本發(fā)明屬于分子生物
技術領域：
，具體涉及一種與大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”快速生長相關的SNP標記及其應用。
背景技術：
：大口黑鱸(MicropterussalmoidesL.)，俗名加州鱸，原產(chǎn)于北美洲，具有生長快、耐低溫、肉質(zhì)鮮美和易捕撈等特點，是重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一。1983年從臺灣引種到廣東省，現(xiàn)在全國大部分地區(qū)均有養(yǎng)殖。然而，目前我國養(yǎng)殖的大口黑鱸是由野生種家養(yǎng)馴化而成的，缺少定向選育，在親本留種時經(jīng)常選擇個體小，性成熟早的個體作為親本，致使我國大口黑鱸種質(zhì)的下降，主要表現(xiàn)在生長速度下降、性成熟年齡普遍提前、餌料轉(zhuǎn)化效率低、抗病力也大幅下降，其中，生長速度關系到大口黑鱸產(chǎn)量的高低，養(yǎng)殖效益的大小。養(yǎng)殖大口黑鱸生長速度慢、產(chǎn)量低直接影響大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。因此，從分子遺傳學角度加快改良大口黑鱸，提高其生長性能的工作勢在必行。大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”養(yǎng)殖新品種是以國內(nèi)4個養(yǎng)殖群體為基礎選育種群，采用傳統(tǒng)的群體選育方法，以生長速度為主要指標，經(jīng)連續(xù)5代選育獲得的大口黑鱸選育品種。該新品種的生長速度比普通大口黑鱸快17.8%-25.3%，高背短尾的畸形率由5.2%降低到1.1%。該品種2010年通過全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定，審定編號為GS01-004-2010。挑選優(yōu)質(zhì)親魚是提高養(yǎng)殖魚類生長速度的主要方法之一，其目的是為了改變養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構，使后代獲得更快的生長速度、更好的抗病能力的遺傳特點。在生產(chǎn)中，其傳統(tǒng)方法是挑選個體較大、身體健壯的魚作為留種親本，即根據(jù)表型來決定親魚是否留種。這種方法方便、快捷、簡單，但受人為因素影響很大，加上大口黑鱸屬于肉食性為主的魚類，掠食性強，餌料不足是會互相殘食，致使其生長懸殊較大。如此可見，僅從表型判斷大口黑鱸親本質(zhì)量往往達不到理想的效果。隨著分子生物學和遺傳學的發(fā)展，已涌現(xiàn)出很多種遺傳標記，如AFLP、RAPD、SSR、SNP等標記，其中，SNP標記因分布廣泛，適宜高通量自動化分析，遺傳穩(wěn)定，日益成為遺傳育種研究中首選的遺傳標記。若這些遺傳標記能與生產(chǎn)性狀相關聯(lián)在一起，即可實現(xiàn)從DNA水平上進行選擇育種，克服了傳統(tǒng)方法受人為因素影響大的不利因素，提高了選擇的準確性，并且可實現(xiàn)在早期鑒定出具有優(yōu)良性狀的個體，篩選出優(yōu)良的后備親本，從而縮短育種周期，加快育種進程。通過發(fā)現(xiàn)與大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”快速生長有關的基因，提高快長親本的篩選效率。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種與大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”快速生長相關的SNP位點標記及其應用。本發(fā)明所采取的技術方案是：與大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”快速生長相關的SNP標記，所述SNP標記分別如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示；所述SEQIDNO.1自5’端起第658位堿基為C或A；所述SEQIDNO.2自5’端起第327位堿基為A或G；所述SEQIDNO.3自5’端起第121位堿基為A或G。其中：序列為SEQIDNO.1的SNP標記的CC基因型個體的生長速度顯著高于AA基因型個體。序列為SEQIDNO.2的SNP標記的AA基因型個體的生長速度顯著高于GG基因型個體。序列為SEQIDNO.3的SNP標記的AA基因型個體的生長速度顯著高于GG基因型個體。以上所述的SNP標記在檢測大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”樣本生長性狀中的應用。用于快速檢測以上所述的SNP標記的引物對。作為優(yōu)選的，用于檢測SEQIDNO.1所示SNP標記的引物對如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示；用于檢測SEQIDNO.2所示SNP標記的引物對如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；用于檢測SEQIDNO.3所示SNP標記的引物對如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示。一種用于篩選快速生長大口黑鱸樣本的試劑盒，其包括用于檢測SEQIDNO.1或SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示SNP標記的引物對。一種快速生長大口黑鱸樣本的篩選方法，通過對大口黑鱸樣本SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3SNP標記的檢測，選擇SEQIDNO.1SNP標記為CC基因型和/或SEQIDNO.2SNP標記為AA基因型和/或SEQIDNO.3SNP標記為AA基因型的個體。具體包括如下步驟：（1）提取待檢樣品基因組DNA；（2）以提取得到的DNA為模板，利用特異性引物對進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；（3）對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，根據(jù)測序結(jié)果確定樣品的SNP標記的基因型來篩選快速生長樣本。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的3個SNP標記的應用，可大大降低大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”親本篩選的盲目性，可以快速獲得生長速度快且遺傳穩(wěn)定的大口黑鱸個體。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。實施例1與大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”快速生長相關的SNP標記的獲得一、SNP標記的獲得大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”養(yǎng)殖新品種是以國內(nèi)4個養(yǎng)殖群體為基礎選育種群，采用傳統(tǒng)的群體選育方法，以生長速度為主要指標，經(jīng)連續(xù)5代選育獲得的大口黑鱸選育品種。該新品種的生長速度比普通大口黑鱸快17.8%-25.3%，高背短尾的畸形率由5.2%降低到1.1%。該品種2010年通過全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定，審定編號為GS01-004-2010。在選育過程中我們比較了大口黑鱸選育群體與非選育群體的生產(chǎn)性能，采用金屬線碼標志分別標記接近時間繁殖的選育群體與非選育群體各800尾，然后同塘養(yǎng)殖，11月齡時從大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”快長群體中挑選10尾體重最大個體（快長群體）和非選育群體中挑選10尾體重最小個體（慢長群體），然后提取每尾魚的總RNA，取等量的總RNA構建了快長群體和慢長群體的混合RNA池，并進行轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)生物信息軟件分析獲得了大量的潛在SNP位點，其中在phosphoenolpyruvatecarboxykinase1、FOXO3b和heatshockproteinbeta-1基因的3’非編碼區(qū)存在各一個SNP位點。采用Snapshot方法對該位點進行驗證，經(jīng)實驗證實了這3個位點的存在。第一個SNP位點位于大口黑鱸phosphoenolpyruvatecarboxykinase1基因序列（SEQIDNO.1）的第658個堿基處，該SNP位點的等位基因為C和A，有CC、CA和AA三種基因型。第二個SNP位點位于大口黑鱸FOXO3b基因序列（SEQIDNO.2）的第327個堿基處，該SNP位點的等位基因為G和A，有GG、GA和AA三種基因型。第三個SNP位點位于大口黑鱸heatshockproteinbeta-1基因（SEQIDNO.3）序列的第121個堿基處，該SNP位點的等位基因為G和A，有GG、GA和AA三種基因型。二、大口黑鱸3個SNP位點不同基因型與生長性狀的關聯(lián)分析11月齡時，從大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”選育群體中隨機挑選340尾作為關聯(lián)分析群體，并測量了每一尾的體質(zhì)量、全長、頭長、體高和尾柄長。由于該群體同一批繁殖、同池養(yǎng)殖，且采樣時間一致，因此在建立分析模型時不考慮時間、環(huán)境及人工飼養(yǎng)條件的差異。利用Snapshot方法對phosphoenolpyruvatecarboxykinase1（PCK1）基因上突變位點在340尾大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”個體進行分型后，采用一般線性模型（GLM）分析不同基因型對體質(zhì)量、全長、頭長、體高和尾柄長進行關聯(lián)分析。CC基因型個體在體質(zhì)量、體寬、全長、頭長、體高以及尾柄長上的平均值均高于AC型和AA型個體的均值，且CC基因型個體在體重、頭長和體高上顯著高于AA基因型個體(P<0.05)。利用Snapshot方法對FOXO3b基因上突變位點在340尾大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”個體進行分型后，采用GLM分析不同基因型對體質(zhì)量、全長、頭長、體高和尾柄長進行關聯(lián)分析。AA基因型個體在體質(zhì)量、體寬、全長、頭長以及尾柄長上的平均值均高于AG型和GG型個體的均值，且AA基因型個體在體重和頭長上顯著高于GG基因型個體(P<0.05)。利用Snapshot方法對heatshockproteinbeta-1（HSPB1）基因上突變位點在340尾大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”個體進行分型后，采用GLM分析不同基因型對體質(zhì)量、全長、頭長、體高和尾柄長進行關聯(lián)分析。AA基因型個體在體質(zhì)量、體寬、全長、體高以及尾柄長上的平均值均高于AC型和AA型個體的均值，且AA基因型個體在體重、頭長和體高上顯著高于GG基因型個體(P<0.05)。表1大口黑鱸3個SNP位點不同基因型與生長性狀的關聯(lián)分析SNPsiteGenotypeNumberBW/gTL/cmHL/cmBH/cmCPL/cmPCK1AA152507.54±10.36a29.29±0.207.31±0.13a8.39±0.08a8.26±0.207aAC157526.94±10.1929.30±0.207.35±0.138.49±0.088.34±0.07bCC120529.05±11.66b29.52±0.237.70±0.14b8.66±0.09b8.36±0.11FOXO3bAA61545.64±16.30a29.47±0.607.95±0.12ab8.54±0.138.35±0.12AG220530.36±8.5929.54±0.197.42±0.11a8.59±0.07a8.34±0.06GG149504.30±10.43b29.05±0.317.24±0.19b8.37±0.08b8.28±0.08HSPB1AA59554.68±16.62a29.66±0.337.35±0.208.67±0.088.42±0.12AG197524.10±9.0929.36±0.187.54±0.118.51±0.078.31±0.07GG173512.07±9.70b29.25±0.197.35±0.128.42±0.128.30±0.07注：表中數(shù)值為平均值±標準誤差，同一列不同上標字母表示差異顯著(P<0.05)。實施例2上述的SNP位點在篩選快速生長大口黑鱸親本中的應用利用上述的SNP位點對快速生長大口黑鱸親本進行篩選，包括如下步驟：1）從待測親本中剪取鰭條樣品，提取DNA；2）以提取得到的DNA為模板，利用特異性引物進行初次PCR擴增，得到初次PCR產(chǎn)物，3）使用Snapshot方法用初次獲得PCR產(chǎn)物為模板，使用延伸引物延伸一個堿基在多態(tài)位點終止，在測序儀上檢測，根據(jù)峰的顏色可知多肽位點的堿基類型，來確定待測親本是否為純合體。初次PCR擴增的反應體系為：DNA1μl10×buffer1.5μl25mmol的MgCl21.5μldNTP0.3μl20P上下游引物0.15μlTaq酶0.3μlH2O補至15μl擴增條件為：94℃預變性3min；94℃變性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，24個循環(huán)；72℃延伸3min。引物延伸的反應體系為：純化PCR產(chǎn)物2μlSnapshotMix試劑1μl延伸引物2μl水補至6μl延伸條件為：96℃預變性1min；96℃變性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s，30個循環(huán)。其中，用于檢測PCK1分子標記SNP位點基因型的引物對為：F1：3’-CTGAAAGAGGAGCAATTCTC-5’（SEQIDNO.4），R1：3’-TATTATTCATCTCAGCACCC-5’（SEQIDNO.5），延伸引物：3’-TTTTTTTTTTTTTTTTGAGCAATTCTCCTCTGATAATT-5’（SEQIDNO.6）；用于檢測FOXO3b分子標記SNP位點基因型的引物對為：F2：3’-GTACAGACATGTATGATGCAG-5’（SEQIDNO.7），R2：3’-CATGGTGTAAATCTGATCCAGT-5’（SEQIDNO.8），延伸引物：3’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAGAAAATCCAGTAAACAGAC-5（SEQIDNO.9）；用于檢測HSPB1分子標記SNP位點基因型的引物對為：F3：3’-GGAGGACAGCATTTATAATAG-5’（SEQIDNO.10），R3：3’-GTTATGAGTGGTCTTATCAAAG-5’（SEQIDNO.11），延伸引物：3’-AACACCTCAGGTTTTTAGTCTA-5’（SEQIDNO.12）。以上實施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領域技術人員來說，在不背離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進行的任何顯而易見的變化和改進，都應被視為本發(fā)明的一部分。SEQUENCELISTING<110>中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所<120>與大口黑鱸"優(yōu)鱸1號"快速生長相關的SNP標記及其應用<130><160>12<170>PatentInversion3.5<210>1<211>900<212>DNA<213>MicropterussalmoidesL.<400>1acacaaaggcaaggtgatcatgcatgaccccttcgccatgcgtcccttctttggctacaa60ctttggacagtacctctctcactggctgagtatggccgaccgccccggcgccaagctccc120caagatctttcacgtcaactggttccgcaagagccccaccgccggatttctgtggcccgg180tttcggcgacaacatccgcgtgcttgactggatgttcaggcgggtgaatggcgaggccgg240cgccgtgccctctgctgtgggctacctgcctcactgtgactctctaaacctccagggcct300gcaggaggacgtggacctcaacgagctgttctccctggatcaggagttctggcagaggga360ggtggatgaggtgaggaagtacttcaccacgcaggtgaacgacgacctgcccagtgaggt420ggcccggcagctggagctcctgcagcagcgagtgaagcagatgtaaagaggaaaaacagg480aggggaagaaaagaagtgtgtccgaaattctgagggaacatgttggtaatctagaaccaa540cttttagtaattgtagaatatctcgttcttgtgctgaagaacacatataaagaattcctt600tctttgaggtgaagccttacaacttcctgaaagaggagcaattctcctctgataattctt660gtttttttcattagctagaaatcctcccccttttcggatgattattctgaaaatactact720gttaaaattccgctgggggtgctgagatgaataatatgaatttgtaggaattgttgagtt780tttcactgtggtttaagtgaaatgtcataaaaatgacagccagagggcaccagtcacaaa840taaatcggaaatctttcttttccatcccttcacatgctgtcgtagcagcactatgttttc900<210>2<211>1196<212>DNA<213>MicropterussalmoidesL.<400>2caacaacaacaacaacaacaaaaagaaagctatgtcaaactcacaaatcgtagaattatg60caattttcctttgacacccagtctgttgatatcaaagagaaactgcttatcagaaggggt120ttcaggtggaacacagggactaaatatcaaggaaagattgaaggagtgcacggtgcagtt180gttcccgctgacgacaaaaaaagacaaagtgtaaagtgaaaaaaatcaagaagtgacatg240gtgtaaatctgatccagtggtttcctgggatgtgttatgttaaaaaaaaatccctctgtt300ctcactttgtgattttaaatgttcagtgtctgtttactggattttctgttttatcatatt360tgtttctgcatcatacatgtctgtacaaaaacatttggtgtattgatgaaatgaaaagat420ggaaatggggtatcttactcactgagtggccacacatacagtacatgcaaacacacagac480aacctaacactttgccccagtttgcaaaacttcagaaccctttgaagttacgatttctta540tttttattgccatgcacttccatttttgtttttttaaattgcttgaattaaattaaatgc600tccacactgagggttatattacaattagccgaatattacaaaaatatttgttatcttttg660tgtgtatctaactgtaaaaaaaaaaaatggaaaaagactaagaggaggaaactctctgtc720atggatatttgtacagtgcagggcagtgaaaagttcaagaaggaggcggtcacatcttgt780ctgtcttttcgtagatttcttaacttctggtgagttctgttgatgtagccaaaatgaata840cctgtgtgctagagttgtgaacatttccacaccataacaggtgctatgtaaacagtgttg900aatcctgccctgagagcaagccgtgcattttgtgtgtttttgtttctgtttttacacatg960acctgcagaagcccaaagctgcagccacttgtagcacagtgaggttgaacctgtagacgg1020caggggtgggggtgggagggaggtgtgaagggttttagcctcattcctctagaagccatt1080tgtttctcgagtaaaacaataagctatctctgtatattgccaaattacttgaaacaaaca1140gtaggatatgctggcagccaaatcacagcacagacacacacacacacacacagaca1196<210>3<211>1694<212>DNA<213>MicropterussalmoidesL.<400>3gacggtgtgttggaaatcactggtgagtgctcttttctccttcactatttgttctgtaca60gttacctgttgcatgctgattcgaggaggacagcatttataatagttatataataaccgc120gtagactaaaaacctgaggtgttgaaggtcctgtcaggaagagccagtctttgataagac180cactcataacacctaaaaatgtgctagtgtacaggacagatgcattggcaggcagattat240agaatgtctcacttggtgtattttatctctagtaggtttgtctcttccctgtagaagaga300aaccgctacagtactgaaaaaaaaagacacaagataaaaaggcaggaaacatttttgcta360ggtcaagcttaaggcagatgcatagctgtagtgttacataatatcttgatacaatagtgt420gggcgggggcttttggctgcacgcctgcgagatgcaaaacaacacacaattcaacatgtg480ggagttgacttttacagctgctctcagatgaacacagtgttttctctccttgccatgaaa540ggttttcattgtccatccctgcctgtgaaagaccaaagcaaaatgggcagacctgaagaa600atgtgtgcggaatggatccgatataatagcttagctctctgagtcagtgtcagcctctgt660gtctgccatttcacaaagagtcacgctcttggagtagggggtttagctgtgactcaccca720gtgagtctgctactttaaaaggactgctggatcttggccaggtccagggtctagggcttg780actatggcttatatctctctgctgagagactgggtatagataaacaaagcacgagatcca840aatcaactttgccgcctgatgtattttatgtcaccagagaacaaggatgatattatgtta900catcatcggttttagtaaagagttttgtatacacaccaaagtgcaacctctttatgccgc960agccctcttctcattcttttcatccatactctgaactaatgacccttcatgagcttgttg1020aaaaagtgcctgcttggcccggcaacaggagtgttgtcctgttgaaacggagggacagat1080ccctcaggacagcaacctatttcagcttgttgtcataacaaacagattatttagagccag1140aatgacgggcaatgtttccacatcacagtcaggcatctttgtgcctaggagagactgaca1200gaaactgattaagactggtgagggtggtatggctgatagacaaaaataccaccacaaaac1260ctcaacaatctcaaagtagcacagtaactattctgttctattctgcaactccatgtgtta1320ctgttacacatggtactacacagtacacacggtactagataatgttgagagtcctcaaaa1380tactggatctagtttagtttgcttctgaaaaaaaacttcagtcaaacttaattttttcaa1440tatttgcattaagtatgtttatgaattgtaggggataagtagaataaatacaaagtcaac1500atgcattctgtctgccacatagtgcagtcattccctcaagcaccttccttatcctttatt1560gcttttatttccatttaatatccattttgcaaatacctacaagattggtgtaccataata1620cattttttgttataaactgaatgaatctttcagattag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