本發(fā)明屬于細胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及雜交瘤細胞株1A4及其產(chǎn)生的狂犬病毒磷蛋白單克隆抗體。

背景技術(shù)：

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人獸共患病，發(fā)病死亡率幾乎100%，全世界每年有6萬人死于狂犬病，我國是狂犬病流行較為嚴重的國家之一?？袢∈俏覈ǘ▓蟾婀芾淼囊翌悅魅静?，其病原是狂犬病毒（Rabies virus）。磷蛋白在病毒逃逸、病毒轉(zhuǎn)錄復制以及細胞內(nèi)運動中均發(fā)揮著一定的作用，還有可能作為病毒感染的臨床血清檢測抗原。雖然人源抗狂犬病毒藥近年來有了很大的發(fā)展，但是目前仍然沒有開發(fā)出非常有效的治療性藥物，因此，狂犬疫苗仍然是目前防治狂犬病的最有效的手段。

狂犬病毒基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA，全長約12kb，分別編碼酶蛋白(L)、糖蛋白(G)、基質(zhì)蛋白(M)、磷酸化蛋白(P)、核蛋白(N)五個主要結(jié)構(gòu)蛋白。其中，G蛋白和N蛋白含有多個抗原位點，能夠誘導產(chǎn)生抗狂犬病毒抗體。磷蛋白屬于病毒RNA聚合酶的輔助因子，與病毒核蛋白和L蛋白構(gòu)成的復合物緊緊將病毒基因組RNA包裹。磷蛋白是該蛋白復合體中的必要中介，一方面它介導L蛋白聚合酶在N-RNA模板中的正確定位，另一方面它發(fā)揮著分子伴侶的功能，形成復合體阻止其結(jié)合到細胞RNA上并便于其傳遞到病毒RNA包裝成為新的RNPs。磷蛋白是一種多功能蛋白，除了在病毒RNA合成中具有一定的功能外，還能夠與STAT1相互作用，并抑制干擾素信號轉(zhuǎn)導途徑，從而克服感染細胞的抗病毒反應，對抗宿主的先天免疫反應，是先天免疫反應的關(guān)鍵調(diào)控因子。磷蛋白在病毒逃逸、病毒轉(zhuǎn)錄復制以及細胞內(nèi)運動中均發(fā)揮著一定的作用，還有可能作為病毒感染的臨床血清檢測抗原。

自1978年Wiktor和Koprowski首次制備了狂犬病病毒的單克隆抗體以來，越來越多的實驗室建立了狂犬病病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株。但主要集中于病毒核蛋白和糖蛋白上，且狂犬病毒檢測試劑盒僅限于檢測抗病毒糖蛋白和/或核蛋白抗體的間接ELISA檢測方法，在一定程度存在假陽性。而申請人在前期研究中證實在狂犬病毒減毒活疫苗免疫的小鼠中能夠與抗狂犬病毒核蛋白抗體一樣大量產(chǎn)生抗磷蛋白抗體，推測磷蛋白也可能是一種超抗原，具有一定的臨床診斷價值。競爭性ELISA可以有效降低間接ELISA中的非特異性反應。目前狂犬病毒抗體檢測試劑盒僅限于狂犬病毒核蛋白和糖蛋白的檢測，而基于磷蛋白單克隆抗體的狂犬病毒抗體檢測試劑盒尚未見報道。本發(fā)明提供的1A4單克隆抗體亞型為IgG1型，能用于競爭性ELISA、Western-blot和免疫熒光檢測，從而為基于該蛋白臨床檢測方法的建立及該蛋白功能的研究奠定堅實的基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對目前狂犬病嚴重危害人類健康，且防治過程中依然存在各種難處的現(xiàn)狀，而提供一種能與狂犬病病毒中的磷蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體以及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細胞。本發(fā)明的單克隆抗體雜交瘤細胞株產(chǎn)生的單克隆抗體與狂犬病病毒的其他蛋白以及其他抗原和病原體無交叉反應，具有高特異性、高敏感性的優(yōu)點，可以準確檢測狂犬病毒疫苗或感染組織中的磷蛋白成分的含量，具有良好的應用前景。

本發(fā)明的雜交瘤細胞株1A4已于2016年12年12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏地址是：中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO：C2016194。

本發(fā)明另一目的是提供一種由上述雜交瘤細胞株1A4產(chǎn)生的狂犬病毒磷蛋白單克隆抗體，其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明所述的單克隆抗體可經(jīng)生物標記或化學標記得到的標記復合物；所述的生物標記為本領(lǐng)域常規(guī)，如可以是以酶、生物素等標記抗體，優(yōu)選的，所述的生物標記為酶標記，更優(yōu)選地，所述的酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。

本發(fā)明所述的單克隆抗體用于制備檢測狂犬病毒的試劑盒中。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是：如前所述的單克隆抗體在狂犬病毒疫苗生產(chǎn)毒株活力質(zhì)檢中的應用。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是：特異性檢測狂犬病毒病毒抗體的ELISA檢測試劑盒，其是以狂犬病病毒重組磷蛋白作為包被抗原，以酶標記的單克隆抗體作為檢測競爭抗體。其中，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示， 重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明提供的能夠識別狂犬病毒磷蛋白的單克隆抗體具有良好的特異性，實驗表明，各克隆間識別沒有交叉反應。間接ELISA表明這個抗體具有較高的效價，因此可用于狂犬病病毒及疫苗組分的檢測。

本發(fā)明所用試劑盒原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進步效果在于：本發(fā)明提供的單克隆抗體與狂犬病病毒其他蛋白以及其他抗原和病原體無交叉反應，用于檢測具有高特異性、高敏感性的優(yōu)點，可以準確檢測樣品中狂犬病疫苗有效成分或感染組織樣品中磷蛋白的含量，在疫苗和臨床檢測中將會得到廣泛應用。

附圖說明

圖1是狂犬病病毒磷蛋白重組表達的SDS-PAGE電泳圖；其中，M是蛋白分子量標準（kDa），泳道1為未誘導菌體蛋白，泳道2為誘導菌體蛋白，泳道3為純化的狂犬病病毒磷蛋白；

圖2為單克隆抗體的Western blot結(jié)果圖；泳道1為未感染病毒N2a細胞裂解液；泳道2為感染狂犬病毒的N2a細胞裂解液；

圖3為單克隆抗體的免疫熒光結(jié)果圖；其中A圖為沒有感染狂犬病毒的細胞，添加1A4抗體；B圖是感染了狂犬病毒的細胞，添加1A4抗體；C圖是沒有感染狂犬病毒的細胞，添加陽性對照血清；D圖是感染了狂犬病毒的細胞，添加陽性對照血清；

圖4為檢測狂犬病病毒磷蛋白的ELISA法擬合曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內(nèi)容，實施例中方法如無特殊說明的采用常規(guī)方法，使用的試劑如無特殊說明的使用常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配制的試劑。

實施例1：狂犬病毒磷蛋白的表達與純化

一、基因克隆與表達載體構(gòu)建

狂犬病毒Flury-HEP毒株由本實驗室保存，如下所示設計引物擴增目的片段：上游引物 RV-PF：5' -CGCGAATTCATGAGCAAGATCTTTGTTAATCCGAG- 3'；下游引物RV-PR：5'-GTCGACGCCGCTTAGCATGATGTGTAGCGATCCAAGT- 3'；引物兩端分別添加EcoRI和SalI酶切位點；目的片段大小為894bp；將狂犬病毒感染N2a細胞48h后，提抽RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，作為基因克隆的模板。PCR產(chǎn)物用試劑盒純化，克隆至pMD19-T，挑選出陽性克隆并測序。將序列正確的陽性克隆雙酶切，克隆到pET-32a表達載體，轉(zhuǎn)化到Rosetta（DE3）感受態(tài)。

二、表達與純化重組蛋白

將菌液以1:100的體積比擴大培養(yǎng)至OD為0.6 - 1，加入1mM IPTG誘導蛋白，收集菌體后用含有8mol/L尿素的磷酸鹽緩沖液重懸菌體并超聲破碎；離心上清與菌體破碎沉淀，目的蛋白為不可溶性蛋白；用HiTrap TALON crude（GE）純化目的蛋白并用SDS-PAGE檢測（圖1）。

實施例2：雜交瘤細胞系的建立

一、實驗材料

1、免疫原：以狂犬病病毒重組磷蛋白作為免疫原；

2、培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基購于HyClone公司；HAT購于Gibco公司；HT購于Gibco公司；

3、實驗動物：Balb/c小鼠，8-12周齡，雌性，SPF級動物培養(yǎng)；

4、其他實驗材料：弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購于SIGMA公司；PEG4000購于SIGMA公司；HRP-山羊抗小鼠IgG抗體購于abcam公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

二、雜交瘤細胞系的建立

1、動物免疫

（1）基礎(chǔ)免疫：將免疫原與弗氏完全佐劑等體積混合并充分乳化，小鼠背部皮下多點注射，每只Balb/c小鼠每次注射量為20μg；

（2）持續(xù)免疫：基礎(chǔ)免疫后兩周進行持續(xù)免疫（持續(xù)免疫兩周一次）。將免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混合并充分乳化，小鼠背部皮下多點注射，每只Balb/c小鼠每次注射量為20μg；

（3）加強免疫：在進行細胞融合前3天，經(jīng)腹腔注射含20μg抗原的磷酸鹽緩沖液。

2、雜交瘤細胞的制備

按照常規(guī)方法收集小鼠的脾細胞與SP2/0細胞。細胞計數(shù)后，小鼠的脾細胞與SP2/0細胞個數(shù)比以5:1的比例用PEG4000進行融合。融合細胞用HAT培養(yǎng)基懸浮后，鋪96孔板，于37℃條件培養(yǎng)。融合后兩周，采用間接ELISA實驗檢測細胞培養(yǎng)上清，篩選識別狂犬病病毒重組磷蛋白的雜交瘤細胞株。對所得陽性克隆株采用有限稀釋法進行亞克隆。間接ELISA法的操作步驟如下：以2μg /mL的狂犬病病毒重組磷蛋白進行包板，每孔100μl，37℃培養(yǎng)3h后，PBST洗3次。5%脫脂奶每孔200μL，封閉2h，PBST洗3次。1:1000倍稀釋免疫小鼠血清，作為陽性對照，無克隆生長的培養(yǎng)基上清和正常小鼠血清作為陰性對照，每孔100μL，37℃培養(yǎng)2h后，PBST洗3次。1：5000 倍稀釋HRP-山羊抗小鼠IgG，每孔100μL，37℃培養(yǎng)1h后，PBST洗3次。最后測定450nm OD值。凡OD450大于陰性對照2倍以上者，即可初步判定為陽性克隆。

3、雜交瘤細胞系的建立

經(jīng)過3次亞克隆和間接ELISA篩選，得到1株針對狂犬病病毒重組磷蛋白的，穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系；篩選得到的1株雜交瘤細胞命名為1A4。

4、應用上述雜交瘤細胞系注射小鼠腹腔，收集純化腹水后，將所得的腹水進行效價檢測，結(jié)果如表1所示；

表1狂犬病病毒重組磷蛋白抗體效價檢測（腹水）

；

（1）1A4細胞培養(yǎng)上清中單克隆抗體的效價測定：間接ELISA法檢測上述雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液中單克隆抗體效價為1:50000-1:100000；

（2）小鼠腹水效價的測定：間接ELISA法檢測上述雜交瘤細胞制備的腹水效價為1:100000-1:200000。

5、雜交瘤細胞系的傳代培養(yǎng)

將上述穩(wěn)定分泌1A4的雜交瘤細胞系在含有10％胎牛血清的DPMI-1640培養(yǎng)基中繼續(xù)進行培養(yǎng)、傳代，培養(yǎng)到10代后，雜交瘤細胞系仍然能夠生長良好、穩(wěn)定傳代，培養(yǎng)液上清效價仍然可以達到1×10⁶以上。

以上結(jié)果表明，所得雜交瘤細胞系能夠穩(wěn)定傳代，可以持續(xù)、穩(wěn)定地分泌抗狂犬病病毒磷蛋白的單克隆抗體。

實施例3：抗狂犬病病毒磷蛋白單克隆抗體的大量制備及鑒定

一、抗體制備

選擇6-8周齡Balb/c小鼠，腹腔注射0.5mL液體石蠟，每只小鼠0.5mL。一周后腹腔接種雜交瘤細胞細胞，每只小鼠接種細胞數(shù)為1×10⁵-1×10⁶個。間隔5天后，待腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可用9號針頭采集腹水。

將腹水離心（13000r/min 30分鐘），除去細胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用Protein-Sepharose CL-4B進行純化，上柱液為20mM的PBS緩沖液，柱層析洗脫液為pH2 .7，20mM的甘氨酸緩沖液，得到抗狂犬病病毒重組磷蛋白的單克隆抗體。

二、抗體的鑒定

1、單克隆抗體的Western驗證

狂犬病病毒裂解液用12％的SDS-PAGE分離，160mA處理90min后將蛋白醋酸纖維膜（NC膜）上。NC膜用5％脫脂奶室溫封閉一小時。PBST洗3次之后，加入單克隆抗體作為一抗，室溫孵育1h。PBST洗三次之后，用標記HRP的羊抗鼠IgG Fc二抗(1:5000)室溫孵育1h，最后用EasySee Western Blot Kit (TRAN)檢測免疫反應（圖2）。

2、單克隆抗體的免疫熒光驗證

應用1A4抗體做免疫熒光檢測，將感染狂犬病病毒的N2a細胞和正常的N2a細胞用預冷的細胞固定液（甲醇/丙酮=1:1）固定，室溫風干后，進行5%脫脂奶封閉。加入單克隆抗體1A4作為一抗，再加入用異硫氰酸熒光素（FITC）偶聯(lián)的羊抗鼠IgG Fc作為二抗，用PBST洗三次后用熒光顯微鏡觀察，檢測結(jié)果顯示(見圖3)，狂犬病毒陽性血清和1A4抗體均在未感染的陰性NA細胞無熒光，在狂犬病病毒HEP-Flury感染的N2a細胞(Flury-N2a)有熒光信號，且有明顯的細胞輪廓，該結(jié)果驗證1A4抗體為特異性識別狂犬病病毒磷蛋白的抗體。

3、識別狂犬病病毒磷蛋白1A4可變區(qū)序列測定

將克隆的細胞提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用可變區(qū)通用引物進行高保真PCR擴增，將PCR產(chǎn)物片段插入到T載體內(nèi)進行DNA序列測定，并將獲得的序列翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸序列。識別磷蛋白的1A4的抗體的可變區(qū)氨基酸序列：輕鏈如SEQ ID NO:1所示，重鏈如SEQ ID NO:2所示。

實施例4：應用純化抗體制備抗狂犬病病毒檢測試劑

ELISA競爭法：確定以狂犬病病毒重組磷蛋白為包被抗原，用HRP標記1A4作為檢測抗體，確定了ELISA檢測方法，試劑盒檢測靈敏度可達0.1IU/mL，具體的結(jié)果如表2所示，根據(jù)結(jié)果制定的擬合曲線如圖4所示。

表2 ：ELISA法檢測狂犬病病毒磷蛋白的檢測結(jié)果

；

檢測方法：包被抗原用pH 9.6 0.05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液稀釋成5μg/mL，每孔加100μL，37℃包被3h，傾去包被液，用PBST洗滌3次，拍干。加入200μL 5％脫脂奶，37℃ 封閉2小時，用PBST洗滌3次。分別加入HRP-1A4、等體積混勻的HRP-1A4和待測血清100μL/孔，37℃孵育1小時，用PBST洗滌3次。加入顯色劑100μL/孔，37℃避光反應15分鐘后，2M H₂SO₄終止液100μL/孔終止顯色反應，讀取OD450數(shù)值。

檢測結(jié)果見表2，說明本申請的抗狂犬病病毒磷蛋白單克隆抗體具有良好的靈敏性。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110> 昆明理工大學

<120> 一種雜交瘤細胞株及其產(chǎn)生的狂犬病毒磷蛋白單克隆抗體

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 103

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr

1 5 10 15

Ile Thr Cys Gly Pro Ser Asp Asn Ile Tyr Gly Ala Leu Asn Trp Phe

20 25 30

Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr

35 40 45

Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly

50 55 60

Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Phe Thr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

85 90 95

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100

<210> 2

<211> 109

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asn Tyr Gly

20 25 30

Ile Ile Trp Val Gln Glu Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Phe Asp Asn Glu Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Lys Val Ile Thr Thr Ala Thr Arg Tyr Phe Asp Val

100 105

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcgaattca tgagcaagat ctttgttaat ccgag 35

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcgacgccg cttagcatga tgtgtagcga tccaagt 37