本發(fā)明涉及生物學技術領域，尤其涉及一種提取清香型白酒發(fā)酵酒醅微生物總RNA的方法。

背景技術：

清香型白酒是我們白酒中主要香型之一，擁有悠久的歷史。目前，人們對清香型白酒微生物的研究還只停留在分離鑒定等初期階段，還無法解析出眾多微生物在清香型白酒發(fā)酵中的作用。而通過提取清香型白酒發(fā)酵過程中酒醅總RNA，對RNA進行轉錄組分析，可以了解微生物群落基因的動態(tài)表達與代謝調控等，從而獲得微生物在清香型白酒發(fā)酵過程中的作用。因此，獲得高質量的清香型白酒發(fā)酵酒醅總RNA是解析微生物在清香型白酒發(fā)酵過程中作用的前提和關鍵點。

清香型白酒釀造原料主要由高粱組成，并含有少量豌豆、大麥、小麥、稻殼等，這些釀造原料中含有大量淀粉、酚類、糖類以及次級代謝產物等物質。同時，在發(fā)酵過程中微生物作用下，發(fā)酵環(huán)境中會生成一定量的腐殖酸和腐殖質以及由微生物代謝生成的酚類物質、糖類物質，這些都是影響發(fā)酵酒醅高質量總RNA提取的因素。因此，在提取發(fā)酵酒醅中微生物總RNA過程中，盡量去除這些干擾因素是獲得高質量RNA的關鍵。目前提取RNA的主要方法有酸酚法、CTAB法、熱酚法、冷酚法、SDS酸酚法、異硫氫酸胍法和Trizol法等。這些方法在提取清香型白酒發(fā)酵酒醅微生物總RNA中，提取效果均不太理想。因此，開發(fā)一種適用于清香型白酒發(fā)酵酒醅微生物總RNA提取的高質量方法對于解析清香型白酒發(fā)酵微生物作用非常重要。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的提供一種RNA提取試劑，該提取試劑由月桂酸鈉緩沖液、Trizol提取液和β-巰基乙醇按20：20：1的體積比混合而成，其中月桂酸鈉緩沖液通過如下方式配置：

步驟S101,準備0.5M EDTA溶液:稱取18.61g Na2-EDTA·2H2O，加80ml DEPC水充分溶解后，加入約3.3g NaOH顆粒調節(jié)pH為8.0，用DEPC水定容至100ml，滅菌備用；

步驟S102,準備1.0M Tris-HCl,稱取12.1g Tris堿溶于80ml DEPC水中，用4.2ml濃鹽酸調節(jié)pH為8.0，用DEPC水定容至100ml，滅菌備用；

步驟S103,配置月桂酸鈉緩沖液：準確稱取Nacl 5.844g，月桂酸鈉10g，加入100ml 1.0M Tris-Hcl，40ml 0.5M EDTA，800ml DEPC水充分溶解后，鹽酸調節(jié)PH至8.0.，定容1000ml，滅菌備用。

本發(fā)明的第一個目的提供一種利用上述RNA提取試劑來提取清香型白酒發(fā)酵酒醅總RNA的方法，該方法包括：

步驟S201：取50g發(fā)酵酒醅混于200ml無菌水中振蕩混勻，然后通過無菌雙層紗布過濾，取4mL濾液于10000g以上、4℃離心1min，排空上清液后剩余部分放置在液氮中冷凍；

步驟S202：取RNA提取試劑4.1ml，放置冰上預冷；

步驟S203：將研缽用液氮預冷，將步驟S201樣品倒入研缽中，倒入液氮，研磨至粉末；

步驟S204：取步驟S203得到的研磨好的粉末1g移入到準備好的RNA提取試劑并搖勻；

步驟S205：將步驟S204獲得混合液在10000g以上、4℃離心10min后取出，吸取上清液；需要說明的是，保持4°是可以最大限度保護RNA。

步驟S206：向步驟S205得到的上清液中加入等體積的氯仿后混勻，冰上放置1min，在10000g以上、4℃離心10min后取出，吸取上清液；

步驟S207：向步驟S206得到的上清液中加入0.7倍體積的異丙醇后混勻，冰上放置15-25min，然后10000g以上、4℃離心10min，收集沉淀；

步驟S208：步驟S207沉淀中加入1ml 75％乙醇洗滌，在10000g以上、4℃離心3min，收集沉淀；

步驟S208：將步驟S208所獲得沉淀在無菌臺上風干，風干后加入DEPC水溶解低溫保存，所得混合物為清香型白酒發(fā)酵酒醅總RNA。

本發(fā)明的提取清香型白酒發(fā)酵酒醅總RNA的提取方法，與傳統(tǒng)Trizol法相比，本方法在提取發(fā)酵酒醅總RNA過程中，加入了月桂酸鈉緩沖液和β-巰基乙醇，有效的抑制了酚類物質的氧化，解決了發(fā)酵酒醅中腐殖酸、腐殖質及糖類物質的影響。建立了清香型白酒發(fā)酵酒醅總RNA的提取方法，次方法獲得的高質量RNA，可以滿足轉錄組分析、生物信息學分析等實驗要求。

附圖說明：

圖1是采用本發(fā)明提取清香型白酒發(fā)酵酒醅總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2是采用傳統(tǒng)Trizol法提取清香型白酒發(fā)酵酒醅總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖。

具體實施方式

下面結合試驗例及具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細描述。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明清香型白酒發(fā)酵酒醅總RNA的提取方法，與傳統(tǒng)Trizol法相比，在提取發(fā)酵酒醅總RNA過程中，采用了一種新的RNA提取試劑，試劑中加入了月桂酸鈉緩沖液和β-巰基乙醇，有效的抑制了酚類物質的氧化，解決了發(fā)酵酒醅中腐殖酸、腐殖質及糖類物質的影響。建立了清香型白酒發(fā)酵酒醅總RNA的提取方法，此方法獲得的高質量RNA，可以滿足轉錄組分析、生物信息學分析等實驗要求。

本發(fā)明中的RNA提取試劑由月桂酸鈉緩沖液、Trizol提取液和β-巰基乙醇按20：20：1的體積比混合而成，比如2ml月桂酸鈉緩沖液、2ml Trizol提取液和100ulβ-巰基乙醇混合而成得到4.1mlRNA提取試劑。其中月桂酸鈉緩沖液通過如下方式配置：

步驟S101,準備0.5M EDTA溶液:稱取18.61g Na2-EDTA·2H2O，加80ml DEPC水充分溶解后，加入約3.3g NaOH顆粒調節(jié)pH為8.0，用DEPC水定容至100ml，滅菌備用；

步驟S102,準備1.0M Tris-HCl,稱取12.1g Tris堿溶于80ml DEPC水中，用4.2ml濃鹽酸調節(jié)pH為8.0，用DEPC水定容至100ml，滅菌備用；

步驟S103,配置月桂酸鈉緩沖液：準確稱取Nacl 5.844g，月桂酸鈉10g，加入100ml 1.0M Tris-Hcl，40ml 0.5M EDTA，800ml DEPC水充分溶解后，鹽酸調節(jié)PH至8.0.，定容1000ml，滅菌備用。

下面，結合具體實施方式，采用本發(fā)明的RNA提取試劑來提取清香型白酒發(fā)酵酒醅總RNA:

步驟S201：取50g發(fā)酵酒醅混于200ml無菌水中振蕩混勻，然后通過無菌雙層紗布過濾，取4mL濾液于10000g以上(比如12000g)、4℃離心1min，排空上清液后剩余部分放置在液氮中冷凍；

步驟S202：取RNA提取試劑4.1ml，放置冰上預冷；

步驟S203：將研缽用液氮預冷，將步驟S201樣品倒入研缽中，倒入液氮，研磨至粉末；

步驟S204：取步驟S203得到的研磨好的粉末1g移入到準備好的RNA提取試劑并搖勻；優(yōu)選上下顛倒，每分鐘60-70次，持續(xù)15-20分鐘，如果搖得太劇烈會造成RNA斷裂，15-20min能夠確保RNA充分溶解，時間太長會造成RNA出現(xiàn)降解。

步驟S205：將步驟S204獲得混合液在10000g以上(比如12000g)、4℃離心10min后取出，吸取上清液；需要說明的是，保持4°是可以最大限度保護RNA。

步驟S206：向步驟S205得到的上清液中加入等體積的氯仿后混勻，冰上放置1min，在10000g以上(比如12000g)、4℃離心10min后取出，吸取上清液；

步驟S207：向步驟S206得到的上清液中加入0.7倍體積的異丙醇后混勻，冰上放置15-25min，然后10000g以上(比如12000g)、4℃離心10min，收集沉淀；

步驟S208：步驟S207沉淀中加入1ml 75％乙醇洗滌，在10000g以上(比如12000g)、4℃離心3min，收集沉淀；

步驟S208：將步驟S208所獲得沉淀在無菌臺上風干，風干后加入DEPC水溶解低溫保存，所得混合物為清香型白酒發(fā)酵酒醅總RNA。

優(yōu)選，步驟S201、S205、S206、S207、S208中離心條件一致，這樣有助于更好保護RNA。

圖1是傳統(tǒng)Trizol法提取發(fā)酵酒醅RNA電泳圖，條帶較弱甚至沒有條帶。圖2是采用改良Trizol法提取發(fā)酵酒醅RNA電泳圖，可以清晰看到28S、18S條帶以及較弱的5S條帶，說明成功的提取出了發(fā)酵酒醅RNA，且含量滿足轉錄組和生物信息學分析。從效果可以看出，本發(fā)明方法適合提取清香型白酒發(fā)酵酒醅微生物總RNA，效果非常好。

本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。

本說明書(包括任何附加權利要求、摘要和附圖)中公開的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個特征只是一系列等效或類似特征中的一個例子而已。