本發(fā)明涉及一種鯉魚水腫病毒的檢測方法和檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

鯉魚水腫病毒病(Carp edema virus disease,CEVD)，又名鯉魚病毒性昏睡病(Viral edema of carp,VEC)或鯉魚昏睡病(Koi sleep disease,KSD)，是一種新興的危害錦鯉和鯉魚養(yǎng)殖的傳染性疾病。該病于1974年在日本錦鯉上首次報道，后經(jīng)鑒定其病原為一種痘病毒——鯉魚水腫病毒(Carp edema virus,CEV)，之后相繼在英國、荷蘭、奧地利、德國、美國等國也報道檢出該病毒，呈現(xiàn)出在世界范圍內(nèi)流行的趨勢。CEV病毒表現(xiàn)出很高的死亡率，例如，健康的幼體階段的錦鯉在感染CEV病毒后，死亡率高達80％。因此，盡快在我國開展該病毒的篩查，對于確保我國鯉魚等重要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的生產(chǎn)安全尤為重要，而一種快速、有效、準(zhǔn)確的檢測方法是開展此類篩選工作和疾病預(yù)防工作的前提。

目前，針對CEV病毒的檢測方法非常少，國內(nèi)尚未有報道。CEVD的主要臨床癥狀表現(xiàn)為“昏睡”、爛鰓、凹眼、水腫等，部分嘴部周圍和鰭條背部有出血，這些癥狀與包括鯉皰疹病毒病(Koi herpesvirus disease，KHVD)在內(nèi)的很多其它疾病非常相似。因此，很難通過臨床癥狀判斷魚體是否感染CEV病毒。此外，也尚未有用細胞成功分離培養(yǎng)CEV病毒的報道。國外針對CEV病毒已經(jīng)建立了基于巢式PCR和Taqman探針熒光定量PCR法，但這些方法都存在各自的不足，例如，巢式PCR的耗時太長，有學(xué)者報道該方法容易產(chǎn)生非特異性條帶，嚴(yán)重影響了檢測結(jié)果，我們在實際檢測工作過程中也遇到了這個問題；熒光定量PCR對設(shè)備、檢測環(huán)境和人員技能要求極高，檢測成本也較高，這在很大程度上影響了該方法的普及和使用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明首次建立了一種針對CEV病毒的單輪常規(guī)PCR體系，用于快速、準(zhǔn)確檢測水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中是否感染CEV病毒，為國內(nèi)開展CEV病毒篩查以及后續(xù)疾病防控體系的建立提供有力的支撐。本發(fā)明提供了一種檢測鯉魚水腫病毒的試劑盒和方法。

首先，本發(fā)明提供了SEQ ID NO：1～2所示的引物對。

本發(fā)明還提供了SEQ ID NO：1～2所示的引物對在制備擴增或檢測來自鯉魚水腫病毒的基因的試劑中的用途。

本發(fā)明還提供了檢測鯉魚水腫病毒的試劑盒，包含序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物對，擴增來自鯉魚水腫病毒的基因。

本發(fā)明還提供了檢測鯉魚水腫病毒的方法，包括如下步驟：

a，提取樣本DNA：提取待檢樣本中的DNA；

b，基因擴增：用權(quán)利要求1所述的試劑盒對待檢樣本中的DNA進行擴增；

c，結(jié)果檢測：對DNA擴增結(jié)果進行檢測。

其中，步驟a所述的樣本為魚體或養(yǎng)殖水體。優(yōu)選地，所述的魚體為魚體的鰓組織。

本發(fā)明提供的試劑盒和方法可以特異的擴增鯉魚水腫病毒的基因，而不會擴增得到其他魚類致病菌的基因片段，可以準(zhǔn)確、有效的檢測出待檢樣本是否感染鯉魚水腫病毒，特異性強，可以有效區(qū)分鯉魚水腫病毒與其他常見水產(chǎn)病原菌，且靈敏度高耗時短，檢測快速，可以用于魚病的快速檢測和預(yù)測，預(yù)防魚病的發(fā)生，提高經(jīng)濟效益。

下面通過具體實施方式對本發(fā)明做進一步詳細說明，但是并不是對本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

附圖說明

圖1引物PCR測試結(jié)果。

M：DNA Marker II；1：疑似患CEVD鯉魚的鰓組織；2：空白對照。

圖2特異性檢測結(jié)果。

M：DNA Marker I；1：空白對照；1～9：依次為患病鯉魚肝、脾、腎、肌肉、眼、腦、腸道和腸道內(nèi)容物等8種組織；10～12：依次為CyHV-2、CyHV-3、草魚出血病病毒；13～17：依次為無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、類志賀毗鄰單胞菌、維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌；18：陽性對照。

圖3靈敏度檢測結(jié)果。

M：DNA Marker I；1～10：10倍梯度稀釋的重組質(zhì)粒DNA，1.5×10¹copies/μL至1.5×10¹⁰copies/μL；11：陽性對照；12：空白對照。

圖4實際樣品部分PCR檢測結(jié)果。

1：空白對照；2,5,8,11：分別為不同患病魚體的鰓組織；3,6,9,12：分別為不同患病魚體的脾組織；4,7,10,13：分別為不同患病魚體的腎組織；M：DNA Marker II；14：陽性對照

具體實施方式

一、實驗材料和儀器

1、病毒、菌種及鯉魚樣本

鯉科皰疹I(lǐng)I型病毒(CyHV-2)、鯉科皰疹I(lǐng)II型病毒(CyHV-3)、草魚出血病病毒、無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、類志賀毗鄰單胞菌、維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌等均為通威股份有限公司動物保健研究所保存，其中3種病毒均為保存于-80℃的DNA樣品。疑似患CEVD病(即具有“昏睡”、爛鰓、凹眼等癥狀)的鯉魚(Cyprinus carpio)采集自河南、天津和沈陽等地的鯉魚養(yǎng)殖池塘，均保存于-80℃。

2、主要試劑與儀器

基因組DNA提取試劑盒購于Takara公司；2×PCR mix購于Tiangen公司。主要儀器包括：組織研磨器(Tiangen)、常規(guī)PCR儀(Bio-rad)、電泳儀(Bio-rad)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)、離心機(科大中佳)、移液器(Eppendorf)

實施例1 引物設(shè)計

一、實驗方法

1、PCR引物設(shè)計與合成

選取GeneBank數(shù)據(jù)庫中收錄的CEV病毒序列(序列登錄號：KM283182.1，KX186571.1)，在這兩段序列的保守區(qū)域設(shè)計了1對PCR引物，送至上海生工進行引物合成，序列及產(chǎn)物大小見表1。

表1 PCR引物

2、細菌活化及模板制備

實驗前用培養(yǎng)基分別活化無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、類志賀毗鄰單胞菌、維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌，使用基因組DNA提取試劑盒(Takara)進行DNA提取，具體提取步驟參見試劑盒使用說明書。

解剖疑似患CEVD的鯉魚，依次取鰓、脾、腎等組織，使用組織研磨器進行勻漿研磨，同樣使用基因組DNA提取試劑盒(Takara)進行DNA提取，具體提取步驟參見試劑盒使用說明書。

鯉科皰疹I(lǐng)I型病毒(CyHV-2)、鯉科皰疹I(lǐng)II型病毒(CyHV-3)和草魚出血病毒為實驗已保存的DNA液，可直接用于PCR檢測。

無菌條件下去取5尾疑似患CEVD病鯉魚鰓組織，混合為1個樣，按照前述述方法進行DNA提取，作為引物測試模板。

3、PCR擴增和檢測

PCR反應(yīng)總體系為25μL，包含1×PCR mix，0.3μmol/L primer F，0.3μmol/L primer R，2.5μL模板，補水至2.5μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5min；然后38個循環(huán)(95℃變性15s，60℃退火20s，72℃延伸30s)，最后72℃延伸7min；4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物采用2％濃度瓊脂糖凝膠進行電泳分析，電泳條件為電壓200V，時間20min。

選擇經(jīng)PCR擴增及電泳檢測確定為陽性的PCR產(chǎn)物進行送上海生工進行測序，并對測序結(jié)果進行Blast序列檢索分析。

二、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，使用自主設(shè)計的引物能擴增出與預(yù)期大小一致的PCR產(chǎn)物(圖1)；進一步，對該PCR產(chǎn)物進行送測序和Blast檢索分析，結(jié)果表明該PCR產(chǎn)物序列只與已公布的CEV病毒基因序列相匹配，同源性高達100％。

試驗結(jié)果說明，本發(fā)明引物可以準(zhǔn)確擴增鯉魚水腫病毒的基因，可以用于鯉魚水腫病毒。

實施例2 引物特異性試驗

一、試驗方法

1、PCR引物

同實施例1。

2、模板制備：

選取疑似患CEVD病鯉魚1尾，無菌條件下依次取肝、脾、腎、鰓、肌肉、眼、腦、腸道和腸道內(nèi)容物等9種組織；同時，選擇并準(zhǔn)備3種水產(chǎn)常見病毒和5種水產(chǎn)常見細菌作為特異性檢測試驗病毒或菌株，即鯉科皰疹I(lǐng)I型病毒(CyHV-2)、鯉科皰疹I(lǐng)II型病毒(CyHV-3)、草魚出血病病毒、無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、類志賀毗鄰單胞菌、維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌。按照實施例1的方法進行核酸提取和PCR檢測模板準(zhǔn)備。以無菌水作為空白對照，以陽性組織DNA作為陽性對照。

3、PCR擴增和檢測

同實施例1。

二、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，對于患病鯉魚的9種組織，僅在鰓組織中檢測出陽性，這與文獻(Adamek M,Jung-Schroers V,Hellmann J,et al.Concentration of carp edema virus(CEV)DNA in koi tissues affected by koi sleepy disease(KSD)[J].Diseases of Aquatic Organisms,2016,119(3):245-251.)報道的結(jié)果一致，CEV病毒通常是從鰓中被檢出；而且對于3種水產(chǎn)常見病毒和5種水產(chǎn)常見細菌均無交叉反應(yīng)。

本實施例證明了本發(fā)明提供的檢測方法特異性強，可以準(zhǔn)確的將鯉魚水腫病毒與其他水產(chǎn)致病菌準(zhǔn)確的區(qū)別開，可準(zhǔn)確檢測待檢樣本中是否感染鯉魚水腫病毒。

實施例3 引物敏感性試驗

一、試驗方法

1、PCR引物

同實施例1。

2、模板制備：

選擇實施例1中經(jīng)測序驗證為CEV病毒陽性的PCR產(chǎn)物，送至上海生工進行T-A克隆，制備出含該PCR引物擴增靶標(biāo)序列的重組質(zhì)粒。用紫外分光光度計測定該重組質(zhì)粒DNA濃度并換算成拷貝數(shù)為1.5×10¹⁰copies/μL。將該重組質(zhì)粒作為本實驗的標(biāo)準(zhǔn)品原液，進行10倍梯度稀釋，作為引物敏感性測試的模板。

3、PCR擴增和檢測

同實施例1。

二、結(jié)果

如圖3所示，采用濃度為1.5×10¹⁰-1.5×10¹copies/μL重組質(zhì)粒作為模板，測試該PCR體系的靈敏度。實驗結(jié)果表明，該體系可以檢測到最低為1.5×10²copies/μL的模板。

本實施例證明了本發(fā)明提供的鯉魚水腫病毒的檢測方法靈敏度高。

實施例4 組織樣品檢測

一、實驗方法

1、PCR引物

同實施例1。

2、模板制備：

2016-7-22至2016-9-27期間，分6個批次從中國河南、天津和沈陽等鯉魚養(yǎng)殖區(qū)域采集疑似患CEVD病魚共計40尾，分別取鰓、脾、腎組織，按照實施例1的方法進行DNA提取。每次檢測設(shè)置空白對照和陽性對照，以無菌水作為空白對照，以陽性組織DNA作為陽性對照。

3、PCR擴增和檢測

同實施例1。

二、結(jié)果

使用建立的PCR方法對采集自河南、天津和沈陽等3個地方的共40尾疑似患CEVD病鯉魚進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有28尾患病鯉魚PCR檢測呈陽性(部分檢測結(jié)果如圖4所示)，陽性率為70％。

同時，PCR檢測呈陽性的組織幾乎全部為鰓，而脾和腎組織幾乎全部為陰性，僅1尾魚體鰓和脾同時檢測為陽性，這與文獻(Adamek M,Jung-Schroers V,Hellmann J,et al.Concentration of carp edema virus(CEV)DNA in koi tissues affected by koi sleepy disease(KSD)[J].Diseases of Aquatic Organisms,2016,119(3):245-251.)報道的該病毒主要是從鰓中被檢出的說法一致，進一步證明了該方法可以用于實際樣品的檢測。

綜上，本發(fā)明提供的試劑盒和方法可以特異擴增鯉魚水腫病毒，可以準(zhǔn)確、有效的檢測出待檢樣本是否感染鯉魚水腫病毒，同時，敏感性高、特異性強、耗時短，檢測快速，應(yīng)用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 通威股份有限公司

<120> 一種檢測鯉魚水腫病毒的試劑盒和方法

<130> GY005-16P1551

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> Primer F

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<400> 2

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