本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種InDel位點基因型分型的方法。

背景技術(shù)：

插入缺失(Insertion and Deletion，簡稱InDel)是指同源序列的比對中出現(xiàn)的至少1bp核苷酸的差異，這種差異稱為InDels；InDel在基因組中的含量僅次于單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記，具有數(shù)量多、分布廣泛、變異豐富等特點。根據(jù)基因組中插入缺失位點，設(shè)計擴(kuò)增這些插入缺失位點的PCR引物，產(chǎn)生的多態(tài)性位點即為插入缺失(InDel)標(biāo)記。插入缺失(InDel)標(biāo)記在系統(tǒng)發(fā)育推斷、遺傳診斷、藥物設(shè)計等方面具有重要的應(yīng)用潛力。

目前，常用的InDel分型方法主要是測序法和芯片法，測序法和芯片法實驗操作繁瑣、效率較低并且依賴相關(guān)大型儀器平臺作為支撐，費用昂貴。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、操作簡單靈活、準(zhǔn)確的基因型分型的方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種InDel位點基因型分型的方法，包括以下步驟：

1)將目的基因DNA序列進(jìn)行T載體克隆測序，得到目的基因克隆產(chǎn)物序列，將所述目的基因克隆產(chǎn)物序列進(jìn)行多重比對，得到InDel位點；

2)根據(jù)所述InDel位點設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，所述PCR擴(kuò)增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用熒光基團(tuán)修飾；

3)用所述PCR擴(kuò)增引物對待測樣本全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，用毛細(xì)管熒光凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，若擴(kuò)增產(chǎn)物中有兩條條帶則該InDel位點的基因型為雜合型ID；若有一條條帶且片段大小與雜合型ID中大的片段相同，則該InDel位點基因型為插入純合型II；若有一條條帶且片段大小與雜合型ID中小的片段相同，則表示該InDel位點為缺失純合型DD。

優(yōu)選的，所述熒光基團(tuán)為FAM或HEX。

優(yōu)選的，所述多重比對采用MEGA軟件中的ClustalW模塊。

優(yōu)選的，所述待測樣本為楊木樹種。

優(yōu)選的，所述目的基因為尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1。

優(yōu)選的，所述尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1上的InDel位點分別為InDel1、InDel2、InDel3、InDel4和InDel5；所述InDel1位于尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1全長第401bp到409bp處，所述InDel2位于第1399bp到1401bp處，InDel3位于第1427bp到1438bp，InDel4位于第2094bp到2103bp處，InDel5位于第4143bp到4152bp。

優(yōu)選的，根據(jù)InDel1設(shè)計的引物為正向引物SEQ ID NO.1和反向引物SEQ ID NO.2；根據(jù)InDel2和InDel3設(shè)計的引物為正向引物SEQ ID NO.3和反向引物SEQ ID NO.4；根據(jù)InDel4設(shè)計的引物為正向引物SEQ ID NO.5和反向引物SEQ ID NO.6；根據(jù)InDel5設(shè)計的引物為正向引物SEQ ID NO.7和反向引物SEQ ID NO.8。

優(yōu)選的，步驟3)中所述PCR擴(kuò)增的條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，53～57℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；最后72℃延伸5min。

優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增用擴(kuò)增體系包括以下組分：0.7μl的待測樣品全基因組DNA，0.15μl的0.8UTaq酶，0.3μl 0.2mM的dNTPs，0.9μl 25mM的MgCl2，1.25μl的10×PCR buffer，0.4μl 100nmolL^-1的正向引物和0.4μl 100nmolL^-1反向引物和8.4μl的ddH₂O。

優(yōu)選的，所述基因組DNA的濃度為5～20ng/μl。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的InDel位點基因型分型的方法通過多重比對獲得目的基因InDel位點，根據(jù)InDel位點設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，包括正向引物和反向引物，采用熒光基團(tuán)修飾正向引物的5’端，然后對待測樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用毛細(xì)管熒光凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物確定所述待測樣本中InDel位點的基因型。本發(fā)明對引物組中的正向引物5'末端采用熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾，可顯著地保留熒光信號強度、減少InDel位點的非特異性擴(kuò)增，提高了基因型檢測的準(zhǔn)確度；同時極大地簡化了實驗步驟和配套條件，并顯著地降低了實驗成本。

進(jìn)一步的，在適宜退火溫度和PCR反應(yīng)條件下，進(jìn)一步提高熒光信號強度，提高基因型檢測的準(zhǔn)確度。

附圖說明

圖1為實施例1中毛細(xì)管熒光凝膠電泳結(jié)果圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種InDel位點基因型分型的方法，包括以下步驟：1)將目的基因DNA序列進(jìn)行T載體克隆測序，得到目的基因克隆產(chǎn)物序列，將所述目的基因克隆產(chǎn)物序列進(jìn)行多重比對，得到InDel位點；2)根據(jù)所述InDel位點設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，所述PCR擴(kuò)增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用熒光基團(tuán)修飾；3)用所述PCR擴(kuò)增引物對待測樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，毛細(xì)管熒光凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，若擴(kuò)增產(chǎn)物中有兩條目的條帶則該InDel位點的基因型為雜合型ID；若有一條目的條帶且片段大小與雜合型ID中大的片段相同，則該InDel位點基因型為插入純合型II；若有一條目的條帶且片段大小與雜合型ID中小的片段相同，則表示該InDel位點為缺失純合型DD。

本發(fā)明提供的InDel位點基因型分型的方法適用于林木樹種，優(yōu)選的為楊木樹種，如本發(fā)明的實施例中所用毛白楊。

本發(fā)明將目的基因DNA序列進(jìn)行T載體克隆測序，得到目的基因克隆產(chǎn)物序列。本發(fā)明中所述的目的基因為待測樣品的任一基因，優(yōu)選的為尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1，優(yōu)選的所述尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1的序列如SEQ ID NO.9所示。

在本發(fā)明選定目的基因后，將所述目的基因DNA序列進(jìn)行T載體克隆測序，得到目的基因克隆產(chǎn)物序列。本發(fā)明對所述的T載體克隆測序的具體步驟沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域常規(guī)的T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH52感受態(tài)細(xì)胞克隆測序方法步驟即可。

得到目的基因克隆產(chǎn)物序列后，本發(fā)明將所述目的基因克隆產(chǎn)物序列進(jìn)行多重比對，得到InDel位點。在本發(fā)明中，所述的多重比對優(yōu)選的采用MEGA軟件中的ClustalW模塊，具體的多重比對的參數(shù)優(yōu)選的為軟件模塊中的默認(rèn)參數(shù)。

具體的在本發(fā)明實施例中以尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1為目的基因，對目的基因進(jìn)行T載體克隆測序，后采用MEGA軟件中的ClustalW模塊進(jìn)行多重比對，確定的InDel位點有5個，分別為InDel1、InDel2、InDel3、InDel4和InDel5；所述InDel1位于尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1全長第401bp到409bp處，所述InDel2位于第1399bp到1401bp處，InDel3位于第1427bp到1438bp，InDel4位于第2094bp到2103bp處，InDel5位于第4143bp到4152bp。

本發(fā)明在獲得上述InDel位點后，分別根據(jù)上述InDel位點設(shè)計引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用熒光基團(tuán)修飾。優(yōu)選的根據(jù)InDel1設(shè)計的引物為正向引物SEQ ID NO.1和反向引物SEQ ID NO.2；正向引物的序列為UXS1ID1F:5'-CTCCCGCCTTAACCCATCT-3'；反向引物的序列為UXS1ID1R:5'-GTAACCACGATACGCAAACTC-3'；優(yōu)選的在本發(fā)明中針對InDel1設(shè)計的正向引物SEQ ID NO.1的5'末端采用熒光基團(tuán)FAM進(jìn)行修飾。

在本發(fā)明中，由于InDel2和InDel3在尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1的位點相距較近，因此，設(shè)計同一對引物對上述兩個位點同時進(jìn)行擴(kuò)增；優(yōu)選的根據(jù)InDel2和InDel3設(shè)計的引物為正向引物SEQ ID NO.3和反向引物SEQ ID NO.4；正向引物的序列為UXS1ID2F:5'-GTGGTTTTACTCGGTGCTTCT-3'；反向引物的序列為UXS1ID2R:5'-GGCTCCAACTCAGTTCACACTT-3'；優(yōu)選的在本發(fā)明中針對InDel1設(shè)計的正向引物SEQ ID NO.3的5'末端采用熒光基團(tuán)FAM進(jìn)行修飾。

本發(fā)明中，根據(jù)InDel4設(shè)計的引物為正向引物SEQ ID NO.5和反向引物SEQ ID NO.6；正向引物的序列為UXS1ID4F:5'-TTCAGCACTCTACCAGTCCA-3'；反向引物的序列為UXS1ID4R:5'-TCAGGCACACCACGTCAAA-3'；優(yōu)選的在本發(fā)明中針對InDel4設(shè)計的正向引物SEQ ID NO.5的5'末端采用熒光基團(tuán)FAM進(jìn)行修飾。

在本發(fā)明中，根據(jù)InDel5設(shè)計的引物為正向引物SEQ ID NO.7和反向引物SEQ ID NO.8；正向引物的序列為UXS1ID5F:5'-GGCTCTCTTCCGTAATCCA-3'；反向引物的序列為UXS1ID5R:5'-CATTGCAAGGGAAAAACTACAC-3'；優(yōu)選的在本發(fā)明中針對InDel5設(shè)計的正向引物SEQ ID NO.7的5'末端采用熒光基團(tuán)HEX進(jìn)行修飾。

得到PCR擴(kuò)增引物后，本發(fā)明用所述PCR擴(kuò)增引物對待測樣本全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增的條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，53～57℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；最后72℃延伸5min。所述退火溫度更優(yōu)選的為55～56℃；所述PCR擴(kuò)增的體系優(yōu)選的包括以下組分：0.7μl的待測樣本全基因組DNA，0.15μl的0.8UTaq酶，0.3μl 0.2mM的dNTPs，0.9μl 25mM的MgCl2，1.25μl的10×PCR buffer，0.4μl 100nmolL^-1的正向引物和0.4μl 100nmolL^-1反向引物和8.4μl的ddH₂O。

在本發(fā)明中所述待測樣本全基因組DNA采用本領(lǐng)域常規(guī)的基因組DNA的提取方法獲得，具體在本發(fā)明實施例中采用DNA提取試劑盒獲得，具體的可采用sigma公司的植物基因組DNA小量制備試劑盒；所述基因組DNA的濃度優(yōu)選的為5～20ng/μl，更優(yōu)選的為10～15ng/μl。

本發(fā)明在獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，用毛細(xì)管熒光凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小，本發(fā)明對所述的毛細(xì)管熒光凝膠電泳的方法和具體參數(shù)設(shè)置沒有特殊要求，采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法和參數(shù)即可。所述毛細(xì)管熒光凝膠電泳檢測的原理如下：當(dāng)擴(kuò)增片段經(jīng)過掃描儀CCD(charge-coupled device)掃描窗口時，熒光染料分子發(fā)出一定波長的熒光被CCD接收，CCD記錄每一個DNA片段通過的時間并以熒光峰值表示。理論上，熒光峰值出現(xiàn)的時間與擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小呈正相關(guān)，而峰值的高低與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。因此，在正向引物5'末端進(jìn)行熒光基團(tuán)修飾后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過檢測擴(kuò)增產(chǎn)物熒光片段大小的差異，可以判斷目標(biāo)區(qū)域靶位點的InDel類型。在本發(fā)明中，具體的，若擴(kuò)增產(chǎn)物中有兩條條帶則該InDel位點的基因型為雜合型ID；若有一條條帶且片段大小與雜合型ID中大的片段相同，則該InDel位點基因型為插入純合型II；若有一條條帶且片段大小與雜合型ID中小的片段相同，則表示該InDel位點為缺失純合型DD。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的InDel位點基因型分型的方法進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實施例1

材料取自山東冠縣毛白楊基因庫(全國毛白楊種質(zhì)資源庫)中435株個體。

提取每株個體的DNA后，按照地域分布，隨機(jī)挑選45株個體，逐一對其尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1進(jìn)行克隆測序，利用MEGA軟件中的ClustalW程序進(jìn)行多重比對，確定候選InDel1位點。InDel1位于尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1全長第401bp到409bp處，其所在區(qū)域的基因序列如：斜體為InDel1位點。

針對InDel1位點(黑體下劃線標(biāo)注)，整個自然群體包含兩種類型的DNA模板鏈，其中模板鏈I:模板鏈II:3'-GAGGGCGGAATTGGGTAGACTAGGTTGGTGGGTAAGAAGAGAGGGGAGAAGTTAAATGGTA---------NNNNNNNNNNNN-5'。設(shè)計合成一條5'末端用FAM熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾的正向引物：SEQ ID NO.1為UXS1ID1F:5'-CTCCCGCCTTAACCCATCT-3'，一條不進(jìn)行熒光修飾的反向引物：SEQ ID NO.2為UXS1ID1R:5'-GTAACCACGATACGCAAACTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段長度為168bp。

將已知InDel基因型為DD、ID和II的三個待測樣品的基因組DNA模板與所設(shè)計引物組合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序為：預(yù)變性95℃5min，變性95℃30s，退火56℃30s，延伸72℃30s，35個循環(huán)，最后延伸72℃5min，4℃保存。12.5μl反應(yīng)體系中包括：0.7μl 15ng/μl基因組DNA，0.15μl 0.8UTaq酶，0.3μl 0.2mM dNTPs，0.9μl 25mmolL^-1MgCl₂，1.25μl 10×PCRbuffer以及0.4μl100nmolL^-1正向熒光標(biāo)記引物和0.4μl 100nmolL^-1反向引物和8.4μl的ddH₂O。將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管熒光凝膠電泳檢測，每條泳道檢測一株個體的基因型，根據(jù)檢測結(jié)果確定待測樣品的基因型。結(jié)果如圖1所示，圖1中上方為毛細(xì)管熒光電泳成像圖，下部為熒光峰值圖。其中，三個泳道內(nèi)，字母DD表示該個體InDel1位點的基因型為deletion/deletion；字母ID表示該個體InDel1位點的基因型為insertion/deletion；字母II表示該個體InDel1位點的基因型為insertion/insertion。深灰色亮帶為核苷酸分子量Marker，最右側(cè)數(shù)值為核苷酸分子量大小。根據(jù)目的片段的大小，可以確定三株個體的基因型分別是DD、ID和II。

然后再取自山東冠縣毛白楊基因庫中435株個體中按照上述方法進(jìn)行InDel1位點的基因型檢測，其中有27株個體基因型為DD，有383株個體基因型為ID，有25株個體基因型為II。

實施例2

材料取自山東冠縣毛白楊基因庫(全國毛白楊種質(zhì)資源庫)中435株個體。

提取每株個體的DNA后，按照地域分布，隨機(jī)挑選45株個體，逐一對其尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1進(jìn)行克隆測序，利用MEGA軟件中的ClustalW程序進(jìn)行多重比對，確定候選InDel2和InDel3位點。InDel2位于尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1全長第1399bp到1401bp處，InDel3位點位于第1427bp到1438bp處，其所在區(qū)域的基因序列如下：斜體為InDel2位點；斜體為InDel3位點)進(jìn)行基因型檢測。

設(shè)計合成一條5'末端用FAM熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾的正向引物：SEQ ID NO.3為UXS1ID2F:5'-GTGGTTTTACTCGGTGCTTCT-3'，一條不進(jìn)行熒光修飾的反向引物：SEQ ID NO.4為UXS1ID2R:5'-GGCTCCAACTCAGTTCACACTT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段長度為209bp。

按照實施例1的PCR擴(kuò)增程序和體系對山東冠縣毛白楊基因庫中435株個體尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1中的InDel2和InDel3位點基因型進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果為：有373株個體基因型為ID，有62株個體基因型為II；InDel3位點基因型檢測結(jié)果為：435株個體基因型均為ID。

實施例3

材料取自山東冠縣毛白楊基因庫(全國毛白楊種質(zhì)資源庫)中435株個體。

提取每株個體的DNA后，按照地域分布，隨機(jī)挑選45株個體，逐一對其尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1進(jìn)行克隆測序，利用MEGA軟件中的ClustalW程序進(jìn)行多重比對，確定候選InDel4和InDel5位點。InDel4位于尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1全長第2094bp到2103bp處，其所在區(qū)域基因序列如下：斜體為InDel4位點；InDel5位于尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1全長第4143bp到4152bp處，其所在區(qū)域的基因序列如下：斜體為InDel5位點，同時進(jìn)行多位點基因型檢測。

根據(jù)待檢測位點InDel4和DNA模板鏈的序列特點，設(shè)計合成一條5'末端用FAM熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾的正向引物，SEQ ID NO.5為UXS1ID4F:5'-TTCAGCACTCTACCAGTCCA-3'和一條不進(jìn)行熒光修飾的反向引物SEQ ID NO.6為UXS1ID4R:5'-TCAGGCACACCACGTCAAA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段長度為160bp。

根據(jù)待檢測位點InDel5和DNA模板鏈的序列特點，設(shè)計合成一條5'末端用HEX熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾的正向引物：SEQ ID NO.7為UXS1ID5F:5'-GGCTCTCTTCCGTAATCCA-3'和一條不進(jìn)行熒光修飾的反向引物SEQ ID NO.8為UXS1ID5R:5'-CATTGCAAGGGAAAAACTACAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段長度為125bp。

將待測樣品的基因組DNA模板與上述SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.7引物組合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序為：預(yù)變性95℃5min，變性95℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，35個循環(huán)，最后延伸72℃5min，4℃保存。12.5μl反應(yīng)體系中包括：0.7μl 15ng/μl基因組DNA，0.15μl 0.8UTaq酶，0.3μl 0.2mM dNTPs，0.9μl 25mmolL^-1MgCl₂，1.25μl 10×PCR buffer以及0.4μl 100nmolL^-1正向熒光標(biāo)記引物和0.4μl 100nmolL^-1反向引物和8.4μl的ddH₂O。將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管熒光凝膠電泳檢測，每條泳道檢測一株個體的基因型，根據(jù)檢測結(jié)果確定待測樣品的基因型。對山東冠縣毛白楊基因庫中435株個體尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1中的InDel4和InDel5位點基因型進(jìn)行檢測，InDel4位點檢測結(jié)果為：有22株個體基因型為DD，有413株個體基因型為ID。InDel5位點基因型檢測結(jié)果為：有364株個體基因型為ID，有71株個體基因型為II。

由以上實施例可知，應(yīng)用本發(fā)明所述的InDel位點基因型分型方法，對引物組中的正向引物5'末端采用熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾，在最佳退火溫度和PCR反應(yīng)條件下，可以顯著地保留熒光信號強度；利用毛細(xì)管熒光電泳，通過檢測熒光峰值出現(xiàn)的時間和峰值來判斷擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小和數(shù)量，進(jìn)而判斷靶位點的InDel類型，實現(xiàn)對群體中所有個體的待測InDel位點進(jìn)行基因型分型。應(yīng)用毛細(xì)管熒光凝膠電泳技術(shù)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物大小，將檢測精度提高到1bp以內(nèi)；同時，通過在正向引物5'末端修飾不同的熒光基團(tuán)，可同時對多位點的基因型進(jìn)行分型。因此不僅增加了檢測結(jié)果的精確性和可靠性，而且極大地簡化了實驗步驟和配套條件，并顯著地降低了實驗成本。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。