本發(fā)明屬于生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可完全除疤的可逆末端終止功能核苷酸及其在高通量測序技術(shù)上的應(yīng)用。其中可逆末端終止功能核苷酸的連接臂可以經(jīng)過兩步反應(yīng)而被完全去除(可完全去疤)，從而實(shí)現(xiàn)此可逆末端終止功能核苷酸在引物上高效合成延伸和有效終止，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)可逆末端終止測序的長讀長。

背景技術(shù)：

上個(gè)世紀(jì)七十年代，由Sanger等發(fā)明的雙脫氧鏈終止法第一代DNA測序技術(shù)，為科學(xué)發(fā)展做出了重大貢獻(xiàn)，成就了“人類基因組計(jì)劃”。但由于其通量低、成本高等的缺點(diǎn)，所以無法滿足多物種大規(guī)?；蚪M測序以及深度和重復(fù)測序的需求，于是第二代高通量測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。從2005年至今，二代測序技術(shù)發(fā)展十分迅猛，各二代測序平臺的更新?lián)Q代速度之快令人目不暇接，其所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量也呈指數(shù)級增長，這極大地推動(dòng)了幾乎所有生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。目前主流二代高通量測序儀所采用的二代測序技術(shù)主要有“合成測序法”和“連接測序法”兩種。

“可逆末端終止測序法”屬于合成測序法(Sequencing By Synthesis,SBS)的一種，由美國哥倫比亞大學(xué)的Jing yue Ju教授在2003年首先提出并付諸實(shí)踐，是目前市場占有率最高、應(yīng)用前景最被看好的一種二代高通量測序技術(shù)(Li Z,Bai X,Ruparel H,et al.Proc Natl AcadSci U S A.2003,100:414-9.)?？赡婺┒私K止法測序反應(yīng)底物分子是一種具有可逆末端終止功能的核苷酸類似物，稱為“可逆末端終止功能核苷酸”(reversible terminator)。與傳統(tǒng)Sanger測序法所采用的“雙脫氧末端終止功能核苷酸”的最大不同在于，其末端終止基團(tuán)的引物延伸終止功能是可逆的，可以通過一定的化學(xué)轉(zhuǎn)變恢復(fù)為正常的、可以再次進(jìn)行引物延伸的基團(tuán)。

目前，可逆末端終止功能核苷酸大體可分為兩種：(a)第一種在核苷酸戊糖3’端羥基氧上連一個(gè)行使可逆末端終止功能的封閉基團(tuán)。在這種情況下，與堿基上相連的可被切掉的熒光基團(tuán)僅起到測序指示劑的作用(Guo J,Yu L,Turro NJ,Ju J.Acc Chem Res.2010,43(4),551-63.)。(b)第二種可逆末端終止封閉基團(tuán)不位于3’端，而連接于堿基上。與堿基相連的熒光基團(tuán)通常不僅起到測序指示劑的作用，而且也是可逆終止基團(tuán)的一部分，起到了終止引物延伸的作用(Bowers J,Mitchell J,Beer E,et al.Nat Methods.2009,6(8), 593-5.)。這兩種可逆末端終止功能核苷酸各有優(yōu)劣，第一種由于有專門的可逆末端終止基團(tuán)，可逆終止的效果可能會更好一點(diǎn)。第二種由于3’端沒有修飾基團(tuán)，更容易合成也更容易被DNA聚合酶所接受。

3’末端帶有封閉基團(tuán)的可逆末端終止功能核苷酸目前發(fā)展比較成熟并已經(jīng)商品化的有三種：(1)Illumina Solexa所使用的3’-O-N₃可逆末端終止功能核苷酸(Bentley DR,Balasubramanian S,Swerdlow HP,et al.Nature.2008,456(7218),53-9.)。(2)Steven A Benner團(tuán)隊(duì)研發(fā)的3’-ONH₂可逆末端終止功能核苷酸(Hutter D,Kim MJ,Karalkar N.,et al.Nucleos.Nucleot.Nucl.Acids,2010,29,879-895.)。(3)哥倫比亞大學(xué)Jing yue Ju團(tuán)隊(duì)研發(fā)的3’-O-丙烯基可逆末端終止功能核苷酸(Guo J,Yu L,Turro NJ,Ju J.Acc Chem Res.2010,43(4),551-63.)。單就可逆末端終止功能而言，這三種測序試劑的表現(xiàn)都是不錯(cuò)的，其可逆末端終止基團(tuán)和熒光基團(tuán)都可以幾乎100％地被切除。對于可逆末端終止封閉基團(tuán)連接于堿基上的可逆末端終止功能核苷酸，目前已商品化的只有Helicos公司的單分子測序儀所采用的'virtual terminator'。

由于可逆末端終止功能核苷酸采用熒光作為測序指示劑，這極大地增強(qiáng)了測序的靈敏性與準(zhǔn)確率，同時(shí)降低了上樣量；并且由于采用了可逆末端終止測序策略，有效地解決了多聚重復(fù)序列(例如PolyA)的準(zhǔn)確讀取問題。這種測序策略可以準(zhǔn)確讀出大于18個(gè)連續(xù)的A。Solexa公司正是充分利用和發(fā)揮了可逆末端終止測序法的這些優(yōu)勢(并整合了原Illumina在DNA芯片上的優(yōu)勢)，在被Illumina購買后不到5年的時(shí)間內(nèi)，迅速地在二代高通量測序市場上脫穎而出，成為了目前市場上應(yīng)用最廣泛的二代高通量測序儀。其在測序成本和測序通量上都擊敗了其主要競爭對手Life Tech公司ion系列測序平臺，但其在讀長上的優(yōu)勢并不明顯(Chen F,Dong M,Ge M,et al.Genomics Proteomics Bioinformatics.2013,11(1),34-40)。

影響可逆末端終止測序法讀長的原因就在于：每一步切除熒光基團(tuán)后在堿基上留下的連接臂殘余(即疤痕)。每讀出一個(gè)堿基，在延伸的引物上就加上一個(gè)帶有疤痕的脫氧核苷酸。并且，隨著測序引物的合成延伸，這種帶有疤痕的脫氧核苷酸越積越多，這會極大地破壞DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而影響DNA聚合酶與底物的結(jié)合；另一方面，這種帶有疤痕的脫氧核苷酸也會影響DNA聚合酶對底物的識別。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決至少部分上述技術(shù)問題，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，并發(fā)現(xiàn)通過由含有C-C糖苷鍵的核苷酸、連接核苷酸的堿基與熒光基團(tuán)的鄰二醇基可切割連接臂和熒光基團(tuán)三部分構(gòu)成的可逆末端終止功能核苷酸可完全去除連接臂殘余?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。

本發(fā)明的一方面，提供可完全去疤的可逆末端終止功能核苷酸，此功能核苷酸由含有C-C糖苷鍵的核苷酸、連接核苷酸的堿基與熒光基團(tuán)的鄰二醇基可切割連接臂和熒光基團(tuán)三部分構(gòu)成。

在某些實(shí)施方案中，含有C-C糖苷鍵的核苷酸中的核苷酸為選自由dATP、dTTP、dGTP和dCTP組成的組中的至少之一。

在某些實(shí)施方案中，鄰二醇基可切割連接臂具有如下所述的結(jié)構(gòu)式：

-(CH₂)m(CHOH)₂(CH₂)n-

其中m和n分別為1至5的整數(shù)，例如，1、2、3、4或5。

在某些實(shí)施方案中，熒光基團(tuán)選自由Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、羅丹明6G(Rhodamine 6G)、四甲基羅丹明(Tetramethyl rhodamine)、麗絲胺(Lissamine)、德克薩斯紅(Texas Red)、BODIPY 576/589、BODIPY 630/650和BODIPY 650/665組成的組的至少之一。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的可逆末端終止功能核苷酸具有下式1所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式之一。

本發(fā)明的另一方面，提供可完全去疤的可逆末端終止功能核苷酸在高通量測序技術(shù)上的應(yīng)用。

在某些實(shí)施方案中，可完全去疤的可逆末端終止功能核苷酸在高通量測序技術(shù)上的應(yīng)用包括下述具體步驟：

1)測序DNA模板及引物的固定；

2)引物延伸：向反應(yīng)體系加入延伸反應(yīng)混合液開始進(jìn)行引物聚合延伸，此混合液主要包括DNA聚合酶(或逆轉(zhuǎn)錄酶)及四種不同堿基帶有不同顏色熒光的可完全去疤可逆末端終止功能核苷酸；

3)延伸終止：去離子水洗滌，清除延伸反應(yīng)混合液，終止引物延伸反應(yīng)；

4)堿基讀取：CCD拍照，通過熒光顏色來判定所延伸的堿基的種類；

5)切除連接臂及與其相連的熒光基團(tuán)：先加入高碘酸鈉(NaIO₄)溶液切斷鄰二醇基連接臂去除熒光基團(tuán)，一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間后再用去離子水清洗；然后加入胺類催化劑將剩余的丙醛基完全去除，一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間后再用去離子水清洗；

6)重復(fù)步驟2-5；

7)序列判讀：利用圖像分析軟件，根據(jù)熒光與堿基種類的對應(yīng)關(guān)系，對測序DNA模板進(jìn)行序列判讀。

在某些實(shí)施方案中，可逆末端終止功能核苷酸在高通量測序技術(shù)上的應(yīng)用中，步驟2)的DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶為以下酶的一種：Taq、REAP 475、EEAP 442、Vent(exo-)、Deep Vent(exo-)、9° N_m、Therminator、Therminator-2、Therminator-3、Bst、Bsu、Klenow、Klenow(exo-)、AffinityScript RT、M-MLV Reverse Transcriptase、ImProm-II Reverse Transcriptase、ThermoScript Reverse Transcriptase、HIV Reverse Transcriptase、Maxima Reverse Transcriptase、ReverAidTM Reverse Transcriptase、SuperScript II Reverse Transcriptase、SuperScript III Reverse Transcriptase、Enhanced Avian Reverse Transcriptase。

在某些實(shí)施方案中，可逆末端終止功能核苷酸在高通量測序技術(shù)上的應(yīng)用中，步驟5)的胺類催化劑為選自氨基乙酸、嗎啉和吡咯烷的至少一種。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的可逆末端終止功能核苷酸可以完全切除連接臂(本發(fā)明中，有時(shí)也稱作可完全去疤)。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的可逆末端終止功能核苷酸的連接臂較短，引物延伸聚合一個(gè)帶有大熒光基團(tuán)的可逆末端終止功能核苷酸后，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)由于大溝構(gòu)成的改變而改變，便無法再聚合第二個(gè)，從而達(dá)到“延伸且只延伸一個(gè)”的目的。

在某些實(shí)施方案中，出于完全去除連接臂的考慮，嘧啶堿基5位和嘌呤堿基的7位C被N所取代。這樣，完全消除疤痕以后，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)不會因可逆末端終止功能核苷酸在引物上的累積而遭到破壞，從而實(shí)現(xiàn)可逆末端終止測序法的長讀長。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的高通量測序?qū)儆诳赡婺┒私K止測序法，即合成測序法，其利用DNA聚合酶的鏈延伸反應(yīng)，邊合成邊測序，包括多步引物延伸、終止、切除操作。

附圖說明

圖1：為本發(fā)明某些實(shí)施方案中的可完全去疤可逆末端終止功能核苷酸的結(jié)構(gòu)式(Dye:熒光基團(tuán))。

圖2：為本發(fā)明某些實(shí)施方案中的可完全去除連接臂(完全去疤)過程示意圖。

圖3：為本發(fā)明某些實(shí)施方案中的可逆末端終止測序法的具體操作步驟(多步引物延伸、終止、切除)。

圖4：為本發(fā)明某些實(shí)施方案的烯糖化合物的合成路線。

圖5：為本發(fā)明某些實(shí)施方案的可完全去疤dT可逆末端終止功能核苷酸的合成路線。

圖6：為本發(fā)明某些實(shí)施方案的甲苯磺基取代的無疤連接臂的合成路線。

圖7：為本發(fā)明某些實(shí)施方案的可完全去疤dC可逆末端終止功能核苷酸的合成路線。

圖8：為本發(fā)明某些實(shí)施方案的可完全去疤dA可逆末端終止功能核苷酸的合成路線。

圖9：為本發(fā)明某些實(shí)施方案的可完全去疤dG可逆末端終止功能核苷酸的合成路線。

圖10：為本發(fā)明某些實(shí)施方案的可完全去疤dT可逆末端終止功能核苷酸完全去疤反應(yīng)。

圖11：為本發(fā)明某些實(shí)施方案的可完全去疤可逆末端終止功能胞嘧啶核苷酸(BODIPY 576/589Labeled 1-(5-amino-3,4-dihydroxypentyl)-2'-deoxy-pseudouridine-5'-triphosphate)結(jié)構(gòu)式。

圖12：為本發(fā)明某些實(shí)施方案的單側(cè)引物延伸PAGE電泳圖。

圖13：為本發(fā)明某些實(shí)施方案的固定到醛基基片上的測序底物及引物。

具體實(shí)施方式

通過解釋以下本申請的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將變得清楚。

應(yīng)理解本發(fā)明中所述的術(shù)語僅僅是為描述特別的實(shí)施方式，并非用于限制本發(fā)明。另外，對于本發(fā)明中的數(shù)值范圍，應(yīng)理解為還具體公開了該范圍的上限和下限之間的每個(gè)中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個(gè)較小的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括或排除在范圍內(nèi)。

除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然本發(fā)明僅描述了優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方法、測定或測試方法，但是在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)、測定或測試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法。本說明書中提到的所有文獻(xiàn)通過引用并入，用以公開和描述與所述文獻(xiàn)相關(guān)的方法或?qū)嶒?yàn)。在與任何并入的文獻(xiàn)沖突時(shí)，以本說明書的內(nèi)容為準(zhǔn)。

本發(fā)明中，名詞術(shù)語既包括單數(shù)形式，也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另行明確指出。本發(fā)明中所述的“至少之一”或“至少一種”不僅僅指包含“一個(gè)”或“一種”的情況，更重要的還包含“多個(gè)”或“多種”的情況。

本發(fā)明中，術(shù)語“可完全去疤”是指可逆末端終止功能核苷酸的連接臂可以被完全切除/去除/消除。其被完全去除的過程可例如如圖2所示。首先，連接臂中的鄰二醇基被高碘酸鹽氧化所切斷，從而去除熒光基團(tuán)。隨后，剩余的丙醛基經(jīng)胺類催化劑催化形成亞胺，亞胺基α位的一個(gè)電子引發(fā)了β-消除反應(yīng)，從而使堿基雜環(huán)上的N原子與丙醛完全分離，達(dá)到完全去除連接臂(疤痕)的目的。

本發(fā)明中，術(shù)語“含有C-C糖苷鍵的核苷酸”是指核苷酸中的嘧啶堿基5位或者嘌呤堿基的7位C被N所取代的天然核苷酸的衍生物。它是一種具有可逆末端終止功能的核苷酸類似物，稱為“可逆末端終止功能核苷酸”(reversible terminator)。優(yōu)選地，天然核苷酸為由堿基、核糖或脫氧核糖和磷酸組成。優(yōu)選所述天然核苷酸選自由dATP、dTTP、dGTP和dCTP組成的組中的至少之一。

本發(fā)明中，術(shù)語“鄰二醇基可切割連接臂”為在鄰位上具有兩個(gè)醇基(-OH)的化合物。優(yōu)選地，其具有如下所述的結(jié)構(gòu)式：-(CH₂)m(CHOH)₂(CH₂)n-，其中m和n分別為1至5的整數(shù)，例如，1、2、3、4或5。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，m為2，n為1。

本發(fā)明中，術(shù)語“熒光基團(tuán)”為本領(lǐng)域內(nèi)通常使用的任何熒光基團(tuán)，包括但不限于Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、羅丹明6G(Rhodamine 6G)、四甲基羅丹明(Tetramethyl rhodamine)、麗絲胺(Lissamine)、德克薩斯紅(Texas Red)、BODIPY 576/589、BODIPY 630/650和BODIPY 650/665。在某些實(shí)施方案中，熒光基團(tuán)可組合使用兩種以上的上述任何基團(tuán)。

本發(fā)明中，優(yōu)選地，鄰二醇基可切割連接臂通過選自由NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH和CO-NH-NH-CO組成的組任何之一與熒光基團(tuán)連接。

本發(fā)明中，“測序”優(yōu)選指可逆末端終止法測序，其末端終止基團(tuán)的引物延伸終止功能是可逆的，可以通過一定的化學(xué)轉(zhuǎn)變恢復(fù)為正常的、可以再次進(jìn)行引物延伸的基團(tuán)。所述測序包括但不限于高通量測序。

本發(fā)明中，“高通量測序”的具體步驟和方法有多種，在此，僅簡單提及下述具體步驟：

1)測序DNA模板及引物的固定；

2)引物延伸：向反應(yīng)體系加入延伸反應(yīng)混合液開始進(jìn)行引物聚合延伸，此混合液主要包括DNA聚合酶(或逆轉(zhuǎn)錄酶)及四種不同堿基帶有不同顏色熒光的可完全去疤可逆末端終止功能核苷酸；

3)延伸終止：去離子水洗滌，清除延伸反應(yīng)混合液，終止引物延伸反應(yīng)；

4)堿基讀?。篊CD拍照，通過熒光顏色來判定所延伸的堿基的種類；

5)切除連接臂及與其相連的熒光基團(tuán)：先加入NaIO₄溶液切斷鄰二醇基連接臂去除熒光基團(tuán)，一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間后再用去離子水清洗；然后加入胺類催化劑將剩余的丙醛基完全去除，一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間后再用去離子水清洗；

6)重復(fù)步驟2-5；

7)序列判讀：利用圖像分析軟件，根據(jù)熒光與堿基種類的對應(yīng)關(guān)系，對測序DNA模板進(jìn)行序列判讀。

本發(fā)明中，所述步驟2)的DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶包括但不限于以下酶：Taq、REAP 475、EEAP 442、Vent(exo-)、Deep Vent(exo-)、9° N_m、Therminator、Therminator-2、Therminator-3、Bst、Bsu、Klenow、Klenow(exo-)、AffinityScript RT、M-MLV ReverseTranscriptase、ImProm-II Reverse Transcriptase、ThermoScript Reverse Transcriptase、HIV Reverse Transcriptase、Maxima Reverse Transcriptase、ReverAidTM Reverse Transcriptase、SuperScript II Reverse Transcriptase、SuperScript III Reverse Transcriptase、Enhanced Avian Reverse Transcriptase。

本發(fā)明中，步驟5)的胺類催化劑可為本領(lǐng)域內(nèi)通常使用的催化劑，包括但不限于氨基乙酸、嗎啉和吡咯烷。可選地，本發(fā)明的催化劑可以使用兩種以上的上述不同類型。

本發(fā)明中，優(yōu)選地鄰二醇基連接臂連于嘧啶堿基的5位和嘌呤堿基的7位上，這兩個(gè)位點(diǎn)位于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的大溝部位，能接受比較大的熒光修飾基團(tuán)。本發(fā)明設(shè)計(jì)的連接臂較短，引物延伸聚合一個(gè)帶有大熒光集團(tuán)的可逆末端終止功能核苷酸后，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)由于大溝構(gòu)成的改變而改變，便無法再聚合第二個(gè)，從而達(dá)到“延伸且只延伸一個(gè)”的目的。另外，出于完全去除連接臂的考慮，嘧啶堿基5位和嘌呤堿基的7位C被N所取代。這樣，完全消除疤痕以后，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)不會因可逆末端終止功能核苷酸在引物上的累積而遭到破壞，從而實(shí)現(xiàn)可逆末端終止測序法的長讀長。

本發(fā)明所涉及的可逆末端終止測序法屬于合成測序法，是利用DNA聚合酶的鏈延伸反應(yīng)，邊合成邊測序，包括多步引物延伸、終止、切除操作。具體步驟如下(參見圖3)：

1)引物延伸：加入DNA聚合酶以及四種不同堿基帶有不同顏色熒光的可完全去疤可逆末端終止功能核苷酸后，引物開始進(jìn)行聚合延伸；

2)延伸終止：由于dNTPs堿基上帶有可逆末端終止基團(tuán)，使得延伸反應(yīng)只能延伸聚合一個(gè)可完全去疤可逆末端終止功能核苷酸；

3)讀取熒光顏色：通過讀取可逆末端終止功能核苷酸的熒光顏色可以判斷出新聚合在引物上的堿基種類；

4)洗除多余可完全去疤可逆末端終止功能核苷酸；

5)使用NaIO4和胺類催化劑完全去除帶有連接臂的熒光基團(tuán)(完全去疤)；

6)洗除被切除的帶有連接臂的熒光基團(tuán)；

7)開始第二輪引物延伸反應(yīng)。

實(shí)施例

實(shí)施例1：四種可完全去疤可逆末端終止功能核苷酸的具體合成路線

1、可完全去疤dT可逆末端終止功能核苷酸的合成路線

1)烯糖化合物的制備方法

首先，化合物1胸腺嘧啶核苷的5'-位的羥基經(jīng)保護(hù)后得到化合物2。然后，再用對3'-位上的羥基經(jīng)叔丁基二苯基氯硅烷保護(hù)和堿性水解后得到化合物3。接著，再用叔丁基二甲基硅烷對5'-位的羥基進(jìn)行保護(hù)得到化合物4。最后，化合物4的糖苷鍵在六甲基二硅胺作用下斷裂并堿性水解得到烯糖化合物5(圖4)。

2)完全去疤dT可逆末端終止功能核苷酸的制備方法

2-脫氧-D-核糖經(jīng)2,2-二甲氧基丙烷的保護(hù)、磷葉利德反應(yīng)和水解后得到烯醇類化合物7?；衔?再與鄰苯二甲酰亞胺偶聯(lián)和水解得到化合物8。接著，經(jīng)氨基保護(hù)和氧化及水解后得到鄰二醇衍生物9，化合物9再經(jīng)高碘酸鈉氧化和硼氫化鈉還原得到單羥基衍生物10?；衔?0再經(jīng)溴化后與N³-苯甲?；?5-碘尿嘧啶偶聯(lián)和水解得到5-碘尿嘧啶衍生物12?；衔?2與烯糖化合物5偶聯(lián)得到尿嘧啶核苷衍生物13。13經(jīng)水解后得到化合物14?；衔?4核糖環(huán)的3'-位的羥基經(jīng)乙酰基保護(hù)后得到中間體15，15經(jīng)焦磷酸化和水解后得到核苷酸16。最后，化合物16側(cè)鏈上的氨基與活化的熒光基團(tuán)結(jié)合得到最終產(chǎn)物“可完全去疤dT可逆末端終止功能核苷酸”(圖5)。

2、可完全去疤dC可逆末端終止功能核苷酸的制備方法

1)甲苯磺基取代的無疤連接臂的制備

首先，2-脫氧-D-核糖經(jīng)保護(hù)、水解、氧化和還原等反應(yīng)得到醇類化合物1。然后，用對甲苯磺酰氯(MsCl)對化合物1苯磺酰化后得到目標(biāo)化合物2(圖6)。

2)可完全去疤dC可逆末端終止功能核苷酸的制備

首先，異胞嘧啶(2-氨基-4-羥基嘧啶,3)經(jīng)碘代和乙?；蟮玫交衔?。然后，4與化合物2偶聯(lián)得到N-取代的5-碘異胞嘧啶衍生物5。5與烯糖化合物6偶聯(lián)得到核苷類衍生物7。化合物7經(jīng)水解除去核糖3’-位保護(hù)基后得到化合物8。接著，8經(jīng)保護(hù)和水解及核糖環(huán)的3’-位乙?；蟮玫交衔?。再經(jīng)焦磷酸酸化和水解后得到偽異胞核苷酸10。最后，化合物10嘧啶環(huán)側(cè)鏈末端的氨基與活化的熒光基團(tuán)結(jié)合得到最終產(chǎn)物“可完全去疤dC可逆末端終止功能核苷酸”(圖7)。

3.可完全去疤dA可逆末端終止功能核苷酸的制備方法

首先，化合物1與醇類衍生物2偶聯(lián)得到化合物3。然后，3再與烯糖化合物4發(fā)生核苷化反應(yīng)得到核苷衍生物5，再經(jīng)水解和6-位氨解得到7。接著，化合物7核糖環(huán)上的兩個(gè)的羥基經(jīng)1,1,3,3-四異丙基二硅氧烷保護(hù)后得到中間體8。然后，對6-位氨基進(jìn)行乙?；退獾艉颂黔h(huán)上的硅烷保護(hù)基得到9，化合物9再經(jīng)乙?；?、焦磷酸化和水解后得到核苷酸11。最后，化合物11的側(cè)鏈上的氨基與活化的熒光基團(tuán)結(jié)合得到最終產(chǎn)物“可完全去疤dA可逆末端終止功能核苷酸”(圖8)。

4.可完全去疤dG可逆末端終止功能核苷酸的制備方法

首先，嘧啶衍生物1經(jīng)二甲基縮醛對的2-位氨基縮合和新戊酸氯甲酯對1-位上的亞胺保護(hù)后得到中間體2。然后，再經(jīng)二甲基縮醛縮合和閉環(huán)反應(yīng)得到中間體3。中間體3經(jīng)碘代后得到化合物4?；衔?與醇衍生物5偶聯(lián)得到化合物6。然后，再與烯糖化合物7反應(yīng)的得到核苷衍生物8，再經(jīng)水解得到9。接著，對化合物9核糖環(huán)3’-位的羥基進(jìn)行乙?；玫街虚g體10。10再經(jīng)焦磷酸酸化和水解后得到核苷酸11。最后，化合物11側(cè)鏈上的氨基活化的熒光基團(tuán)結(jié)合得到最終產(chǎn)物“可完全去疤dG可逆末端終止功能核苷酸”(圖9)。

實(shí)施例2：可逆末端終止功能核苷酸的完全去疤實(shí)驗(yàn)

可逆末端終止功能核苷酸的完全去疤實(shí)驗(yàn)(以ScarlessdT Reversible Terminator的切除實(shí)驗(yàn)為例說明，圖10)采用兩步反應(yīng)。第一步為切斷鄰二醇基連接臂去除熒光基團(tuán)：化合物1通過50mM NaIO₄(25℃,5min)氧化其堿基側(cè)鏈上的鄰羥基得到側(cè)鏈醛基衍生物2；第二步為去除丙醛基而完全去疤：側(cè)鏈含有醛基的衍生物2在胺類催化劑作用下即可完全除疤，得到化合物3。如下表所示，在較溫和的反應(yīng)條件下(55℃)，30分鐘內(nèi)即可以完全去除堿基上的丙醛基，完全去疤率可達(dá)98-99％。

表1.5’丙醛基胸腺嘧啶核苷酸的完全去疤實(shí)驗(yàn)(離子交換HPLC檢測)

注：A:100mM氨乙酸基，55℃；B：500mM嗎啉，55℃；C：100mM吡咯烷，55℃。

實(shí)施例3：酶的篩選及完全去疤可逆末端終止功能核苷酸的單側(cè)引物延伸終止功能實(shí)驗(yàn)

通過單側(cè)引物延伸實(shí)驗(yàn)，從多種商業(yè)化的DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶中篩選獲取了多種高效延伸及有效終止(即～100％“延伸且只延伸一個(gè)”)完全去疤可逆末端終止功能胸腺嘧啶核苷酸(T)的酶。用于單側(cè)引物延伸的可完全去疤可逆末端終止功能胞嘧啶核苷酸結(jié)構(gòu)式如圖11所示。單側(cè)引物延伸PAGE電泳圖如圖12所示。

反應(yīng)步驟如下：首先，將5'端³²P放射性標(biāo)記的引物(2.5pmol)與底物(30pmol)經(jīng)過變性(95℃，5分鐘)退火(緩慢降至室溫0.1℃/秒)進(jìn)行雜交反應(yīng)；然后向反應(yīng)體系中加入各種DNA聚合酶及逆轉(zhuǎn)錄酶(如附圖所示)，再加入可完全去疤可逆末端終止功能胞嘧啶核苷酸Scarless dT(100μM)啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)溫度如圖所示。反應(yīng)如附圖所示時(shí)間后，加入等體積的甲酰胺加樣緩沖液(2×)終止反應(yīng)。上樣后進(jìn)行變性聚病烯酰胺凝膠電泳(16％)，隨后將凝膠干燥并放射自顯影。反應(yīng)底物(Template)與引物(primer)序列順序如下：

5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TGG ACG 引物

CGC ATT ATG CTG AGT GAT ACC TGC AAT GTG CTT CTT CTG-5'底物AA(DNA底物)

電泳結(jié)果解析：從商業(yè)化的11種DNA聚合酶、10種逆轉(zhuǎn)錄酶及兩種Taq突變體REAP 475、REAP 442(Chen,F.,Gaucher,E.A.,Leal,N.A.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2010,107,1948-1953)中篩選獲取了13高效延伸及有效終止(即～100％“延伸且只延伸一個(gè)”，即在膠圖上顯示～100％“N+1"條帶)完全去疤可逆末端終止功能胸腺嘧啶核苷酸(Scarless dT)的酶。REAP 475最終被選為下一步多步“引物延伸-終止-讀取-切除”可逆末端終止測序試驗(yàn)。

實(shí)施例4：多步“引物延伸-終止-讀取-切除”可逆末端終止測序試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^進(jìn)行多步引物延伸、終止、讀取、切除實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證完全去疤可逆末端終止功能核苷酸及其酶的測序應(yīng)用性。我們首先合成如下5’端帶有氨基修飾的DNA序列(包括底物及引物)，然后通過點(diǎn)樣的辦法將其固定到醛基修飾的基片上(圖13)。具體遵循如下步驟操作：

(i)引物延伸：向上述基片上加入延伸反應(yīng)混合液，包括REAP 475(50μg/ml)、四種不同堿基帶有不同顏色熒光的可完全去疤可逆末端終止功能核苷酸(scarless dT-BODIPY 576/589,scarless dC–Cy3.5,scarless dA-Cy 5,scarless dG–Cy3；濃度均為50μM)、1x Thermopol buffer(New EngalndBiolabs,MA),72℃反應(yīng)15min開始進(jìn)行引物聚合延伸。

(ii)延伸終止：用去離子水洗滌基片，清除延伸反應(yīng)混合液，終止引物延伸反應(yīng)。

(iii)堿基讀?。篊CD拍照，通過熒光顏色來判定所延伸的堿基的種類。

(iv)切除連接臂及與其相連的熒光基團(tuán)：先向基片上加入50mM NaIO₄溶液，25℃反應(yīng)5min，去離子水洗滌基片；然后向基片加入500mM嗎啉溶液(pH 9)，55℃反應(yīng)20min，去離子水洗滌基片。

(v)重復(fù)步驟i-iv。

(vi)序列判讀：利用圖像分析軟件，根據(jù)熒光與堿基種類的對應(yīng)關(guān)系，對測序DNA模板進(jìn)行序列判讀。

(vii)結(jié)果評估：10次實(shí)驗(yàn)，測序準(zhǔn)確率超過95％。

參考本申請的優(yōu)選技術(shù)方案詳細(xì)描述了本申請，然而，需要說明的是，在不脫離本申請的精神的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在上述公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上做出任何改造、修飾以及變動(dòng)。本申請包括上述具體實(shí)施方案及其任何等同形式。