本發(fā)明屬于亞油酸甘油三酯的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種草酸青霉菌及其在制備亞油酸甘油三脂中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

亞油酸是一種公認(rèn)的必需脂肪酸。由于亞油酸能降低血液膽固醇，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化而倍受重視。亞油酸具有降低血脂、軟化血管、降低血壓、促進(jìn)微循環(huán)的作用，可預(yù)防或減少心血管病的發(fā)病率，特別是對(duì)高血壓、高血脂、心絞痛、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、老年性肥胖癥等的防治極為有利，能起到防止人體血清膽固醇在血管壁的沉積，有“血管清道夫”的美譽(yù)，具有防治動(dòng)脈粥樣硬化及心血管疾病的保健效果。

由于亞油酸氧化性強(qiáng)，容易酸敗，氣味不好等特點(diǎn)，亞油酸常以甘油酯的形式存在，更加穩(wěn)定，氣味和味道更平和，也容易被人和動(dòng)物吸收，越來(lái)越受到人們的重視，因此亞油酸甘油酯可以作為亞油酸的代替品，在食品和醫(yī)藥行業(yè)具有潛在的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)在制備亞油酸甘油三脂的方法主要有化學(xué)合成法、酶催化法。目前還沒(méi)有利用發(fā)酵法從草酸青霉菌中制備亞油酸甘油三脂的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種草酸青霉菌及其在制備亞油酸甘油三脂中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果是，一種草酸青霉菌，其保藏的分類學(xué)名稱為草酸青霉菌（Penicillium oxalicum ）CLP001，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)；保藏日期：2016年11 月24 日，保藏號(hào)為: CCTCC M 2016675。該菌的18sDNA序列如序列表：

GTATAGACCTACCTGATCCGAGGTCACCTGGTTAAGATTGATGGTGTTCGCCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGCCCCCCGGAAGCGGGGGGCGAGAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTTAGTCAAGTACTCAGACTGCAATCTTCAGACAAGAGTTCGTTTGTGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGGATGCCCCCCGGCGGCCGTGAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACGATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTT。

所述的草酸青霉菌在制備亞油酸甘油三脂中的應(yīng)用，亞油酸甘油三脂的結(jié)構(gòu)式如下：

所述草酸青霉菌在制備亞油酸甘油三脂中的應(yīng)用具體包括以下步驟：

（1）菌種活化：將草酸青霉菌接種到平板培養(yǎng)基上，20~25℃下培養(yǎng)48小時(shí)，獲得活化菌種；

（2）初級(jí)培養(yǎng)：將步驟（1）中得到的活化菌種接種到SD培養(yǎng)基中，在120r/min，20℃條件下，搖床培養(yǎng)48h，得種子液；

（3）次級(jí)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的種子液接種到SD培養(yǎng)基中，種子液的體積為SD培養(yǎng)基體積的1~2%，在20℃條件下，靜置培養(yǎng)20d得發(fā)酵液；

（4）粗提物制備：將步驟（3）制備的發(fā)酵液減壓抽濾，得到菌絲體，菌絲體干燥后使用乙酸乙酯浸提，浸提液減壓濃縮得粗提物；

（5）凝膠柱層析粗分：將步驟（4）制備的粗提物使用凝膠柱層析分離，經(jīng)薄層層析檢測(cè)，合并相同流份并減壓干燥，得粗產(chǎn)物；凝膠柱中所用凝膠為羥丙基葡聚糖凝膠，流動(dòng)相為二氯甲烷:甲醇=1:1混合液；

（6）將步驟（5）得到的粗產(chǎn)物經(jīng)正相硅膠柱層析分離，得亞油酸甘油三酯。

所述步驟（4）中乙酸乙酯浸提的過(guò)程如下：菌絲體使用乙酸乙酯靜置浸提10~14h，過(guò)濾，得一次浸提后菌絲體和第一次浸提液；將一次浸提后菌絲體用乙酸乙酯超聲浸提25~35min，過(guò)濾，得二次浸提后菌絲體和第二次浸提液；將二次浸提后菌絲體用乙酸乙酯超聲浸提25~35min，過(guò)濾，得三次浸提后菌絲體和第三次浸提液；合并三次的浸提液。

所述步驟（6）的具體過(guò)程如下：將步驟（5）得到的粗產(chǎn)物經(jīng)正相硅膠柱層析，以石油醚:丙酮體積比=100:1~10:1梯度洗脫，取石油醚:丙酮體積比=50:1部分洗脫液，經(jīng)減壓濃縮干燥得亞油酸甘油三酯。

所述平板培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10.0g/L、酵母浸出粉10.0g/L、葡萄糖40.0g/L、瓊脂20.0g/L，pH 6.0±0.1。

所述SD培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10.0g/L、葡萄糖40.0g/L，pH 自然。

本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果是：本發(fā)明以草酸青霉菌為原料進(jìn)行亞油酸甘油三酯的提取，具有選擇性高、環(huán)境友好等特點(diǎn)，而且產(chǎn)率可達(dá)到20%；且提取方法簡(jiǎn)單，成本低，具有可持續(xù)性，制得的亞油酸甘油三酯純度高（可達(dá)99%），在食品和醫(yī)藥行業(yè)具有潛在市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1制備的亞油酸甘油三酯的¹H NMR圖；

圖2為實(shí)施例1制備的亞油酸甘油三酯的¹³C NMR圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。以下實(shí)施例中的所用的草酸青霉菌菌株從河南省河南大學(xué)校園內(nèi)植物垂絲海棠葉子中分離篩選出來(lái)的，篩選按以下步驟進(jìn)行：將采集的新鮮垂絲海棠葉子，無(wú)菌水洗干凈，70%乙醇浸泡消毒3min，無(wú)菌水洗三次，去除乙醇，并取最后一次的無(wú)菌水進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)；去除葉子邊緣，切成0.5×0.5 cm 小塊，放入培養(yǎng)基（蛋白胨10.0g/L、酵母浸出粉10.0g/L、葡萄糖40.0g/L、瓊脂20.0g/L，青霉素25萬(wàn)單位/L）中培養(yǎng)。待切開(kāi)長(zhǎng)出菌絲，通過(guò)平板劃線法連續(xù)分離純化3次，得到表面形態(tài)一致的內(nèi)生菌。得到的內(nèi)生菌經(jīng)與NCBI比對(duì)相似度，表明分離得到的內(nèi)生真菌為草酸青霉菌，命名為草酸青霉（Penicillium oxalicum）CLP001，該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏日期：2016年11 月24 日，保藏編號(hào)：CCTCC NO：CCTCC M 2016675）。

實(shí)施例1

所述草酸青霉菌在制備亞油酸甘油三脂中的應(yīng)用具體包括以下步驟：

（1）菌種活化：將草酸青霉菌接種到平板培養(yǎng)基上（平板培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10.0g/L、酵母浸出粉10.0g/L、葡萄糖40.0g/L、瓊脂20.0g/L，pH 6.0±0.1），25℃下培養(yǎng)48小時(shí)，獲得活化菌種；

（2）初級(jí)培養(yǎng)：將步驟（1）中得到的活化菌種接種到SD培養(yǎng)基（所述SD培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10.0g/L、葡萄糖40.0g/L，pH 自然）中，在120r/min，20℃條件下，搖床培養(yǎng)48h，得種子液；

（3）次級(jí)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的種子液接種到SD培養(yǎng)基中，種子液的體積為SD培養(yǎng)基體積的1.5%，在20℃條件下，靜置培養(yǎng)20d得發(fā)酵液10L；

（4）粗提物制備：將步驟（3）制備的發(fā)酵液減壓抽濾，得到菌絲體，菌絲體經(jīng)40℃恒溫干燥后，使用乙酸乙酯靜置浸提12h（乙酸乙酯與菌絲體體積比為1:1），過(guò)濾，得一次浸提后菌絲體和第一次浸提液；將一次浸提后菌絲體用乙酸乙酯超聲浸提（乙酸乙酯與菌絲體體積比為1:1，超聲浸提時(shí)間為30min），過(guò)濾，得二次浸提后菌絲體和第二次浸提液；將二次浸提后菌絲體用乙酸乙酯超聲浸提（乙酸乙酯與菌絲體體積比為1:1，超聲浸提時(shí)間為30min），過(guò)濾，得三次浸提后菌絲體和第三次浸提液；合并三次的浸提液減壓濃縮得粗提物，回收乙酸乙酯；

（5）凝膠柱層析粗分：將步驟（4）制備的粗提物使用凝膠柱層析分離，經(jīng)薄層層析檢測(cè)，合并相同流份并減壓干燥，得粗產(chǎn)物；凝膠柱中所用凝膠為羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20），流動(dòng)相為二氯甲烷:甲醇=1:1混合液；

（6）將步驟（5）得到的粗產(chǎn)物進(jìn)行正相硅膠柱層析，以石油醚:丙酮體積比=100:1~10:1梯度洗脫，石油醚和丙酮的比每次降低10個(gè)梯度（100:1，90:1，80:1，70:1，60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，10:1）；取石油醚:丙酮體積比=50:1部分洗脫液，經(jīng)減壓濃縮干燥得亞油酸甘油三酯（1050mg，純度99.1%）。

圖1為本實(shí)施例制備的亞油酸甘油三酯的¹H NMR圖，圖2為本實(shí)施例制備的亞油酸甘油三酯的¹³C NMR圖。由圖1－2可知，經(jīng)¹H NMR、¹³C NMR分析，比對(duì)文獻(xiàn)（武拉斌，黃波，肖朝江, 等. 茴香根化學(xué)成分研究[J]. 大理學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 12(9): 1-3.），確認(rèn)提取到的化合物為亞油酸甘油三酯。

上述實(shí)施例為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明所作的改變均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 黃河科技學(xué)院

<120> 一種草酸青霉菌及其在制備亞油酸甘油三脂中的應(yīng)用

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 539

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 1

gtatagacct acctgatccg aggtcacctg gttaagattg atggtgttcg ccggcgggcg 60

ccggccgggc ctacagagcg ggtgacgaag ccccatacgc tcgaggaccg gacgcggtgc 120

cgccgctgcc tttcgggccc gccccccgga agcggggggc gagagcccaa cacacaagcc 180

gtgcttgagg gcagcaatga cgctcggaca ggcatgcccc ccggaatacc agggggcgca 240

atgtgcgttc aaagactcga tgattcactg aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt 300

tcgctgcgtt cttcatcgat gccggaacca agagatccgt tgttgaaagt tttaactgat 360

ttagtcaagt actcagactg caatcttcag acaagagttc gtttgtgtgt cttcggcggg 420

cgcgggcccg ggggcggatg ccccccggcg gccgtgaggc gggcccgccg aagcaacaag 480

gtacgataaa cacgggtggg aggttggacc cagagggccc tcactcggta atgatcctt 539