本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的方法，屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：黃酮類化合物(Flavonoids)是自然界種類最多的多酚類植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物界中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的種類已超過8000多種。黃酮類化合物具有廣泛的藥學(xué)價(jià)值，具有較強(qiáng)的抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗病毒、降血糖、抗輻射和降血脂等多種生物學(xué)作用。隨著對(duì)黃酮類化合物生物活性研究的逐步深入，對(duì)其的開發(fā)利用也越來越多，對(duì)其的需求量也越來越大，近年來，黃酮類化合物的市場(chǎng)每年增長(zhǎng)30％以上，在藥品和營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品領(lǐng)域上具有廣闊的應(yīng)用前景。但天然黃酮類物質(zhì)的獲得受到時(shí)間和區(qū)域的限制，而且在植物中含量低，不利于迅速研究和臨床檢驗(yàn)，并且化學(xué)結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，用化學(xué)合成法很復(fù)雜，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)。因此用微生物生產(chǎn)黃酮類化合物越來越受到人們的重視隨著黃酮類化合物的應(yīng)用范圍越來越廣，其需求量也在不斷的增大，從植物中提取有各種各樣的問題，因此，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)黃酮類化合物具有很大的應(yīng)用前景。目前，黃酮類化合物生物合成的代謝途徑已經(jīng)非常清楚，黃酮類化合物的基本骨架是由3個(gè)丙二酰輔酶A(malonylCoA)和1個(gè)香豆酰輔酶A(coumaroylCoA)在查爾酮合成酶(CHS)的催化下合成的，然后其他種類的黃酮是在母核的基礎(chǔ)上通過羥基、甲氧基取代或烷基化等化學(xué)反應(yīng)生成的。大腸桿菌遺傳背景清晰，分子操作技術(shù)完善，是生物技術(shù)生產(chǎn)平臺(tái)的首選，因此很早就有人通過改造E.coli相關(guān)代謝途徑生產(chǎn)黃酮類化合物。目前很多研究成功通過基因工程等技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)了多種黃酮類化合物在E.coli中的合成，如柚皮素、槲皮素、白藜蘆醇等。但是黃酮類化合物本身對(duì)E.coli生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，主要是通過以下幾種機(jī)制：①破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性，改變細(xì)胞膜滲透性，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的功能，影響細(xì)菌的生長(zhǎng)；②抑制核酸的合成，槲皮素，芹黃素，五羥基黃酮等能夠抑制E.coli的DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性進(jìn)而抑制DNA的合成。蘆丁能夠促進(jìn)E.coli的DNA裂解，導(dǎo)致SOS反應(yīng)發(fā)生，從而抑制菌體的生長(zhǎng)；③抑制能量代謝，通過抑制ATP合酶的活力進(jìn)而抑制胞內(nèi)ATP的含量，影響菌體的生長(zhǎng)。因此利用E.coli生產(chǎn)黃酮類化合物必須要考慮黃酮類化合物對(duì)E.coli的毒性作用。目前已有報(bào)道通過過表達(dá)ompA蛋白、過表達(dá)FadL蛋白或者沉默lamB基因的方法，提高了E.coli對(duì)黃酮類化合物耐受性。但是這種方法需要構(gòu)建重組菌，步驟繁瑣。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服上述問題，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便地提高微生物發(fā)酵產(chǎn)黃酮類化合物產(chǎn)量的方法，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加大豆卵磷脂和維生素B6，有效提高了大腸桿菌對(duì)黃酮類化合物的耐受性，提高了黃酮類物質(zhì)的產(chǎn)量。本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種提高大腸桿菌對(duì)黃酮類化合物的耐受性的方法，所述方法是在大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)黃酮類化合物的培養(yǎng)基中添加大豆卵磷脂和/或維生素B6。在一種實(shí)施方式中，所述大豆卵磷脂添加量為1～5g/L。在一種實(shí)施方式中，所述維生素B6的添加量為12～16mg/L。在一種實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，含有蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L。在一種實(shí)施方式中，所述大腸桿菌為任一能夠用于黃酮生產(chǎn)的大腸桿菌。在一種實(shí)施方式中，所述黃酮類化合物，包括蘆丁、柚皮素或白藜蘆醇。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種提高微生物發(fā)酵產(chǎn)黃酮類化合物產(chǎn)量的方法，所述方法是在大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)黃酮類化合物的培養(yǎng)基中添加大豆卵磷脂和/或維生素B6。在一種實(shí)施方式中，所述黃酮類化合物，包括蘆丁、柚皮素或白藜蘆醇。在一種實(shí)施方式中，所述大豆卵磷脂添加量為1～5g/L。在一種實(shí)施方式中，所述維生素B6的添加量為12～16mg/L。在一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵生產(chǎn)是在35～40℃下進(jìn)行。發(fā)明還要求保護(hù)按照上述方法在生物、醫(yī)藥、食品方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過控制培養(yǎng)基中大豆卵磷脂和/或維生素B6含量，能夠有效地提高黃酮類化合物的產(chǎn)量。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、易控，適合工業(yè)化應(yīng)用。本發(fā)明方法適合所有能夠用于黃酮生產(chǎn)的大腸桿菌。具體實(shí)施方式實(shí)施例1柚皮素脅迫耐受性能比較對(duì)照組：將能夠用于黃酮生產(chǎn)的大腸桿菌，活化后接種到額外添加有1g/L柚皮素化合物的LB培養(yǎng)基中，于37℃發(fā)酵培養(yǎng)。每隔1h測(cè)一次OD600直至菌株生長(zhǎng)到穩(wěn)定期。根據(jù)公式μ＝dx/x*dt算出菌株的比生長(zhǎng)速率圖，然后得出最大比生長(zhǎng)速率μmax。結(jié)果顯示，對(duì)照組的μmax為0.27。實(shí)驗(yàn)組，與對(duì)照組相比，培養(yǎng)基中再額外添加有以下物質(zhì)：A組：3g/L大豆卵磷脂；B組：14mg/L維生素B6；C組：3g/L大豆卵磷脂+14mg/L維生素B6；D組：3g/L大豆卵磷脂+6mg/L維生素B2；E組：1g/L大豆卵磷脂+12mg/L維生素B6；F組：3g/L大豆卵磷脂+16mg/L維生素B6。表1不同添加物對(duì)菌株柚皮素耐受性的影響μmax相對(duì)于對(duì)照組的比值A(chǔ)組252％B組111％C組353％D組231％E組280％F組345％注：A組～F組數(shù)據(jù)，為不同添加物下的μmax與對(duì)照組的μmax的比值。由表1結(jié)果可知，大豆卵磷脂和維生素B6對(duì)比生長(zhǎng)速率都有提高效果，說明大豆卵磷脂和維生素B6都能在一定程度上提高菌株對(duì)黃酮類物質(zhì)的耐受能力。此外，結(jié)果顯示，大豆卵磷脂提高效果非常顯著，尤其是大豆卵磷脂與維生素B6的復(fù)配。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3