1-clic3。

將細胞在37℃、5％co2培養(yǎng)箱再次孵育24小時后，根據brdu細胞增殖試劑盒(chemiconinternational)的說明書，測量細胞增殖速率。

2、統計學方法

實驗都是按照重復3次來完成的，結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss13.0統計軟件來進行統計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統計學意義。

3、結果

結果如圖5所示，相比于實驗組1，實驗組2的細胞增殖減緩，差異具有統計學意義(p<0.05)。上述實驗結果表明，clic3表達可以抑制肺腺癌細胞增殖。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。

sequencelisting

<110>河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院（河北省腫瘤醫(yī)院）

<120>clic3作為肺腺癌的診治靶標

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

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