本發(fā)明涉及葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因多重PCR檢測技術(shù)，屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體是關(guān)于畜禽葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因多重PCR檢測技術(shù)方法及其在畜禽葡萄球菌耐藥性檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是一類具有大環(huán)內(nèi)酯環(huán)這一基本化學(xué)機(jī)構(gòu)和相似抗菌譜的抗菌藥物，可按組成大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的碳原子數(shù)進(jìn)一步分為14、15、16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。大環(huán)內(nèi)酯類有第一代替代青霉素的紅霉素等，第二代的克拉霉素，羅紅霉素等。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是一類快速抑菌劑。葡萄球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥是由于ermA、ermB、ermC基因介導(dǎo)的23SrRNA甲基化酶核糖體靶位修飾導(dǎo)致的，攜帶ermA、ermB、ermC基因同時(shí)也對(duì)林可霉素類抗生素耐藥。erm基因編碼23SrRNA甲基化酶，通過使23SrRNA甲基化，減少大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素類抗生素與葡萄球菌核糖體的連接，從而使葡萄球菌對(duì)該類藥物耐藥。近年來，大量抗生素的不合理應(yīng)用，臨床細(xì)菌性疾病耐藥現(xiàn)象不斷增加，引起正常菌群失調(diào)和大量耐藥菌株出現(xiàn)。大環(huán)內(nèi)酯類藥物在臨床廣泛應(yīng)用，越來越多該類抗生素耐藥菌株出現(xiàn)，常導(dǎo)致臨床治療失敗。這就需要一種能方便快捷的檢測細(xì)菌耐藥性的方法，從而為及早發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)菌，合理安排用藥方案，提高臨床治療效率。傳統(tǒng)的細(xì)菌耐藥性檢測方法主要有常規(guī)藥敏試驗(yàn)、抗性蛋白檢測方法和耐藥性分子檢測方法等。這些方法的特點(diǎn)是易操作、成本低，藥物可靈活選擇，缺點(diǎn)是操作繁瑣、經(jīng)驗(yàn)依賴性強(qiáng)、報(bào)告結(jié)果慢。因?yàn)榭咕幬锏膹V泛使用及耐藥基因的多樣性、復(fù)雜性，單一臨床病原菌經(jīng)常含有多個(gè)耐藥基因，為了提高檢測的準(zhǔn)確性和特異性，需要對(duì)多種耐藥基因進(jìn)行檢測。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，提供一種快速檢測畜禽葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因的三重PCR檢測試劑盒及其特異性引物、使用方法，能顯著提高畜禽葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性的檢測靈敏度和檢測效率，降低檢測成本，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的成本高、耗時(shí)長等諸多不足。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容：一種畜禽葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因多重PCR檢測試劑盒，含有PCR模板制備試劑和耐藥基因多重PCR擴(kuò)增試劑，所述PCR模板制備試劑是由樣品洗滌液25mL～50mL和處理液2.5mL～5.0mL組成，所述耐藥基因多重PCR擴(kuò)增試劑包括2×TaqPCRMasterMix650μL～1300μL，三種耐藥基因即ermA基因、ermB基因、ermC基因的特異性引物400μL～800μL，滅菌雙蒸水1mL～2mL。滅菌雙蒸水1mL～2mL和陰性對(duì)照100μL～200μL、陽性對(duì)照100μL～200μL。所述三種耐藥基因即ermA基因、ermB基因、ermC基因的特異性上下游引物序列如下：ermA：For：5-TACACTTGGCTTAGGATG-3；Rev-1：5-TGACTAAAGAAGCGGTAA-3；ermB：For：5-AACGACGAAACTGGCTAA-3；Rev-2：5-CTGTGGTATGGCGGGTAA-3；ermC：For：5-TCAAAACATAATATAGATAAA-3；Rev-3：5-GCTAATATTGTTTAAATCGTCA-3。本發(fā)明所述試劑盒使用方法包括以下步驟：PCR模板的制備方法：(1)普通培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)增菌；(2)取1mL經(jīng)3-6h培養(yǎng)的菌液于無菌1.5mLEP管中，8000r/min離心3分鐘，棄上清，再加入1mLPCR模板制備試劑洗滌液，重復(fù)離心一次，棄上清，最后加入100μLPCR模板制備試劑樣品處理液，震蕩混勻后備用；畜禽葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因多重PCR檢測技術(shù)中試劑的組成：(1)取2x的TaqPCRMasterMix25μL，耐藥基因引物3.2μL于無菌的PCR反應(yīng)薄壁管中。(2)加入已制備好模板2μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)至50μL即可；PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：(1)95℃預(yù)變性4min；(2)95℃變性45s、54℃退火40s、72℃延伸45s，共33個(gè)循環(huán)；(3)72℃延伸10min，取出至4℃保存?zhèn)溆?；耐藥基因檢測結(jié)果判定取8μLPCR產(chǎn)物，于1.2％瓊脂糖凝膠中電泳，100V電壓，電泳30min，于凝膠成像儀下拍照判定結(jié)果，其中308bp、413bp、640bp的條帶分別指示ermA基因、ermB基因、ermC基因。本發(fā)明有益效果：本發(fā)明將顯著提高畜禽葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因的檢測效率；本發(fā)明所建立試劑盒適用于檢測畜禽源致病葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性，能實(shí)現(xiàn)臨床病例和產(chǎn)品污染程度的快速評(píng)價(jià)，為該類疾病的防控提供技術(shù)支持與理論依據(jù)，并為動(dòng)物性食品安全檢測提供可靠技術(shù)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下技術(shù)效果和特點(diǎn)：(1)便捷性好：本發(fā)明以PCR為技術(shù)基礎(chǔ)，相比傳統(tǒng)病原分離鑒定、藥物敏感試驗(yàn)，不僅能提高檢測效率，還降低了檢測成本，縮短了檢測時(shí)間，該多重方法將檢測時(shí)間從數(shù)天縮短至1天內(nèi)完成。(2)特異性好：本發(fā)明應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，針對(duì)特定基因設(shè)計(jì)引物，保證檢測結(jié)果的特異性。(3)敏感性高：本發(fā)明基于PCR技術(shù)建立的PCR試劑盒，可檢測病原核酸量最低至1.0×102copies/μL。(4)病原菌經(jīng)常含有多種大環(huán)內(nèi)酯酶基因，而該技術(shù)滿足了同時(shí)檢測多種基因的需求，提高了檢測的準(zhǔn)確性和特異性。該技術(shù)可用于檢測臨床分離菌中三種大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因。附圖說明圖1為本發(fā)明畜禽葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因多重PCR檢測試劑盒的制備流程圖。具體實(shí)施方式畜禽葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因多重PCR檢測試劑盒，含有PCR模板制備試劑和耐藥基因多重PCR擴(kuò)增試劑，所述PCR模板制備試劑是由樣品洗滌液25mL～50mL和處理液2.5mL～5.0mL組成，所述耐藥基因多重PCR擴(kuò)增試劑包括2×TaqPCRMasterMix650μL～1300μL，耐藥基因即ermA基因、ermB基因、ermC基因的特異性引物400μL～800μL，滅菌雙蒸水1mL～2mL和陰性對(duì)照100μL～200μL、陽性對(duì)照100μL～200μL。所述三種耐藥基因即ermA基因、ermB基因、ermC基因的特異性上下游引物序列如下：ermA：For：5-TACACTTGGCTTAGGATG-3；Rev-1：5-TGACTAAAGAAGCGGTAA-3；ermB：For：5-AACGACGAAACTGGCTAA-3；Rev-2：5-CTGTGGTATGGCGGGTAA-3；ermC：For：5-TCAAAACATAATATAGATAAA-3；Rev-3：5-GCTAATATTGTTTAAATCGTCA-3。本發(fā)明所述試劑盒使用方法包括以下步驟：PCR模板的制備方法：(1)普通培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)增菌；(2)取1mL經(jīng)3-6h培養(yǎng)的菌液于無菌1.5mLEP管中，8000r/min離心3分鐘，棄上清，再加入1mLPCR模板制備試劑洗滌液，重復(fù)離心一次，棄上清，最后加入100μLPCR模板制備試劑樣品處理液，震蕩混勻后備用。畜禽葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因多重PCR檢測技術(shù)中試劑的組成：(1)取2x的TaqPCRMasterMix25μL，耐藥基因引物3.2μL于無菌的PCR反應(yīng)薄壁管中。(2)加入已制備好模板2μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)至50μL即可。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：(1)95℃預(yù)變性4min；(2)95℃變性45s、54℃退火40s、72℃延伸45s，共33個(gè)循環(huán)；(3)72℃延伸10min，取出至4℃保存?zhèn)溆?。耐藥基因檢測結(jié)果判定取8μLPCR產(chǎn)物，于1.2％瓊脂糖凝膠中電泳，100V電壓，電泳30min，于凝膠成像儀下拍照判定結(jié)果，其中308bp、413bp、640bp的條帶分別指示ermA基因、ermB基因、ermC基因。詳細(xì)示例：1、配制反應(yīng)液(1)配制引物混合液A.設(shè)計(jì)并合成引物針對(duì)葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因ermA基因、ermB基因和ermC基因，用軟件PrimerPremier5.0分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，并合成引物。B.制備引物混合液將三對(duì)引物稀釋至濃度10μmol/L后，取200μL，混勻。(2)多重PCR反映緩沖液取適量TaqPolymerase、dNTPeach、Tris-HCl(pH8.3)、KCl、MgCl2儲(chǔ)備液溶于500μL雙蒸水，使TaqPolymerase終濃度為0.1U/μl、dNTPeach終濃度為500μmol/L、Tris-HCl(pH8.3)終濃度為20mmol/L、KCl終濃度為100mmol/L、MgCl2終濃度為3mmol/L。于-20℃?zhèn)溆谩?、制備陰/陽性對(duì)照(1)制備陽性對(duì)照取普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類3種耐藥株單個(gè)菌落分別接種于普通營養(yǎng)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的培養(yǎng)液1.5mL以4℃10000r/min離心1min，棄上清，提取3種大腸桿菌耐藥菌株基因組DNA。(2)制備陰性對(duì)照以滅菌超純水為陰性對(duì)照。3、檢測過程(1)反應(yīng)體系取無菌PCR反應(yīng)管，按表1向內(nèi)依次加入所述試劑；表1試劑添加及用量試劑及添加量陽性對(duì)照陰性對(duì)照待檢樣本反應(yīng)緩沖液25μL25μL25μL引物混合液3.2μL3.2μL3.2μL陽性對(duì)照3μL00陰性對(duì)照03μL0待檢樣本001μL～3μL滅菌超純水補(bǔ)足50μL補(bǔ)足50μL補(bǔ)足50μL(2)反應(yīng)程序?qū)CR反應(yīng)管混勻瞬時(shí)離心后，加入20.0μL滅菌液體石蠟覆于液面上，并置PCR反應(yīng)管于PCR擴(kuò)增儀中，以95℃預(yù)變性4min；95℃變性45s、54℃退火40s、72℃延伸45s，共33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，取出4℃保存?zhèn)溆谩?3)結(jié)果判定取8μL擴(kuò)增產(chǎn)物以1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，結(jié)果判定：陽性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)清晰的目的條帶，陰性對(duì)照無任何條帶出現(xiàn)；若待檢擴(kuò)增模板出現(xiàn)與陽性對(duì)照相同條帶，則判定待檢樣本陽性，若無任何條帶出現(xiàn)則判定待檢樣本陰性。根據(jù)耐藥基因片段大小與所示陽性對(duì)照基因一致性，判定是存在哪種耐藥基因。當(dāng)前第1頁1 2 3