本發(fā)明涉及一種草腐菇類活性菌的制備方法。

背景技術：

傳統(tǒng)栽培草腐菇類多采用一次發(fā)酵技術，但一次發(fā)酵技術耗時長，效率低，培養(yǎng)料發(fā)酵效果不佳。后來有栽培者采用二次發(fā)酵技術，但該方法耗能大，費工多，成本較高。為此，采用活性菌技術代替二次發(fā)酵技術?；钚跃夹g源自于日本的酵素菌技術，其原理相似。酵素菌是由一些能大量產生各種水解酶的好氣性微生物組成的微生物種群，含有細菌、放線菌、真菌三大類。幾十種酶類，具有很強的發(fā)酵分解能力。酵素菌技術能解決農業(yè)生產的品質問題，它可以改變土壤的物理性狀，提高土壤肥力。促進農作物的高產優(yōu)質。利用酵素菌發(fā)酵有機質制成的系列微生物肥料，除含作物生長營養(yǎng)外，還含大量維生素，核酸，生長素和未知生長因子和大量活性有益微生物。草腐菇所需栽培原料主要是作物秸稈和牛糞。作物秸稈等木質素纖維素含量高，在發(fā)酵過程中很難降解，而腐殖質是在木質素纖維素分解過程中形成的，因此，能否有效地加強木質素纖維素的分解轉化，成為發(fā)酵料能否充分腐熟的關鍵。然而，自然發(fā)酵料由于所含微生物的種類和數量有限，在發(fā)酵料中難以快速地繁殖和降解草腐料中的木質素纖維素，造成發(fā)酵周期長，發(fā)酵效果差。

技術實現要素：

本發(fā)明提出一種草腐菇類活性菌的制備方。

一種草腐菇類活性菌的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）制備培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括初篩培養(yǎng)基和復篩培養(yǎng)基，其中初篩培養(yǎng)基的制備包括篩選放線菌培養(yǎng)基、篩選細菌培養(yǎng)基、篩選真菌培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基、篩選固氮菌培養(yǎng)基；

（2）將草腐料稱取5g，置于50ml無菌水的三角瓶中，在62-64攝氏度環(huán)境下高溫水浴，水浴時間為10-12h，稀釋涂布，放線菌，真菌，細菌在分離培養(yǎng)基上涂布，固氮菌涂布，倒置在44℃培養(yǎng)，放線菌培養(yǎng)4d，細菌培養(yǎng)1d，真菌6-7d，固氮菌4d；

（3）采用1‰的剛果紅染色液染1h，再用1mol/l的NaCI脫色30min；

（4）將初篩得到的菌株接種到液體產酶培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)，制備粗酶液，測定酶活；

（5）用250,ml搖瓶裝50,ml發(fā)酵培養(yǎng)基，經滅菌。接種用生理鹽水沖洗的孢子2ml，37℃搖床振蕩(200r/min)培養(yǎng)，放線菌，細菌，真菌培養(yǎng)，用2層紗布擠濾，濾液4000r/min離心5min，上清液即為粗酶液；

（6）在烘干的具塞刻度試管中，編號后各加入1.5m1的0.5%CMC檸檬酸緩沖液，向一號對照試管中加入1.5mlDNS溶液，其它各加入0.5ml粗酶溶液，50℃沸水浴30min后，加入1．5mlDNS溶液，充分搖勻后沸水浴5min．在涼水中冷卻5min，用蒸餾水定容到20ml，充分混勻；

（7）用無菌生理鹽水洗滌保存斜面，搖勻即成菌懸液，接種斜面培養(yǎng)物于種子瓶，放線菌在28℃，220r/min培養(yǎng)36h得到種子液，細菌在30℃，220r/min培養(yǎng)24h得到種子液，霉菌在28℃，220r/min培養(yǎng)48h后烘干，即得草腐菇類活性菌。

優(yōu)選地，所述步驟（5）搖床的震蕩速度為200r/min。

本發(fā)明所述方法制備的一種草腐菇類活性菌，活性較好，利用其堆肥時，堆肥升溫速度快，最高溫度高，高溫保持時間長，能夠促進堆肥的腐熟，縮短堆肥周期。

具體實施方式

實施例1。

一種草腐菇類活性菌的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）制備培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括初篩培養(yǎng)基和復篩培養(yǎng)基，其中初篩培養(yǎng)基的制備包括篩選放線菌培養(yǎng)基、篩選細菌培養(yǎng)基、篩選真菌培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基、篩選固氮菌培養(yǎng)基；

（2）將草腐料稱取5g，置于50ml無菌水的三角瓶中，在62-64攝氏度環(huán)境下高溫水浴，水浴時間為10-12h，稀釋涂布，放線菌，真菌，細菌在分離培養(yǎng)基上涂布，固氮菌涂布，倒置在44℃培養(yǎng)，放線菌培養(yǎng)4d，細菌培養(yǎng)1d，真菌6-7d，固氮菌4d；

（3）采用1‰的剛果紅染色液染1h，再用1mol/l的NaCI脫色30min；

（4）將初篩得到的菌株接種到液體產酶培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)，制備粗酶液，測定酶活；

（5）用250,ml搖瓶裝50,ml發(fā)酵培養(yǎng)基，經滅菌。接種用生理鹽水沖洗的孢子2ml，37℃搖床振蕩(200r/min)培養(yǎng)，放線菌，細菌，真菌培養(yǎng)，用2層紗布擠濾，濾液4000r/min離心5min，上清液即為粗酶液；

（6）在烘干的具塞刻度試管中，編號后各加入1.5m1的0.5%CMC檸檬酸緩沖液，向一號對照試管中加入1.5mlDNS溶液，其它各加入0.5ml粗酶溶液，50℃沸水浴30min后，加入1．5mlDNS溶液，充分搖勻后沸水浴5min．在涼水中冷卻5min，用蒸餾水定容到20ml，充分混勻；

（7）用無菌生理鹽水洗滌保存斜面，搖勻即成菌懸液，接種斜面培養(yǎng)物于種子瓶，放線菌在28℃，220r/min培養(yǎng)36h得到種子液，細菌在30℃，220r/min培養(yǎng)24h得到種子液，霉菌在28℃，220r/min培養(yǎng)48h后烘干，即得草腐菇類活性菌。

實施例2。

一種草腐菇類活性菌的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）制備培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括初篩培養(yǎng)基和復篩培養(yǎng)基，其中初篩培養(yǎng)基的制備包括篩選放線菌培養(yǎng)基、篩選細菌培養(yǎng)基、篩選真菌培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基、篩選固氮菌培養(yǎng)基；

（2）將草腐料稱取5g，置于50ml無菌水的三角瓶中，在62-64攝氏度環(huán)境下高溫水浴，水浴時間為10-12h，稀釋涂布，放線菌，真菌，細菌在分離培養(yǎng)基上涂布，固氮菌涂布，倒置在44℃培養(yǎng)，放線菌培養(yǎng)4d，細菌培養(yǎng)1d，真菌6-7d，固氮菌4d；

（3）采用1‰的剛果紅染色液染1h，再用1mol/l的NaCI脫色30min；

（4）將初篩得到的菌株接種到液體產酶培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)，制備粗酶液，測定酶活；

（5）用250,ml搖瓶裝50,ml發(fā)酵培養(yǎng)基，經滅菌。接種用生理鹽水沖洗的孢子2ml，37℃搖床振蕩(200r/min)培養(yǎng)，放線菌，細菌，真菌培養(yǎng)，用2層紗布擠濾，濾液4000r/min離心5min，上清液即為粗酶液；

（6）在烘干的具塞刻度試管中，編號后各加入1.5m1的0.5%CMC檸檬酸緩沖液，向一號對照試管中加入1.5mlDNS溶液，其它各加入0.5ml粗酶溶液，50℃沸水浴30min后，加入1．5mlDNS溶液，充分搖勻后沸水浴5min．在涼水中冷卻5min，用蒸餾水定容到20ml，充分混勻；

（7）用無菌生理鹽水洗滌保存斜面，搖勻即成菌懸液，接種斜面培養(yǎng)物于種子瓶，放線菌在28℃，220r/min培養(yǎng)36h得到種子液，細菌在30℃，220r/min培養(yǎng)24h得到種子液，霉菌在28℃，220r/min培養(yǎng)48h后烘干，即得草腐菇類活性菌。

（8）優(yōu)選地，所述步驟（5）搖床的震蕩速度為200r/min。