本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種培育轉(zhuǎn)基因青蒿的方法、所構(gòu)建的表達載體及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：青蒿素是從傳統(tǒng)中草藥黃花蒿(習(xí)慣稱為青蒿)(ArtemisiaannuaL.)中分離提純的一種具有抗瘧功效的倍半萜內(nèi)酯過氧化物。青蒿素的高生物利用度衍生物青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚、雙氫青蒿素等已被廣泛用于瘧疾臨床治療，療效確切且顯著，尤其對氯喹抗性瘧原蟲及致命性腦型瘧有效，成為瘧疾治療的一線藥物。以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法(ACT)被世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦為治療抗藥性瘧疾的首選療法，其中青蒿琥酯、蒿甲醚及蒿甲醚復(fù)方被列入“基本藥品目錄”。青蒿素在野生青蒿植株中的含量相對很低，并且變異幅度很大。野生型青蒿中青蒿素含量范圍在0.01％-1.0％(植物干重)之間，這使得青蒿素的醫(yī)療需求、商業(yè)化生產(chǎn)及進一步的研究都受到了很大限制。雖然人工可以合成青蒿素，但成本太高，難度大，產(chǎn)量也比較低，不具備實際生產(chǎn)條件。也有科學(xué)家嘗試用合成生物學(xué)技術(shù)手段在微生物體內(nèi)合成青蒿素，并且取得了很大成就：2003年，美國加州大學(xué)的Keasling小組將青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因(ADS)經(jīng)密碼子優(yōu)化后導(dǎo)入大腸桿菌中表達，同時用酵母萜類合成途徑代替大腸桿菌萜類合成途徑，首次在微生物體內(nèi)合成出青蒿素的第一個關(guān)鍵前體—紫穗槐-4,11-二烯，在6L發(fā)酵罐中培養(yǎng)60h的產(chǎn)率達到450mg/L，2013年，Keasling領(lǐng)導(dǎo)的團隊又在釀酒酵母中合成青蒿酸(青蒿酸產(chǎn)率達25g/L)，將微生物半合成青蒿素產(chǎn)業(yè)化進程向前推進了一大步。如果說青蒿素合成生物學(xué)研究具有革命性和前瞻性，在未來可能取得突破性成果，那么青蒿轉(zhuǎn)基因研究則更有現(xiàn)實意義，因為其成果是優(yōu)良的青蒿種質(zhì)。目前國內(nèi)外在青蒿轉(zhuǎn)基因育種方面已取得諸多進展。中國科學(xué)院植物研究所葉和春教授研究小組最早開展轉(zhuǎn)基因青蒿研究，他們將青蒿素合成途徑上游的法呢基焦磷酸合成酶基因(FPS)導(dǎo)入青蒿，通過增大青蒿素合成途徑的碳流，獲得青蒿素含量比對照高3-4倍的轉(zhuǎn)基因青蒿發(fā)根(0.2％-0.3％)及比對照高2-3倍的轉(zhuǎn)基因青蒿植株(0.8-1％)。類似地，印度科學(xué)家用重組羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(HMGR)培育轉(zhuǎn)基因青蒿植株，其青蒿素含量提高22.5％。Banyai等在青蒿中過表達了FPS基因，使青蒿素含量提高了1.5倍。廣州中醫(yī)藥大學(xué)曾慶平研究員團隊將反義鯊烯合酶基因(asSQS)導(dǎo)入青蒿，通過阻斷青蒿類固醇合成分支途徑對青蒿素合成分支途徑所需法呢基焦磷酸(FPP)的競爭，獲得類固醇含量比對照(0.08％)下降約一半(0.04％-0.05％)及青蒿素含量比對照(0.45％)提高近3倍(1.23％)的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。上海交通大學(xué)唐克軒教授研究小組利用發(fā)夾RNA介導(dǎo)以抑制青蒿類固醇合成，使轉(zhuǎn)基因青蒿中的青蒿素含量達到3.14％，比對照提高3.14倍。這些研究結(jié)果表明采用基因工程手段，在植物中過量表達次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑上的基因或者干擾分支途徑的表達，對于提高青蒿中青蒿素含量而言是有效的。青蒿素屬于類異戊二烯化合物(isoprenoid)，也稱為萜烯類化合物(terpenoid)、萜烯(terpene)。青蒿素的代謝屬于植物次生代謝，青蒿素跟其他大多數(shù)萜類物質(zhì)由異戊二烯基本單位構(gòu)成一樣，有共同的前體：異戊烯焦磷酸(IPP)及其異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)。高等植物中IPP和DMAPP可以通過胞質(zhì)途徑的甲羥戊酸途徑(MVA途徑)和質(zhì)體的非甲羥戊酸途徑(MEP途徑)合成。并且由這兩個途徑合成的IPP之間可以互相補充。在IPP前體的兩個合成路徑中有兩個比較關(guān)鍵的酶：一個是3-基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase,HMGR)，另外一個是1-去氧木糖-5-磷酸還原酶(1-deoxyxylulose-5-phosphatereductoisomerase,DXR)，2007年Towle等通過抑制MVA或MEP途徑證明了青蒿素可以通過胞質(zhì)的甲羥戊酸途徑或質(zhì)體的非甲羥戊酸途徑合成。Schramek等通過同位素標記的13CO2發(fā)現(xiàn)法尼基焦磷酸(FPP)由一單位MVA途徑生成的異戊二烯和兩單位的MEP途徑合成的異戊二烯生成。法尼基焦磷酸通過后續(xù)的環(huán)化氧化等過程可以生成各種類異戊二烯終產(chǎn)物，如青蒿素。青蒿素特異的合成途徑實際上是從紫穗槐二烯合成酶(amorhph-4,11-dienesynthase,ADS)催化FPP生成紫穗槐二烯(amorhph-4,11-diene)開始的，ADS是青蒿素合成途徑的第一個關(guān)鍵酶，接下來紫穗槐二烯經(jīng)過一個細胞色素氧化酶P450(CYP71AV1)的兩次氧化生成青蒿醇(artemisinicalcohol)、青蒿醛(artemisinicaldehyde)，從青蒿醛開始到青蒿素的合成目前有兩種不同的意見路徑:一條通向青蒿素B再由青蒿素B轉(zhuǎn)變?yōu)榍噍锼?另外一條是通向二氫青蒿酸再轉(zhuǎn)變青蒿素。通向青蒿素B的途徑是通過CYP71AV1或一個青蒿醛脫氫酶(aldehydedehydrogenasehomologue,ALDH1)催化青蒿醛生成青蒿酸，由青蒿酸到青蒿素B的過程被認為是一個非酶參與的光催化的自發(fā)反應(yīng)，Dhingra和Narasu曾認為青蒿素B可以轉(zhuǎn)化為青蒿素。然而目前在青蒿中還未發(fā)現(xiàn)催化青蒿素B到青蒿素的酶。Brown等在2007年的研究結(jié)果傾向于證明不存在青蒿素B向青蒿素轉(zhuǎn)變的這一途徑，所以目前認為青蒿素B是青蒿素代謝途徑中一個分支的終產(chǎn)物。另外一條途徑是青蒿醛被一個青蒿醛雙鍵還原酶(ArtemisinicAldehyde△-11(13)Reductase,DBR2)轉(zhuǎn)變?yōu)槎淝噍锶?，二氫青蒿醛又?jīng)過青蒿醛脫氫酶(ALDH1)的催化轉(zhuǎn)變?yōu)槎淝噍锼?DihydroartemisinicAcid,DHAA)，目前認為二氫青蒿酸是青蒿素的直接前體，由它向青蒿素的轉(zhuǎn)變是一個非酶參與的光催化的自發(fā)反應(yīng)。Wallaart等發(fā)現(xiàn)二氫青蒿酸在青蒿素含量高植株中大量積累，并且其含量和青蒿素含量成正比。因此這暗示著在植物體內(nèi)二氫青蒿酸向青蒿素的轉(zhuǎn)變是一個限速步驟，雖然目前很多證據(jù)證明這是一個自發(fā)反應(yīng)，但從理論上講我們可以找到或創(chuàng)造一個催化此步驟的酶。Ryden等在2010年克隆到一個二氫青蒿醛還原酶(Red1)，發(fā)現(xiàn)這個酶同ALDH1競爭共同底物二氫青蒿醛，它將二氫青蒿醛轉(zhuǎn)變?yōu)槎淝噍锎迹虼诉@個酶的作用會減少青蒿素的合成。多基因的組裝往往受載體多克隆位點的限制。目前，有多種載體系統(tǒng)可以提供多基因的組裝。如pBECKS2000系列提供一種多基因連接策略，但這個系統(tǒng)仍需要通過常規(guī)的酶切除去中間載體骨架，組裝只能進行2-3次循環(huán)。Goderis等發(fā)展了一套最多可以插入6個基因的多基因組裝載體系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化載體pPZP-RCS的多克隆位點含有13個六堿基限制位點，6個八堿基限制位點和5個homingendonuclease位點。6個中間載體pAUX系列的多克隆位點兩側(cè)分別置有上述稀有酶切位點相對應(yīng)的其中一個。通過酶切連接可以依次將6個中間載體上的表達卡盒轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)化載體中。Lin等將TAC發(fā)展成一套有效的多基因組裝系統(tǒng)，利用Cre/loxP位點特異性重組進行多個目的基因的組裝。而以homingendonuclease切除中間載體骨架，并使載體在重新連接時接口形成NotI位點，使組裝的每個基因兩側(cè)都具有NotI位點，可以通過NotI酶切進行鑒定。上述多基因克隆系統(tǒng)都涉及繁雜的克隆操作，基于IIs型限制性內(nèi)切酶建立的GoldenBraid系統(tǒng)則具有獨特的優(yōu)勢。傳統(tǒng)II型限制性內(nèi)切酶結(jié)合和切割回文序列(例如GGATCC)，形成粘性末端。而IIs型限制性內(nèi)切酶結(jié)合不對稱的識別元件，并在識別位點以外進行切割。TypeIIs克隆法就是在同一反應(yīng)體系中，利用IIs型限制性內(nèi)切酶在識別位點之外切開DNA，產(chǎn)生含粘性末端的片段，再用連接酶將幾個片段按順序連接，拼成不含酶識別位點的DNA。GoldenBraid系統(tǒng)是一種模塊化的組裝系統(tǒng)，對于啟動子、編碼序列、終止子等組件(GBparts)賦予不同的首尾部標記，通過兩種IIs型限制性內(nèi)切酶(BsaI和BsmBI)的交叉使用，GoldenBraid系統(tǒng)可以實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄單位在兩類載體中(LEVELα和LEVELΩ載體)的來回組裝以致無窮(類似于“編織”，固命名“Braid”)，而僅僅取決于載體的容量。另一方面，由于有多種預(yù)制組件(如啟動子，終止子，報告基因等)可以使用，大大減少了多基因組裝所需的工作量。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是，野生青蒿青蒿素含量過低的問題，主要通過轉(zhuǎn)基因來解決，提供一種青蒿素含量高的轉(zhuǎn)基因青蒿的培育方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是，目前國內(nèi)外青蒿轉(zhuǎn)基因研究主要集中于1到2個基因。然而，青蒿素的生物合成途徑牽涉到復(fù)雜的新陳代謝途徑，這些途徑或反應(yīng)是由多個基因控制的，多個基因的組裝涉及復(fù)雜的分子克隆操作。具體來說，青蒿中特有的青蒿素合成代謝途徑涉及到紫穗槐-4,11-二烯合酶基因(ADS)、細胞色素P450單氧化酶基因(CYP71AV1,AMO)及其還原酶基因(CPR)、青蒿醇脫氫酶(ADH1)和青蒿醛脫氫酶(ALDH1)等。本發(fā)明利用植物合成生物學(xué)手段快速組裝了6個轉(zhuǎn)錄單位于一個雙元載體。即，將青蒿素合成通路特異基因ADS、AMO、CPR、ADH1、ALDH1五個基因及針對鯊烯合酶基因的內(nèi)含子發(fā)夾RNA(hpSQS)通過GoldenBraid方法組裝為一個T-DNA單元進行轉(zhuǎn)化，不僅能簡化多基因?qū)氲牟僮鬟^程，而且使多個基因以一個連鎖的基因座整合至植物染色體中，將能更穩(wěn)定地遺傳。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是，青蒿具有嚴重的自交不親合性，難以通過自交等傳統(tǒng)育種手段在短期內(nèi)獲得純合品系，本發(fā)明利用花藥離體培養(yǎng)產(chǎn)生青蒿單倍體植株，對離體培養(yǎng)的單倍體植株進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因，再對單倍體進行染色體加倍的方法，來解決這一問題。在本發(fā)明的技術(shù)方案中，將青蒿素代謝通路的5個重要酶基因及分支途徑鯊烯合酶基因發(fā)夾RNA利用GoldenBraid方法組裝為一個T-DNA，轉(zhuǎn)化青蒿素單倍體植株，進而將陽性轉(zhuǎn)化植株染色體加倍，獲得了青蒿素含量高的青蒿純合品系。兩套染色體上均具有目的基因，后代就不存在性狀分離的困擾，從而大大提高了培育效率。本發(fā)明一個具體實施方式提供的方法，為將青蒿素合成代謝通路關(guān)鍵酶基因分別組裝為過表達轉(zhuǎn)錄單位，將針對于青蒿素分支代謝的鯊烯合酶基因的發(fā)夾RNA模塊組裝為轉(zhuǎn)錄單位，然后再利用限制性酶切-連接的方法將上述多個轉(zhuǎn)錄單位組裝為一個T-DNA單元，轉(zhuǎn)化青蒿單倍體植株，將陽性單倍體植株染色體加倍，得到轉(zhuǎn)基因青蒿。所述關(guān)鍵酶基因為紫穗槐-4,11-二烯合酶基因(ADS)、細胞色素P450單氧化酶基因(AMO)及其還原酶基因(CPR)、青蒿醇脫氫酶(ADH1)和青蒿醛脫氫酶(ALDH1)。所述的過表達轉(zhuǎn)錄單位由啟動子-關(guān)鍵酶基因的編碼序列-終止子三類元件組成。所述的發(fā)夾RNA模塊組裝的轉(zhuǎn)錄單位由NOS啟動子-SQS基因片段-內(nèi)含子-SQS基因倒置片段-NOS終止子幾類元件組成。所述的SQS基因片段大小為363bp，其核苷酸序列如SEQIDNo.18所示。在一個具體的實施例中，包括如下步驟：1.構(gòu)建含有多個轉(zhuǎn)錄單位的T-DNA單元：1)葉片cDNA的獲取：采用PlantMiniKit(Qiagen,Cat.74904)試劑盒從新鮮葉片中提取總RNA。利用FastQuantRTKit(Tiangen,Cat.KR106-2)合成cDNA第一鏈。按照廠商提供的說明書進行實驗操作。2)將各個基因連入入門載體pUPD2：PCR擴增并限制酶切-連接到pUPD2的BsmBI位點。測序鑒定各陽性克隆。內(nèi)化后的質(zhì)粒(含有GBparts)分別命名為：pADS、pAMO、pCPR、pADH1、pALDH1、pSQSGOI及pSQSIOG。3)將各個基因組裝為轉(zhuǎn)錄單位(TU)：將pADS、pP35S、pTnos通過BtgZI/BsmBI酶切-連接到pDGB1Ω1載體，構(gòu)建為轉(zhuǎn)錄單位TU_P35S:ADS:T35S_Ω1(TU1)，用同樣的方法將其余基因組裝為：TU_PMtb:AMO:TAct2_Ω2(TU2)，TU_PUbc:CPR:THsp18.2_Ω1(TU3)，TU_PAtUbq10:ADH1:TAtUbq3_Ω2(TU4)，TU_PML1:ALDH1:TE8_α1(TU5)，TU_Pnos:SQSGOI:INT:SQSIOG:Tnos_α2(TU6)。4)將各個轉(zhuǎn)錄單位進行雙元組裝：TU1與TU2通過BsaI酶切-連接到pDGB1α1(獲得的新的質(zhì)粒稱為TU1_TU2_α1)，TU3與TU4通過BsaI酶切-連接到pDGB1α2(獲得TU3_TU4_α2)，TU5與TU6通過BsmBI酶切-連接到pDGB1Ω2(獲得TU5_TU6_Ω2)。5)TU1_TU2_α1與TU3_TU4_α2通過BsmBI酶切-連接到pDGB1Ω1載體(獲得的新質(zhì)粒命名為TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1)，將TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1與TU5_TU6_Ω2通過BsaI酶切-連接到pDGB1α2R載體獲得TU1_TU2_TU3_TU4_TU5_TU6_α2R(TU123456_α2R)。6)將TU123456_α2R與pEGB1alfa1RTnos:Hygromycin:PNos(GB0235)通過BsmBI酶切-連接到pDGB1Ω1，由于pDGB1系列載體是基于pGreenII骨架構(gòu)建的，即將上述7個轉(zhuǎn)錄單位連接成了一個T-DNA單元(TU1234567_Ω1)。2.多基因T-DNA單元轉(zhuǎn)化青蒿單倍體植株，采用潮霉素篩選陽性植株。3.通過秋水仙堿誘導(dǎo)處理，將青蒿素含量高的單倍體轉(zhuǎn)基因青蒿植株染色體加倍，篩選獲得高青蒿素含量的純系轉(zhuǎn)基因青蒿品種。上述方法所構(gòu)建的表達載體在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用屬于本發(fā)明的保護范圍。上述方法所構(gòu)建的表達載體在培育轉(zhuǎn)基因青蒿的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。總之，本發(fā)明采用多基因組裝載體系統(tǒng)結(jié)合單倍體育種技術(shù)，將關(guān)鍵酶基因及針對分支代謝的鯊烯合酶基因發(fā)夾RNA共轉(zhuǎn)化青蒿，提高青蒿中青蒿素的合成，再利用染色體加倍方法培育出青蒿素含量高的青蒿純合品系。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因青蒿的青蒿素含量可以達到非轉(zhuǎn)化對照青蒿的3.43倍。這對于控制青蒿素的成本，促進青蒿素的更廣泛應(yīng)用有重要的價值。對于以青蒿為原料提取青蒿素的藥廠節(jié)約成本具有重要意義。附圖說明圖1為本發(fā)明構(gòu)建的T-DNA質(zhì)粒圖譜；圖2為候選單倍體青蒿轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測結(jié)果；圖中M標示Marker，WT為未轉(zhuǎn)化的單倍體青蒿植株；圖3為候選轉(zhuǎn)基因植株的實時定量PCR檢測結(jié)果；圖4為陽性轉(zhuǎn)基因植株青蒿素含量檢測結(jié)果。具體實施方式下述實施例中涉及到多基因組裝的質(zhì)粒(pUPD2、pDGB1Ω1、pDGB1Ω2、pDGB1α1、pDGB1α2、pDGB1α2R及含啟動子元件(或終止子元件)的載體)采用Dr.DiegoOrzaez實驗室的GoldenBraid2.0Kit(addgeneID:1000000076)，下述實施例中所涉及的具體實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法或按照制造廠商說明書建議的條件實施。實施例1pADS的構(gòu)建①以SEQIDNo.1所示的正向引物和SEQIDNo.2所示的反向引物，以野生型青蒿葉片cDNA為模板，用Q5DNA聚合酶擴增，獲得1#片段(SEQIDNo3)，PCR反應(yīng)體系為：5×Q5反應(yīng)緩沖液10μL2.5mMdNTPs4μL正向引物(10μM)2.5μL反向引物(10μM)2.5μLcDNA2μLQ5超保真DNA聚合酶0.5μLddH2O28.5μL反應(yīng)條件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30個循環(huán)。按照天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書操作，回收1.7kb大小的片段。②在02mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：1#片段3μL(100ng)pUPD2(100ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μL0.01MDTT1μLBsmBI0.5μL1μLT4ligase1μLddH2O2.5μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體pADS，并測序確認。實施例2載體pAMO的構(gòu)建①以SEQIDNo.4所示的正向引物和SEQIDNo.5所示的反向引物，以野生型青蒿葉片cDNA為模板，用Q5DNA聚合酶擴增，獲得2#片段(SEQIDNo.6)，PCR反應(yīng)體系為：5×Q5反應(yīng)緩沖液10μL2.5mMdNTPs4μL正向引物(10μM)2.5μL反向引物(10μM)2.5μLcDNA2μLQ5超保真DNA聚合酶0.5μLddH2O28.5μL反應(yīng)條件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30個循環(huán)。按照天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書操作，回收1.5kb大小的片段。②在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：2#片段3μL(100ng)pUPD2(100ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μL0.01MDTT1μLBsmBI0.5μL1μLT4ligase1μLddH2O2.5μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體pAMO，并測序確認。實施例3載體pCPR的構(gòu)建①以SEQIDNo.7所示的正向引物和SEQIDNo.8所示的反向引物，以野生型青蒿葉片cDNA為模板，用Q5DNA聚合酶擴增，獲得3#片段(SEQIDNo.9)，PCR反應(yīng)體系為：5×Q5反應(yīng)緩沖液10μL2.5mMdNTPs4μL正向引物(10μM)2.5μL反向引物(10μM)2.5μLcDNA2μLQ5超保真DNA聚合酶0.5μLddH2O28.5μL反應(yīng)條件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30個循環(huán)。按照天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書操作，回收2.1kb大小的片段。②在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體pCPR，并測序確認。實施例4載體pADH1的構(gòu)建①以SEQIDNo.10所示的正向引物和SEQIDNo.11所示的反向引物，以野生型青蒿葉片cDNA為模板，用Q5DNA聚合酶擴增，獲得4#片段(SEQIDNo.12)，PCR反應(yīng)體系為：5×Q5反應(yīng)緩沖液10μL2.5mMdNTPs4μL正向引物(10μM)2.5μL反向引物(10μM)2.5μLcDNA2μLQ5超保真DNA聚合酶0.5μLddH2O28.5μL反應(yīng)條件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30個循環(huán)。按照天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書操作，回收1.2kb大小的片段。②在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：4#片段3μL(100ng)pUPD2(100ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μL0.01MDTT1μLBsmBI0.5μL1μLT4ligase1μLddH2O2.5μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體pADH1，并測序確認。實施例5載體pALDH1的構(gòu)建①以SEQIDNo.13所示的正向引物和SEQIDNo.14所示的反向引物，以野生型青蒿葉片cDNA為模板，用Q5DNA聚合酶擴增，獲得5#片段(SEQIDNo.15)，PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)條件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30個循環(huán)。按照天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書操作，回收1.6kb大小的片段。②在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：5#片段3μL(100ng)pUPD2(100ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μL0.01MDTT1μLBsmBI0.5μL1μLT4ligase1μLddH2O2.5μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體pALDH1，并測序確認。實施例6載體pSQSGOI及pSQSIOG的構(gòu)建①以SEQIDNo.16所示的正向引物和SEQIDNo.17所示的反向引物，以野生型青蒿葉片cDNA為模板，用Q5DNA聚合酶擴增，獲得6#片段(SEQIDNo.18)，PCR反應(yīng)體系為：5×Q5反應(yīng)緩沖液10μL2.5mMdNTPs4μL正向引物(10μM)2.5μL反向引物(10μM)2.5μLcDNA2μLQ5超保真DNA聚合酶0.5μLddH2O28.5μL反應(yīng)條件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，30sec；72℃，10min，30個循環(huán)。按照天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書操作，回收400bp大小的片段。②在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：6#片段3μL(100ng)pUPD2(100ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μL0.01MDTT1μLBsmBI0.5μL1μLT4ligase1μLddH2O2.5μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體pSQSGOI，并測序確認。③以SEQIDNo.19所示的正向引物和SEQIDNo.20所示的反向引物，以野生型青蒿葉片cDNA為模板，用Q5DNA聚合酶擴增，獲得7#片段(SEQIDNo.21)，PCR反應(yīng)體系為：5×Q5反應(yīng)緩沖液10μL2.5mMdNTPs4μL正向引物(10μM)2.5μL反向引物(10μM)2.5μLcDNA2μLQ5超保真DNA聚合酶0.5μLddH2O28.5μL反應(yīng)條件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，30sec；72℃，10min，30個循環(huán)。按照天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書操作，回收400bp大小的片段。④在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：7#片段3μL(100ng)pUPD2(100ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μL0.01MDTT1μLBsmBI0.5μL1μLT4ligase1μLddH2O2.5μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體pSQSIOG，并測序確認。實施例7TU_P35S:ADS:T35S_Ω1(TU1)的構(gòu)建將pP35S、pADS、pT35S通過BtgZI/BsmBI酶切-連接到pDGB1Ω1載體，構(gòu)建為ADS過表達轉(zhuǎn)錄單位。在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：pP35S(GB0030)(75ng/μL)1μLpADS(75ng/μL)1μLpT35S(GB0036)(75ng/μL)1μLpDGB1_omega1(75ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μLBsmBI0.5μLBtgZI0.5μLT4ligase1μLddH2O3μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體TU_P35S:ADS:T35S_Ω1(TU1)。實施例8TU_PMtb:AMO:TAct2_Ω2(TU2)的構(gòu)建將pPMtb、pAMO、pTAct2通過BtgZI/BsmBI酶切-連接到pDGB1Ω2載體，構(gòu)建為AMO過表達轉(zhuǎn)錄單位。在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：pPMtb(GB0080)(75ng/μL)1μLpAMO(75ng/μL)1μLpTAct2(GB0210)(75ng/μL)1μLpDGB1_omega2(75ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μLBsmBI0.5μLBtgZI0.5μLT4ligase1μLddH2O3μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體TU_PMtb:AMO:TAct2_Ω2(TU2)。實施例9TU_PUbc:CPR:THsp18.2_Ω1(TU3)的構(gòu)建將pPUbc、pCPR、pTHsp18.2通過BtgZI/BsmBI酶切-連接到pDGB1Ω1載體，構(gòu)建為CPR過表達轉(zhuǎn)錄單位。在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：pPUbc(GB0145)(75ng/μL)1μLpCPR(75ng/μL)1μLpTHsp18.2(GB0035)(75ng/μL)1μLpDGB1_omega1(75ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μLBsmBI0.5μLBtgZI0.5μLT4ligase1μLddH2O3μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體TU_PUbc:CPR:THsp18.2_Ω1(TU3)。實施例10TU_PAtUbq10:ADH1:TAtUbq3_Ω2(TU4)的構(gòu)建將pPAtUbq10、pADH1、pTAtUbq3通過BtgZI/BsmBI酶切-連接到pDGB1Ω2載體，構(gòu)建為ADH1過表達轉(zhuǎn)錄單位。在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體TU_PAtUbq10:ADH1:TAtUbq3_Ω2(TU4)。實施例11TU_PML1:ALDH1:TE8_α1(TU5)的構(gòu)建將pPML1、pALDH1、pTE8通過BsaI酶切-連接到pDGB1α1載體，構(gòu)建為ALDH1過表達轉(zhuǎn)錄單位。在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：pPML1(GB0045)(75ng/μL)1μLpALDH1(75ng/μL)1μLpTE8(GB0144)(75ng/μL)1μLpDGB1_alpha1(75ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μLBsaI0.5μLT4ligase1μLddH2O3.5μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體TU_PML1:ALDH1:TE8_α1(TU5)。實施例12TU_Pnos:SQSGOI:INT:SQSIOG:Tnos_α2(TU6)的構(gòu)建將pPnosNoATG、pSQSGOI、pUPD2_hpIntron、pSQSIOG、pTnos通過BsaI酶切-連接到pDGB1α2載體。在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系，組裝為針對鯊烯合酶(SQS)hpRNA的轉(zhuǎn)錄單位：pPnosNoATG(GB0555)(75ng/μL)1μLpSQSGOI(75ng/μL)1μLpUPD2_hpIntron(GB01281)(75ng/μL)1μLpSQSIOG(75ng/μL)1μLpTnos(GB0037)(75ng/μL)1μLpDGB1_alpha2(75ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μLBsaI0.5μLT4ligase2.5μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體TU_Pnos:SQSGOI:INT:SQSIOG:Tnos_α2(TU6)。實施例13載體TU1_TU2_α1的構(gòu)建將TU1、TU2通過BsaI酶切-連接到pDGB1α1載體，組裝為載體TU1_TU2_α1。在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體TU1_TU2_α1。實施例14載體TU3_TU4_α2的構(gòu)建將TU3、TU4通過BsaI酶切-連接到pDGB1α2載體，組裝為載體TU3_TU4_α2。在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：TU3(75ng/μL)1μLTU4(75ng/μL)1μLpDGB1_alpha2(75ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μLBsaI0.5μLT4ligase2.5μLddH2O3μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體TU3_TU4_α2。實施例15載體TU5_TU6_Ω2的構(gòu)建將TU5、TU6通過BsmBI酶切-連接到pDGB1Ω2載體，組裝為載體TU5_TU6_Ω2。在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：TU5(75ng/μL)1μLTU6(75ng/μL)1μLpDGB1_omega2(75ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μLBsmBI0.5μLT4ligase2.5μLddH2O3μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體TU5_TU6_Ω2。實施例16載體TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1的構(gòu)建將TU1_TU2_α1與TU3_TU4_α2通過BsmBI酶切-連接到pDGB1Ω1載體，獲得載體TU1TU2TU3TU4Ω1。在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1。實施例17載體TU123456_α2R的構(gòu)建將TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1與TU5_TU6_Ω2通過BsaI酶切-連接到pDGB1α2R載體獲得TU1_TU2_TU3_TU4_TU5_TU6_α2R(TU123456_α2R)。在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1(75ng/μL)1μLTU5_TU6_Ω2(75ng/μL)1μLpDGB1_alpha2R(75ng/μL)1μL10×T4LigaseBuffer1μLBsaI0.5μLT4ligase2.5μLddH2O3μL反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體TU123456_α2R。實施例18載體TU1234567_Ω1的構(gòu)建將TU123456_α2R與pEGB1alfa1RTnos:Hygromycin:PNos(GB0235)通過BsmBI酶切-連接到pDGB1Ω1，由于pDGB1系列載體是基于pGreenII骨架構(gòu)建的，即將上述7個轉(zhuǎn)錄單位連接成了一個T-DNA單元(TU1234567_Ω1)。在0.2mLPCR管內(nèi)配制10μL反應(yīng)體系：反應(yīng)條件：37℃，2min；16℃，5min，25個循環(huán)。取2μL酶切-連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，按照說明書轉(zhuǎn)化步驟操作，得到載體TU1234567_Ω1。實施例19建立青蒿單倍體植株，具體步驟如下：(1)青蒿小孢子發(fā)育時期的鑒定：在現(xiàn)蕾期，采集不同發(fā)育直徑的花蕾，將其置于解剖鏡下，用針灸針和醫(yī)用解剖鑷剝?nèi)』ㄋ?。將剝離的花藥置于普通載玻片上，滴加適量1mol/LHCl解離10min，之后通過常規(guī)壓片技術(shù)壓片，并用醋酸洋紅染色液染色后鏡檢。(2)青蒿花藥愈傷組織誘導(dǎo)：通過鏡檢觀察后根據(jù)鏡檢結(jié)果選取小孢子發(fā)育處于單核期的青蒿花蕾，采集后置于2.0mL無菌離心管，在超凈臺完成花藥的分離和接種操作。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，補充30g/L的蔗糖、1mg/L6-BA、0.3mg/LNAA。裝于90mm常規(guī)培養(yǎng)皿。將接種過花藥后的培養(yǎng)皿置于25℃下黑暗培養(yǎng)20d，以誘導(dǎo)出愈傷組織，之后進行見光培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃、光照強度為2000lx、光照周期為16/8h(光照/黑暗時間比)，見光培養(yǎng)時間為7d。(3)青蒿花藥愈傷組織分化：在誘導(dǎo)出愈傷組織后，將健康的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至愈傷組織分化培養(yǎng)基，以分化出芽。愈傷組織分化培養(yǎng)基裝于150mL三角瓶，每瓶盛裝50mL，每個三角瓶內(nèi)接種5個愈傷組織塊。培養(yǎng)基也以MS為基本培養(yǎng)基，補充30g/L的蔗糖，4mg/L6-BA、0.05mg/LNAA。培養(yǎng)條件同愈傷組織誘導(dǎo)見光培養(yǎng)的條件。愈傷組織分化培養(yǎng)的時間為25d左右。(4)生根壯苗：愈傷組織經(jīng)過在分化培養(yǎng)基上生長一段時間后會分化出很多叢生芽，剪取茁壯的嫩芽接種于生根培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)基裝于150mL三角瓶，每瓶盛裝50mL，培養(yǎng)基也以1/2MS為基本培養(yǎng)基，補充0.5mg/LNAA。每瓶接種4～6株。生根培養(yǎng)20d左右之后，將再生青蒿小苗移入盛裝有珍珠巖的塑料小缽煉苗7d，為之后的入土栽培進行馴化。實施例20多基因T-DNA單元轉(zhuǎn)化青蒿單倍體植株，具體方法如下：(1)采用常規(guī)方法制備根癌農(nóng)桿菌工程菌：將多基因T-DNA單元(TU1234567_Ω1)采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞，利用含終濃度50μg/mL利福平和100μg/mL壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性菌株，得到含有目的基因載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌。(2)預(yù)處理：取青蒿單倍體植株的葉片，在葉片基部切出傷口，浸泡于無菌的0.4M甘露醇溶液中，100rpm振蕩6h。(3)侵染：將經(jīng)過預(yù)處理的葉片置于OD600為0.6-0.8工程菌液中浸泡8-10min，使葉片充分浸潤。(4)共培養(yǎng)：用無菌濾紙吸干葉片表面多余的菌液，然后轉(zhuǎn)至共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+4mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+200umol/L乙酰丁香酮+30g/L蔗糖+0.7％瓊脂，pH5.8-6.0)，28℃暗培養(yǎng)4d。(5)恢復(fù)培養(yǎng)：用上述共培養(yǎng)過的葉片，接入恢復(fù)培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+6mg/L6-BA+0.025mg/LNAA+300mg/LTimentin+30g/L蔗糖+0.7％瓊脂，pH5.8-6.0)，在100lx光照下培養(yǎng)10d。(6)選擇培養(yǎng)：共培養(yǎng)結(jié)束后，將上述葉片轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(MS+6mg/L6-BA+0.025mg/LNAA+300mg/LTimentin+30mg/L潮霉素+30g/L蔗糖+0.7％瓊脂，pH5.8-6.0)，脫菌的同時對抗性芽進行篩選。培養(yǎng)條件為25℃、光照強度為2000lx、光照周期為16/8h(光照/黑暗時間比)，每隔2周更換1次新鮮培養(yǎng)基，經(jīng)過2～3次繼代后獲得經(jīng)抗性篩選后的叢生芽。(7)生根培養(yǎng)：剪取發(fā)育良好的抗性叢生芽，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS+0.05mg/LNAA+30mg/L潮霉素+30g/L蔗糖+0.7％瓊脂，pH5.8-6.0)上培養(yǎng)、生根，即可獲得具潮霉素抗性的青蒿單倍體再生植株。(8)PCR擴增檢測轉(zhuǎn)基因青蒿植株，具體方法如下：根據(jù)HptII報告基因設(shè)計引物，采用SEQIDNo.22所示上游引物和SEQIDNo.23所示下游引物進行擴增，PCR反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析(結(jié)果如圖2所示)。(9)外源基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測：采用PlantMiniKit(Qiagen,Cat.74904)試劑盒從新鮮葉片中提取總RNA。利用FastQuantRTKit(Tiangen,Cat.KR106-2)合成cDNA第一鏈。實時熒光定量PCR檢測采用PowrupSYBRmastermix(appliedbiosystems,Cat.A25741)，在StepOnePlusTM實時熒光定量PCR儀(ABI)上進行Real-TimePCR擴增。以野生型青蒿作為對照組，檢測的目的基因為前述6個基因，即ADS(GenBankaccessionNo.EF197888.1，所用上下游引物如SEQIDNo.26和27所示)、AMO(GenBankaccessionNo.DQ268763.1，所用上下游引物如SEQIDNo.28和29所示)、CPR(GenBankaccessionNo.JN594507.1，所用上下游引物如SEQIDNo.30和31所示)、ADH1(GenBankaccessionNo.JF910157.1，所用上下游引物如SEQIDNo.32和33所示)、ALDH1(GenBankaccessionNo.FJ809784.1，所用上下游引物如SEQIDNo.34和35所示)、SQS(GenBankaccessionNo.AY445506.1，所用上下游引物如SEQIDNo.36和37所示)，內(nèi)參為管家基因β-ACTIN(GenBankaccessionNo.EU531837.1，所用上下游引物如SEQIDNo.24和25所示)。結(jié)果如圖3所示。實施例21對高青蒿素含量的基因工程青蒿單倍體植株進行染色體加倍，具體方法如下：(1)選取青蒿素含量高的單倍體植株，切取莖尖(長約5mm)，置于含0.25％秋水仙堿的液體誘導(dǎo)和生長培養(yǎng)基(MS+1mg/L6-BA+30g/L蔗糖，pH5.8-6.0)，在100lx光照強度下，120rpm振蕩培養(yǎng)48h。(2)取出莖尖用無菌水沖洗1次，再插入固體誘導(dǎo)和生長培養(yǎng)基(MS+1mg/L6-BA+30g/L蔗糖+0.7％瓊脂，pH5.8-6.0)誘導(dǎo)莖尖生長。培養(yǎng)條件為25℃、光照強度為2000lx、光照周期為16/8h(光照/黑暗時間比)，每隔2周更換1次新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)4周。(3)生根培養(yǎng)：剪取發(fā)育良好的無根苗，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS+0.25mg/LNAA+30g/L蔗糖+0.7％瓊脂，pH5.8-6.0)上培養(yǎng)、生根，得到染色體加倍的純系二倍體植株。(4)染色體鑒定：生根后切取根尖鑒定植株倍性。根尖制片方法如下：幼根用0.002mol/L8-羥基喹啉溶液15℃處理4h，蒸餾水沖洗1次，再用新配置的卡諾氏固定液(無水乙醇與冰醋酸體積比為3:1)室溫固定24h，蒸餾水沖洗4次，再用1mol/LHCl60℃下，解離10min，蒸餾水沖洗2次，再將處理后的根尖置于載玻片上，切取少于1mm的分生組織，加一滴醋酸洋紅染色液染色，壓片鏡檢。實施例22本發(fā)明采用HPLC-ELSD檢測青蒿素的含量。以色譜純的青蒿素標準品作為標準，對轉(zhuǎn)基因青蒿植株、野生青蒿植株等樣品的青蒿素含量進行定性與定量分析，具體方法如下：(1)樣品提?。捍噍镩L至花蕾前期，收獲植株枝條，于55℃烘箱中烘48h至質(zhì)量恒定。記錄此時干重。從其上輕敲下花蕾和葉，研磨成粉末。稱取約0.1g干粉溶解于1.5mL甲醇，用40W超聲波處理提取20min，4500g離心10min，取上清用0.22μm濾膜過濾收集濾液。(2)色譜分析：HPLC采用WaterAlliance2695系統(tǒng)控制，分離柱采用美國SepaxRechnologies公司生產(chǎn)的AmethystC18-Hcolumn(250mm×4.6mm；5μm)；流動相為：甲醇和水(體積比為75:25)；流速1mL/min；ELSD檢測系統(tǒng)采用wateralliance2420，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40℃，增益為7，載氣為純度0.999氮氣。進樣量為20μL，每個樣品重復(fù)進樣3次。標準曲線的制作：將青蒿素標準品1mg用1mL色譜純甲醇溶解(終濃度為1mg/mL)。分別取3、6、9、12、15、18μL進樣，每個體積重復(fù)進樣3次。分別以峰面積(Y)對標準品含量(X，μg)擬合回歸曲線。經(jīng)計算青蒿素標準曲線方程為y＝6E-08x+0.3221，R2＝0.9937。根據(jù)標準曲線計算出青蒿素含量(μg)，再除以樣品干重(g)，從而計算出青蒿素占樣品干重的百分含量。測定結(jié)果如圖4所示。以上實驗操作步驟描述了本發(fā)明的實施方式，但實施過程中可以有許多等效的修改或者替換。本發(fā)明的權(quán)利以權(quán)利要求書的要求為準。SEQUENCELISTING<110>湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種培育轉(zhuǎn)基因青蒿的方法<160>37<170>PatentInversion3.5<210>1<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>1gcgc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