本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞制備的方法，尤其涉及一種完全利用臍帶資源制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，以提高對(duì)臍帶資源的利用效率。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell，MSCs)來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，存在于全身結(jié)締組織和器官組織中，是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。MSCs最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而受到關(guān)注。由于MSCs在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌和內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷的修復(fù)。MSCs能分泌產(chǎn)生多種促進(jìn)生長(zhǎng)分化的細(xì)胞因子，包括TGF-β、EGF、SDF-1、HGF、VEGF和IL-6等細(xì)胞因子，具有免于調(diào)控功能。因此，其在生物工程和細(xì)胞治療等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

MSCs最初是在骨髓中發(fā)現(xiàn)的，后來(lái)發(fā)現(xiàn)臍帶、臍血、胎盤和其他一些組織也存在MSCs。但在成人骨髓中MSCs數(shù)量較少、容易被病毒感染、有較強(qiáng)的免疫原性等因素限制了其臨床應(yīng)用。人臍帶來(lái)源的MSCs從細(xì)胞含量、細(xì)胞增殖能力、免疫原性低、取材方便等方面都優(yōu)于骨髓MSCs。臍帶來(lái)源的MSCs是骨髓MSCs的理想替代物。從臍帶中提取間充質(zhì)干使得臍帶能夠變廢為寶。

臍帶MSCs使用雖然無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議，但臍帶采集是要通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，經(jīng)產(chǎn)婦及其家屬知情同意后才能采集。

采集的臍帶長(zhǎng)度、粗細(xì)、色澤、采集時(shí)間等個(gè)體差異的影響獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量不一樣，細(xì)胞增殖能力也不一樣。

從臍帶中2條動(dòng)脈和1條靜脈、包繞臍帶動(dòng)靜脈的黏蛋白樣結(jié)締組織即為華通氏膠(Wharton’s Jelly)、臍帶靜脈內(nèi)皮、內(nèi)皮下層和血管周圍組織中都可以分離得到間充質(zhì)干細(xì)胞。

間充質(zhì)干細(xì)胞在體外分離和擴(kuò)增時(shí)，添加一定濃度的胎牛血清以提供細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份；提供結(jié)合蛋白、解毒作用；是細(xì)胞貼壁、鋪展在培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來(lái)源；起緩沖液作用；提供蛋白酶抑制劑，使在細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害。目前用人血清、血小板衍生物、血小板裂解液、血球裂解液和臍血清等加入間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)體系中以提供更好的細(xì)胞增殖環(huán)境越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。

細(xì)胞接種密度(Incxulum Density)在很大程度上影響細(xì)胞生長(zhǎng)和生存。種濃度較低時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖較慢，最終的細(xì)胞產(chǎn)量也低，尤其是貼壁細(xì)胞，當(dāng)接種濃度低到某一臨界值時(shí)，細(xì)胞甚至不會(huì)在介質(zhì)面上擴(kuò)展，也造成培養(yǎng)基的浪費(fèi)。在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中，尋找最適的細(xì)胞接種濃度，是得到穩(wěn)定性好和產(chǎn)率高的干細(xì)胞產(chǎn)品的關(guān)鍵因素。

目前臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞獲得的方式常見有酶消化靜脈內(nèi)膜法，Wharton’s Jelly組織貼壁法，膠原酶與胰酶聯(lián)合消化法。

酶消化靜脈內(nèi)膜法：夾閉臍靜脈一端，灌入膠原膠酶，置于含雙抗的PBS中，37℃環(huán)境孵育0.5小時(shí)，收集酶液，用PBS反復(fù)灌洗，收集灌洗液，與酶液同時(shí)離心洗滌棄上清液后，以完全培養(yǎng)基重懸，接種培養(yǎng)，3天后全量換液，以后每周換液兩次，觀察貼壁生長(zhǎng)情況。此方法操作繁瑣，初始獲得間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量級(jí)低，上皮細(xì)胞占比利高。

Wharton’s Jelly組織貼壁法：將臍帶置于含雙抗的PBS中，洗凈殘存血按血管螺旋走式剔除兩條動(dòng)脈和一條靜脈，用有齒鑷剝開外包膜將Wharton’s Jelly撕下，用DPBS浸泡洗滌后，將臍帶組織剪碎至1mm³～3mm³大小，DPBS洗滌后，進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。一般約5-7天后可見貼壁生長(zhǎng)的單個(gè)長(zhǎng)條梭形細(xì)胞從組織中爬出，兩周取貼塊即可獲得MSCs。此方法分離的間充質(zhì)干細(xì)胞的操作繁瑣，獲得的原代細(xì)胞時(shí)間長(zhǎng)。

專利CN101608174 B公開了一種膠原酶與胰酶聯(lián)合消化法：將臍帶組織切成小塊置于膠原酶內(nèi)消化，洗滌過(guò)濾后，以完全培養(yǎng)基重懸，接種培養(yǎng)，2天后換液棄非貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合情況，使用含胰酶的洗脫液洗脫貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行傳代換液。此法細(xì)胞收獲量高，保持細(xì)胞的生物原性，培養(yǎng)周期短。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種完全利用臍帶資源制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，以減小臍帶長(zhǎng)度、粗細(xì)、色澤、采集時(shí)間、制備細(xì)胞增殖能力等個(gè)體差異的影響，獲得了更多的原代細(xì)胞數(shù)量。

一種完全利用臍帶資源制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括如下步驟：

步驟一，清洗去大部分臍帶的殘留血液，并保留動(dòng)、靜脈內(nèi)部10v/v％～2v/v％的殘留未凝固血液；

步驟二，將臍帶制成2mm³～5mm³大小組織碎塊(如：2.5mm³)，并用膠原酶II消化(如：加入2～3倍組織碎塊體積的0.2w/v％膠原酶II)；

步驟三，加入DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行300r/min10分鐘離心，完全提取殘剩組織碎塊和上層液交界的膠狀液體，收集上層液；

步驟四，上層液中再次加入洗脫液，重懸后1800r/min離心15分鐘；

步驟五，棄上層液后收集沉淀，加入洗脫液重懸，1000r/min離心10分鐘，重復(fù)清洗兩次，即獲得臍帶內(nèi)部蘊(yùn)含的間充質(zhì)干細(xì)胞；

步驟六，將5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²獲得的原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于含有10v/v％胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培養(yǎng)基中，混勻后置溫度37℃，CO₂濃度5v/v％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3天后第一次換完全培養(yǎng)基，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每2天后更換完全培養(yǎng)基，待貼壁細(xì)胞融合率達(dá)到80％以上后消化分散貼壁細(xì)胞，按需求進(jìn)行提純。

本發(fā)明的方法，使用緩沖液清洗去大部分臍帶的殘留血液，緩沖液為磷酸鹽緩沖液(pH7.20，離子強(qiáng)度I＝0.05)含有青霉素10萬(wàn)單位/L、鏈霉素100mg/L、3.00mmol/L還原型谷胱甘肽和2v/v％巰基乙醇。

本發(fā)明的方法，其消化分散的貼壁細(xì)胞，加入無(wú)血清冷凍保護(hù)劑進(jìn)行分裝。

本發(fā)明的方法，其步驟二的利用恒溫?fù)u床提高消化效率和穩(wěn)定環(huán)境，獲得消化后組織殘剩組織碎塊和懸液混合物。

本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果：

本發(fā)明提供的方法利用了全部采集臍帶制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，充分利用有限的臍帶組織資源，減少造成不必要的浪費(fèi)，增加了用于制備的組織體積，并且充分利用采集全部臍帶資源，最大程度上地提取具有有效生物活性的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，有利于高產(chǎn)地獲得臍帶內(nèi)部蘊(yùn)含間充質(zhì)干細(xì)胞。

采用0.2w/v％膠原酶II消化，以及恒溫?fù)u床的存在使Wharton’s Jelly及其它組織更為暴露，增大了組織和酶的接觸面積，在相同的時(shí)間內(nèi)可以提高原代間充質(zhì)干細(xì)胞的產(chǎn)率。

在緩沖液加入還原型谷胱甘肽和巰基乙醇，準(zhǔn)確調(diào)節(jié)其pH值，新鮮配制以保持細(xì)胞外環(huán)境，避免或減少細(xì)胞的損害，增加細(xì)胞活性。

用緩沖液沖洗掉臍帶大部分殘留血液，保留10v/v％～20v/v％的殘留未凝固血液，培養(yǎng)系統(tǒng)中殘留血液可以提供外界無(wú)法獲得的微量血液因子，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，縮短臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在非人體條件下的培養(yǎng)時(shí)間。

按5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²接種細(xì)胞，促使細(xì)胞貼壁時(shí)間短、增殖速度快、生長(zhǎng)形狀穩(wěn)定、細(xì)胞成活率高，避免臍帶個(gè)體差異造成的細(xì)胞擴(kuò)增的影響。

附圖說(shuō)明

圖1A實(shí)施例1的P0代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行鏡檢圖；

圖1B實(shí)施例1的P1代例臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行鏡檢圖；

圖2為實(shí)施例4的P1、P2、P3、P4和P5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖曲線圖，圖中橫軸為細(xì)胞代數(shù)，縱軸為細(xì)胞數(shù)量；樣本1、樣本2和樣本3為三個(gè)平行細(xì)胞樣本隨著傳代；

圖3為實(shí)施例5部分利用臍帶與完全利用臍帶制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量對(duì)比圖；

圖4A為實(shí)施例1培養(yǎng)至P5代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，而得陰性對(duì)照散點(diǎn)圖；

圖4B為實(shí)施例1培養(yǎng)至P5代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，而得強(qiáng)表達(dá)散點(diǎn)圖；

圖5A為實(shí)施例1培養(yǎng)至P5代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105陰性對(duì)照?qǐng)D；

圖5B為實(shí)施例1培養(yǎng)至P5代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105強(qiáng)表達(dá)曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。

本發(fā)明以下實(shí)施例所用實(shí)際和儀器詳見如下表1，其它所用的試劑若未經(jīng)說(shuō)明，均購(gòu)自康寧(Corning)公司。

表1

本發(fā)明實(shí)施例臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法如下：

實(shí)施例1

(1)配制臍帶清洗緩沖液：1.00v/v％青霉素/鏈霉素、3.00mmol/L還原型谷胱甘肽、2w/w％巰基乙醇的磷酸鹽緩沖液(pH7.20，I＝0.05)，青霉素/鏈霉素母液濃度為青霉素(10,000units/ml)/鏈霉素(10,000μg/ml)；

(2)按照國(guó)家規(guī)范采集初生嬰兒的臍帶，用清洗緩沖液沖洗除去臍帶內(nèi)外大部分殘留血液(保留動(dòng)靜脈內(nèi)部10v/v～20v/v％的殘留未凝固血液)，全部剪碎獲得全部臍帶組織碎塊；

(3)向步驟(2)所獲得人臍帶組織中加入2～3倍組織體積的0.2w/v％膠原酶II消化處理，環(huán)境溫度37℃條件下消化2小時(shí)，利用恒溫?fù)u床提高消化效率和穩(wěn)定環(huán)境，獲得消化后組織殘剩組織碎塊和懸液混合物；

(4)加DMEM培養(yǎng)基于步驟(3)消化后的混合物內(nèi)混勻，300r/min離心10分鐘；

(5)棄步驟(4)離心后沉淀，收集上層液，需完全提取殘剩組織碎塊和上層液交界的膠狀液體；

(6)步驟(5)獲得的上層液中加入洗脫液，重懸后1800r/min離心15分鐘；

(7)步驟(6)棄上層液后收集沉淀，加入組織塊洗脫液進(jìn)行重懸，1000r/min離心10分鐘，重復(fù)上述步驟清洗兩次，即獲得臍帶內(nèi)部蘊(yùn)含的間充質(zhì)干細(xì)胞；

(8)將步驟(7)得到的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²濃度接種于盛有10v/v％FBS的LG-DMEM完全培養(yǎng)基的塑料培養(yǎng)容器中，混勻后置溫度37℃，CO₂濃度5v/v％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3天后第一次換完全培養(yǎng)基，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每2天后更換完全培養(yǎng)基，待貼壁細(xì)胞融合率達(dá)到80％以上后按需求進(jìn)行提純、消化分散貼壁細(xì)胞，加入無(wú)血清冷凍保護(hù)劑進(jìn)行分裝。

表2

實(shí)施例2

將實(shí)施例1中步驟(2)用清洗緩沖液沖洗除去臍帶內(nèi)外大部分殘留血液對(duì)照成清洗除去臍帶內(nèi)外殘留的全部血液，取一案例結(jié)果如表3所示，相對(duì)于表2的結(jié)果，有著更長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期和較少的的上東城數(shù)量。

表3

實(shí)施例3

將實(shí)施例1中步驟(2)剪碎獲得全部臍帶組織碎塊對(duì)照成剪碎獲得部分臍帶組織碎塊，取一案例結(jié)果如表4所示，相對(duì)于表2的結(jié)果制備數(shù)量減少，凍存數(shù)量較少。

表4

實(shí)施例4

將實(shí)施例1中步驟實(shí)驗(yàn)于三例臍帶樣本，擴(kuò)增至P5代。

實(shí)施例5

將實(shí)施例1中步驟實(shí)驗(yàn)于三例臍帶樣本，得到制備原代間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量對(duì)照實(shí)例一制備數(shù)量。

取實(shí)施例1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行鏡檢。剛分離的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞呈球形懸浮于培養(yǎng)液中，并混有一定的紅細(xì)胞。接種12小時(shí)～24小時(shí)內(nèi)細(xì)胞貼壁并伸展，36h～48h后細(xì)胞貼壁伸展擴(kuò)大并混有非成纖維形狀特征的雜細(xì)胞，細(xì)胞穿增殖后以梭形細(xì)胞為主，可見多角形、星形，折光性好(見圖1A)。原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分布不勻的增殖細(xì)胞族，優(yōu)選出的接種濃度在5d～7d便可達(dá)到80％以上的融合。傳代培養(yǎng)至P1代，傳代細(xì)胞仍以梭形為主，雜細(xì)胞逐漸減少，細(xì)胞比較均一，完全融合呈平行渦旋狀，較原代更大(見圖1B)。

取實(shí)施例1的P1代細(xì)胞利用臺(tái)盼藍(lán)拒染原理染色后，Life Technologies自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。本發(fā)明方法得到的各代間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞據(jù)拒染實(shí)驗(yàn)活性均可達(dá)到97.00％～100.00％。

取實(shí)施例4的細(xì)胞P1、P2、P3、P4和P5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行驗(yàn)證(參見圖2)，由圖3可見，隨著傳代代數(shù)的增加，細(xì)胞數(shù)量呈倍數(shù)增加。理論上經(jīng)過(guò)4次傳代為細(xì)胞原數(shù)量16倍，由于細(xì)胞會(huì)隨著代數(shù)增加而伸展延伸，實(shí)際P5時(shí)的細(xì)胞數(shù)量為P1的15倍左右。

取實(shí)施例5細(xì)胞經(jīng)部分利用臍帶與完全利用臍帶制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量對(duì)比可見，由于充分利用臍帶，完全利用臍帶增大了制備源，較部分利用臍帶得到原代細(xì)胞多(參見圖3)

按實(shí)施例1培養(yǎng)至P5代細(xì)胞，分散成單個(gè)細(xì)胞后用PBS洗滌2次～3次，制成1.0×10⁶的細(xì)胞懸液，流式檢測(cè)CD34、CD45、CD73、CD90和CD105等5個(gè)表面標(biāo)記物(參見圖5A和圖5B)。用流式分析軟件Flow Jo進(jìn)行分析，傳代過(guò)程中間充質(zhì)干細(xì)胞逐漸純化，雜細(xì)胞量越來(lái)越少。P5、P6收獲時(shí)，強(qiáng)表達(dá)標(biāo)記細(xì)胞達(dá)95％以上，不表達(dá)細(xì)胞小于2％(參見圖4A和圖4B)，符合國(guó)家頒布標(biāo)準(zhǔn)要求，證明細(xì)胞的免疫表型非常穩(wěn)定，保證了制備出的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞安全性。