本發(fā)明涉及一種促進(jìn)生物發(fā)酵合成安卓奎諾爾的方法，屬于微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：樟芝(Antrodiacamphorata)又稱為牛樟芝、牛樟菇，是臺(tái)灣特有的一類十分珍稀的食藥兩用真菌。樟芝子實(shí)體和菌絲體中含有多糖類物質(zhì)，三萜類物質(zhì)，不飽和脂肪酸，泛醌類物質(zhì)，馬來酸與琥珀酸衍生物等70多種生理活性物質(zhì)，具有廣泛的藥理活性。生理活性物質(zhì)安卓奎諾爾(Antroquinonol)是2007年Lee等人利用正己烷從樟芝子實(shí)體或樟芝固體發(fā)酵粉末中萃取并鑒定一種新化合物，屬于泛醌類的衍生物。2010年Chiang等人研究表明Antroquinonol可以通過活化AMPK來抑制胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成途徑，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期，從而產(chǎn)生抗癌效果。2012年Tsai等研究發(fā)現(xiàn)Antroquinonol具有抗氧化應(yīng)激和抗炎等活性。由于Antroquinonol具有顯著的抗癌活性，并且，它對(duì)于癌細(xì)胞與正常細(xì)胞具有選擇性，目前已進(jìn)入FDA二期臨床實(shí)驗(yàn)，是具有優(yōu)良前景的抗癌化合物。目前與樟芝中生理活性物質(zhì)Antroquinonol相關(guān)的研究基本集中在成分、抑制癌細(xì)胞、抑制B型肝炎、護(hù)肝、自體免疫調(diào)節(jié)及抗疲勞等藥理活性及藥理機(jī)制，而對(duì)于其生物合成方面的研究非常欠缺，有關(guān)樟芝生物合成Antroquinonol的發(fā)酵調(diào)控及發(fā)酵水平的文獻(xiàn)報(bào)道極為有限。公開號(hào)為CN102356728A(一種提高樟芝活性產(chǎn)物產(chǎn)量的固態(tài)培養(yǎng)方法)的專利，該專利公開了利用固體培養(yǎng)基栽培樟芝獲得活性產(chǎn)物Antroquinonol，但由于該專利中的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法過于耗時(shí)且成本較高，此外產(chǎn)物的發(fā)酵單位也比較低。也有研究通過樟芝深層液態(tài)發(fā)酵已經(jīng)成功地實(shí)現(xiàn)了菌絲體的快速收集，樟芝液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)活性產(chǎn)物是一種十分有效的方法，故如何通過樟芝液態(tài)深層發(fā)酵來有效地提高Antroquinonol的產(chǎn)量將成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。樟芝發(fā)酵活性產(chǎn)物安卓奎諾爾，分子結(jié)構(gòu)較為新穎，目前對(duì)其生物合成途徑仍然沒有深入研究，采用普通的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分，很難合成Antroquinonol。已有報(bào)道根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，通過實(shí)驗(yàn)不斷探索培養(yǎng)基中的添加因子及其添加方式，研究了外源前體物質(zhì)和效應(yīng)物對(duì)樟芝液態(tài)發(fā)酵生物合成Antroquinonol的影響。有必要開發(fā)更多的通過廉價(jià)添加物提高發(fā)酵生產(chǎn)水平。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服上述問題，本發(fā)明提供了一種促進(jìn)生物發(fā)酵合成安卓奎諾爾的方法，通過在一定的培養(yǎng)時(shí)間下往培養(yǎng)基中添加大豆卵磷脂或者還添加煙葉與甲羥戊酸，有效地提高了樟芝樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的產(chǎn)量。在一種實(shí)施方式中，所述方法是接種樟芝(Antrodiacamphorata)種子培養(yǎng)液于液態(tài)發(fā)酵基本培養(yǎng)基后，在22-34℃發(fā)酵6-8d；其中在發(fā)酵14-18h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為1～5g/L的大豆卵磷脂。在一種實(shí)施方式中，所述方法還包括在發(fā)酵32～36h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為5～8g的煙葉，在發(fā)酵50～54h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為40～60mg/L的甲羥戊酸。在一種實(shí)施方式中，所述液態(tài)發(fā)酵基本培養(yǎng)基組成：葡萄糖10-100g/L，黃豆粉2-10g/L，玉米漿粉1-10g/L，硫酸鎂0.1-10g/L，磷酸二氫鉀0.1-10g/L。在一種實(shí)施方式中，所述樟芝種子培養(yǎng)液的制備方法：利用一定量的無菌水從新鮮的樟芝菌斜面上洗下孢子，制備孢子懸浮液，以體積比5-15％接入裝有種子培養(yǎng)基中，于20-35℃，轉(zhuǎn)速50-250r/min培養(yǎng)1-10d，得到處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的樟芝種子液。在一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵是采用搖瓶發(fā)酵，轉(zhuǎn)速50-250r/min。本發(fā)明還要求保護(hù)按照上述方法發(fā)酵生產(chǎn)得到的安卓奎諾爾及其在醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種新的促進(jìn)生物發(fā)酵合成安卓奎諾爾的方法，方法簡(jiǎn)便、易控，發(fā)酵時(shí)間短。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本實(shí)施例的培養(yǎng)基配方為：斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L。液態(tài)種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，黃豆粉4g/L，玉米漿粉2g/L，硫酸鎂0.1g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L液態(tài)發(fā)酵基本培養(yǎng)基：葡萄糖30g/L，黃豆粉5g/L，玉米漿粉3g/L，硫酸鎂0.1g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L。將樟芝菌轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上，30℃恒溫培養(yǎng)14d，得新鮮樟芝斜面，用一定量無菌水洗下孢子，制備孢子懸浮液，以體積比為10％的接種量接入裝有100mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃、130r/min恒溫培養(yǎng)3d；再將種子液以體積比為15％的接種量接入裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃、110r/min恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為8d。實(shí)驗(yàn)組分別進(jìn)行如下處理：A組：直接搖床發(fā)酵培養(yǎng)8d，發(fā)酵結(jié)束后活性產(chǎn)物Antroquinonol的產(chǎn)量為6mg/L。B組：在發(fā)酵16h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為3g/L的大豆卵磷脂。C組：在發(fā)酵48h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為3g/L的大豆卵磷脂。D組：在發(fā)酵96h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為3g/L的大豆卵磷脂。E組：在發(fā)酵16h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為3g/L的大豆卵磷脂，在發(fā)酵34h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為5g的煙葉，在發(fā)酵54h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為50mg/L的甲羥戊酸。F組：發(fā)酵96h時(shí)，向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為10g/L的煙葉粉末。G組：在發(fā)酵16h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為3g/L的大豆卵磷脂，在發(fā)酵34h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為50mg/L的甲羥戊酸，在發(fā)酵54h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為5g的煙葉。H組：在發(fā)酵34h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為5g的煙葉，在發(fā)酵54h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為50mg/L的甲羥戊酸。I組：在發(fā)酵16h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為3g/L的大豆卵磷脂，在發(fā)酵34h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為100mg/L的甲羥戊酸和6ml/L茄尼醇，在發(fā)酵54h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為5g的煙葉。表1不同培養(yǎng)基成分對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)安卓奎諾爾的影響產(chǎn)量(mg/L)相對(duì)于A組的提高比例A組6-B組24300％C組9.151.7％D組8.745％E組48700％F組17.4190％G組28366.7％H組17.2186.7％I組27350％結(jié)果顯示，大豆卵磷脂的添加時(shí)機(jī)對(duì)安卓奎諾爾產(chǎn)量影響較大，而且添加時(shí)機(jī)合適能夠顯著提高安卓奎諾爾產(chǎn)量。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3