本發(fā)明涉及干巴菌多糖技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種干巴菌胞外多糖，還涉及所述干巴菌胞外多糖的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

干巴菌（Thelephora ganbajun Zang）是我國(guó)特有的革菌屬（Thelephora）珍稀野生食用菌，口感好營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，僅僅分布在我國(guó)滇中800～2300 m高海拔地區(qū)的弱酸性紅壤地面上。干巴菌與松樹(shù)有外生菌根關(guān)系，人工栽培難以成功，因此導(dǎo)致干巴菌無(wú)序亂采現(xiàn)象嚴(yán)重，產(chǎn)量逐年下降，每年干巴菌上市時(shí)總是供不應(yīng)求，價(jià)格逐年升高。由于其分布的局限性，國(guó)內(nèi)外對(duì)干巴菌的研究極為有限，主要集中在干巴菌的分類、菌種分離、菌種鑒定和生態(tài)環(huán)境等方面。因此，干巴菌是一種具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的亟待研究開(kāi)發(fā)的菌種資源。

目前應(yīng)用于化妝品的多糖類保濕劑主要有透明質(zhì)酸、甲殼素及其衍生物、植物多糖提取物、肝素等。近年來(lái)將具有生物活性的食用真菌多糖作為保濕劑應(yīng)用于化妝品，滿足了人們對(duì)高品質(zhì)化妝品的需求，成為保濕化妝品的發(fā)展趨勢(shì)。干巴菌胞外多糖（Exopolysaccharide, EPS）良好的保濕和抗氧化特性是化妝品市場(chǎng)最重要的功能性訴求。

自由基是機(jī)體細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性物質(zhì)，如果自由基在體內(nèi)過(guò)多積累就會(huì)引起生物膜的不飽和脂類發(fā)生氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，從而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，造成對(duì)機(jī)體的損害，引起各種疾病，這就是引起機(jī)體衰老的主要原因。干巴菌胞外多糖可以清除體內(nèi)的自由基，進(jìn)而起到保護(hù)生物膜和延緩衰老的作用。

因此，干巴菌胞外多糖可以作為天然、營(yíng)養(yǎng)、安全的化妝品保濕劑和抗衰老功能食品，從而為干巴菌資源開(kāi)發(fā)提供有效的途徑。

陸文娟等在《響應(yīng)面法優(yōu)化提取干巴菌多糖的工藝研究》《南京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(工程技術(shù)版)》，2015，15（3）：84-92，以干巴菌子實(shí)體為原料，采用超聲細(xì)胞破碎法提取其多糖，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)，建立并分析了各因素與多糖得率關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，結(jié)果顯示，最佳工藝條件為：液料比為38:1，提取時(shí)間為3 h，提取溫度為88 ℃，超聲功率為603 W，重復(fù)2次，測(cè)定干巴菌多糖的得率為5.96%。但該項(xiàng)目并沒(méi)有涉及干巴菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)、干巴菌多糖的分離純化以及具有清除自由基、抗氧化功效的多糖組分等研究?jī)?nèi)容。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中干巴菌胞外多糖EPS在提取和應(yīng)用中存在的利用不充分的問(wèn)題，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞筛砂途辏?i>Thelephoraganbajun Zang）TG-1發(fā)酵得到的菌絲體胞外多糖EPS。本課題組從云南地區(qū)分離純化得到了一株干巴菌菌株（TG-1），并且研究發(fā)現(xiàn)干巴菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)菌絲體生長(zhǎng)旺盛，胞外多糖產(chǎn)量高，并且通過(guò)抗氧化實(shí)驗(yàn)和保濕實(shí)驗(yàn)證明干巴菌胞外多糖EPS具有良好的保濕和抗氧化特性。

本申請(qǐng)還提供了所述干巴菌胞外多糖EPS的制備方法。

本申請(qǐng)還提供了所述干巴菌胞外多糖EPS的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過(guò)以下步驟得到的：

一種干巴菌胞外多糖，其特征在于是通過(guò)以下步驟得到的：

保藏編號(hào)為CGMCC No.12977的干巴菌菌株TG-1在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，從菌絲體分離后得到的發(fā)酵液中，提取干巴菌胞外多糖，然后經(jīng)過(guò)陰離子交換柱層析分離，依次用去離子水和0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，分別得到干巴菌胞外多糖組分EPS-1，EPS-2，EPS-3。

所述的干巴菌胞外多糖EPS，其特征在于EPS、EPS-1、EPS-2、EPS-3中硫酸基的含量分別為15～21%，0.5～2%，25～40%，9～16%；糖醛酸的含量分別為5～10%，2～7%，30～50%，30～50%。

所述的干巴菌胞外多糖，液體培養(yǎng)基中含有馬鈴薯150～250 g/L，葡萄糖15～25 g/L，硫酸鎂0.5～2.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5～2.5 g/L，蛋白胨1～3 g/L，pH為4.5～7，于15～30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)。

所述的干巴菌胞外多糖，菌絲體分離，提取干巴菌胞外多糖操作如下：

洗滌菌絲體1～4次，至洗滌液澄清，將收集到的上清液或?yàn)V液合并，并濃縮至原體積3/4～1/2，加入1～4倍體積乙醇，靜置1～24 h至胞外多糖完全析出，過(guò)濾分離胞外多糖，40～60 ℃條件下烘干，溶于去離子水中，除蛋白至少2～3次，凍干后得到干巴菌胞外多糖。

所述的干巴菌胞外多糖，干巴菌胞外多糖經(jīng)過(guò)陰離子交換柱層析分離操作如下：

將干巴菌胞外多糖溶于去離子水中，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，得到上樣溶液，將上樣溶液用規(guī)格為1.6 × 30 cm的DEAE-52纖維素陰離子交換柱進(jìn)行層析分離，依次用去離子水和0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液的流速為1 mL/min，洗脫組分凍干后即為干巴菌胞外多糖組分EPS-1，EPS-2和EPS-3。

所述的干巴菌胞外多糖在制備抗衰老保健品和化妝品中的應(yīng)用。

干巴菌胞外多糖為干巴菌胞外多糖EPS及其組分EPS-1，EPS-2和EPS-3。

所述的保健品是具有清除自由基、抗氧化作用的保健品。

所述的化妝品是具有清除自由基、抗氧化和保濕作用的化妝品。

有益效果：

1）利用液體發(fā)酵途徑，制備干巴菌胞外多糖，為干巴菌的資源化利用提供了一條有效途徑。

2）干巴菌菌株TG-1在液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)具有旺盛的胞外多糖分泌能力，因此，干巴菌菌株TG-1對(duì)干巴菌的開(kāi)發(fā)利用及干巴菌胞外多糖的規(guī)?；a(chǎn)具有非常重要的意義。

3）抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，干巴菌胞外多糖EPS及其組分具有優(yōu)良的抗氧化活性，EPS及3個(gè)組分抗氧化能力有差異，還原力的強(qiáng)弱順序?yàn)镋PS-2 > EPS-1 > EPS > EPS-3，清除羥基自由基能力的強(qiáng)弱順序?yàn)镋PS >EPS-2 > EPS-1 > EPS-3，清除超氧陰離子自由基能力的強(qiáng)弱順序?yàn)镋PS-2 > EPS > EPS-1 > EPS-3，清除DPPH自由基能力的強(qiáng)弱順序?yàn)镋PS-2 > EPS > EPS-1 > EPS-3，因此，EPS的三個(gè)組分中EPS-2的抗氧化能力最強(qiáng)，其次為EPS-1和EPS-3，為干巴菌胞外多糖構(gòu)效關(guān)系的研究、多糖的改造、多糖的活性分析以及多糖抗衰老功能食品的開(kāi)發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

4）干巴菌胞外多糖具有優(yōu)良的保濕能力。在120 h時(shí)，在相對(duì)濕度60%的條件下，EPS的保濕率為55～65%；在相對(duì)濕度43%的條件下，EPS的保濕率為85～92%；在相對(duì)濕度0%的條件下，EPS的保濕率為25～35%。并且在某些條件下，MPS的保濕能力要強(qiáng)于透明質(zhì)酸（HA）和甘油（Gl），可以用于護(hù)膚保健。

菌種保藏信息

保藏時(shí)間：2016年 9月 23日，

保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，

保藏編號(hào)：CGMCC No. 12977，

保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101分類命名：干巴菌 Thelephora ganbajun。

附圖說(shuō)明

圖1干巴菌EPS的洗脫曲線，

圖2干巴菌EPS、EPS-1、EPS-2、EPS-3的體外抗氧化能力(A：還原力；B：羥基自由基清除能力；C：超氧陰離子自由基清除能力；D：DPPH自由基清除能力)，

圖3保濕率隨時(shí)間的變化曲線（RH60%），

圖4保濕率隨時(shí)間的變化曲線（RH43%），

圖5保濕率隨時(shí)間的變化曲線（RH0%）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例1菌株的獲得

分別于云南省不同地區(qū)采集4個(gè)新鮮干巴菌子實(shí)體，用75%酒精進(jìn)行表面消毒，再用無(wú)菌水沖洗數(shù)次后，用滅菌鑷子撕取干巴菌內(nèi)部組織小塊接種到含氯霉素的馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基平板上，移入24 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌絲后，反復(fù)純化，直至獲得干巴菌純培養(yǎng)物。于4個(gè)干巴菌子實(shí)體中分別篩選獲得4株干巴菌菌種，并分別命名為T(mén)G-1、TG-2、TG-3、TG-4。

實(shí)施例2干巴菌胞外多糖（EPS）的提取

進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，① 菌種的活化。將干巴菌TG-1、TG-2、TG-3、TG-4分別接種于活化培養(yǎng)基平板上（馬鈴薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，硫酸鎂 1 g/L，磷酸二氫鉀 1.5 g/L），24 ℃培養(yǎng)7 d。取0.5 cm²干巴菌活化菌種接入液體培養(yǎng)基中（馬鈴薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，蛋白胨 2 g/L，硫酸鎂 1 g/L，磷酸二氫鉀 1.5 g/L），500 mL三角瓶裝液量為300 mL，然后于搖床24 ℃振蕩培養(yǎng)10 d。② 培養(yǎng)條件。裝量：7.5升；接種量：10 %；發(fā)酵溫度：24 ℃；攪拌速度：350 r/min；泡沫控制：接種后加兩滴消泡劑。③ 發(fā)酵過(guò)程中pH值及DO值的測(cè)定。利用pH電極及溶氧電極自動(dòng)在線測(cè)定并記錄數(shù)據(jù)。④ 菌絲體的分離。將干巴菌培養(yǎng)物離心（10000 r/min，10 min），反復(fù)離心洗滌菌絲體3遍后，將收集到的上清液或?yàn)V液合并，并濃縮至原體積2/3～1/4。⑤ 加入3倍體積乙醇。靜置12 h至胞外多糖完全析出，過(guò)濾分離胞外多糖，55 ℃條件下烘干。⑥ 將上述多糖溶于去離子水中，除蛋白5次，凍干后得到EPS。

干巴菌TG-1、TG-2、TG-3、TG-4的EPS產(chǎn)量分別為0.78 g/L，0.42 g/L，0.49 g/L，0.56 g/L。因此，干巴菌TG-1菌株的EPS產(chǎn)量最高，是生產(chǎn)干巴菌EPS的理想菌株。

實(shí)施例3體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

（1）還原力的測(cè)定

采用普魯士蘭法進(jìn)行還原力的測(cè)定。將干巴菌胞外多糖分別用去離子水進(jìn)行梯度稀釋，配置一系列不同濃度的多糖水溶液。取1 mL多糖樣品于試管中，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6，0.2 mol/L）和1 mL鐵氰化鉀溶液（10 g/L），混勻后置于50 ℃恒溫水浴鍋中20 min。水浴結(jié)束后，再加入2 mL三氯乙酸（100 g/L）和1.2 mL三氯化鐵溶液（1 g/L）?；靹蚝鬁y(cè)定700 nm處吸光度，并用2，6-二叔丁-4-甲基苯酚（2, 6 - di - tert - butyl - 4 - methylphenol, BHT）作為陽(yáng)性對(duì)照。

（2）羥基自由基清除能力的測(cè)定

采用Fenton法進(jìn)行羥基自由基清除能力的測(cè)定。配置一系列不同濃度的干巴菌胞外多糖水溶液。將1 mL硫酸亞鐵溶液（9 mmol/L），1 mL水楊酸乙醇溶液（9 mmol/L），1 mL多糖樣品溶液和1 mL過(guò)氧化氫溶液（8.8 mmol/L）于試管中混合均勻，37 ℃水浴30 min。離心（5000 r/min，10 min）后取上清液于510 nm處測(cè)定吸光度，并用BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。按照以下公式計(jì)算羥基自由基清除率（Scavenging rate, SR），SR (%) = (A₀–A)/A₀×100。其中，A₀為空白對(duì)照的吸光度，A為多糖樣品的吸光度。羥基自由基的清除能力以EC₅₀值表示，EC₅₀值代表羥基自由基清除50%時(shí)所需要的樣品濃度。EC₅₀值越小則代表羥基自由基的清除能力越強(qiáng)。

（3）超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

超氧陰離子自由基清除能力采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行測(cè)定。配置一系列不同濃度的干巴菌胞外多糖水溶液。將1 mL多糖樣品水溶液與2 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.2，50 mmol/L）混合均勻，置于25 ℃水浴中20 min，水浴結(jié)束后，加入0.4 mL 25 ℃水浴預(yù)熱過(guò)的鄰苯三酚溶液（5 mmol/L），迅速混合均勻，于325 nm每隔20 s測(cè)定一次吸光度，持續(xù)5 min，并用BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。按照以下公式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率（SR），SR(%) = (S₀–S)/S₀×100。其中，S₀為空白對(duì)照吸光度的斜率（斜率即為鄰苯三酚的自氧化速率），S為多糖樣品吸光度的斜率。較低的斜率代表較高的超氧陰離子自由基清除能力。超氧陰離子自由基的清除能力以EC₅₀值表示，EC₅₀值代表超氧陰離子自由基清除50%時(shí)的樣品濃度。

（4）DPPH自由基清除能力的測(cè)定

將干巴菌胞外多糖進(jìn)行梯度稀釋，配置一系列不同濃度的多糖水溶液。取2 mL多糖樣品溶液于試管中，加入2 mL DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/L），混合均勻后避光反應(yīng)30 min，然后在517 nm處測(cè)定其吸光度，用BHT作為為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)吸光度計(jì)算DPPH自由基的清除能力，清除能力（SR）的計(jì)算公式為：SR (%) = [1–(A–A₀)/A₁]×100。其中，A為2 mL多糖樣品溶液與2 mL DPPH乙醇溶液混合液的吸光度，A₀為2 mL乙醇與2 mL多糖樣品溶液混合液的吸光度，A₁為2 mL去離子水與2 mL DPPH乙醇溶液混合液的吸光度。DPPH自由基的清除能力以EC₅₀值表示，EC₅₀值代表清除50% DPPH自由基的樣品濃度。DPPH自由基的清除能力用BHT作為為陽(yáng)性對(duì)照。

由圖2A可見(jiàn)，EPS具有一定的還原力，并且，還原力的大小隨著濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)濃度為2500 mg/L時(shí)，EPS，EPS-1，EPS-2，EPS-3的還原力分別為1.22，1.29，1.42和1.131。因此，還原力的強(qiáng)弱順序?yàn)镋PS-2 > EPS-1 > EPS > EPS-3。EPS-2的還原力最強(qiáng)。由圖2B可見(jiàn)，EPS及其組分EPS-1，EPS-2，EPS-3都具備羥基自由基的清除能力，并且隨著濃度的增加表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。EPS，EPS-1，EPS-2，EPS-3清除羥基自由基的EC50值分別為264.74 mg/L，329.55 mg/L，269.05 mg/L和349.27 mg/L。因此，清除羥基自由基能力的強(qiáng)弱順序?yàn)镋PS >EPS-2 > EPS-1 > EPS-3。由圖2C可見(jiàn)，EPS及其組分都具備超氧陰離子自由基的清除能力，并且，隨著濃度的增加都表現(xiàn)出了明顯的量效關(guān)系。EPS，EPS-1，EPS-2，EPS-3清除超氧陰離子自由基的EC50值分別為2196.79 mg/L，2268.94 mg/L，2162.36 mg/L和2312.16 mg/L。因此，清除超氧陰離子自由基能力的強(qiáng)弱順序?yàn)镋PS-2 > EPS > EPS-1 > EPS-3。由圖2D可見(jiàn)，EPS及其組分都具備DPPH自由基的清除能力，并且，隨著濃度的增加都表現(xiàn)出了明顯的量效關(guān)系。EPS，EPS-1，EPS-2，EPS-3清除DPPH自由基的EC50值分別為1248.89 mg/L，1500 mg/L，1169.86 mg/L和1524.76 mg/L。因此，清除DPPH自由基能力的強(qiáng)弱順序?yàn)镋PS-2 > EPS > EPS-1 > EPS-3?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EPS的三個(gè)組分中EPS-2的抗氧化能力最強(qiáng)，其次為EPS-1和EPS-3。

實(shí)施例4保濕實(shí)驗(yàn)：

準(zhǔn)確稱取干巴菌胞外多糖（EPS）、高分子量透明質(zhì)酸（HA-H）、低分子量透明質(zhì)酸（HA-L）和甘油（Gl）樣品0.2000g于稱量瓶（25×25）中，并配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的溶液，分別置于裝有飽和醋酸鉀（RH60%）、飽和碳酸鈉（RH43%）和變色硅膠（RH0%）的干燥器中，用甘油，低分子量及高分子量的透明質(zhì)酸鈉作為對(duì)照。將兩個(gè)干燥器置于25 ℃的恒溫箱中，分別在4，8，16，24，32，40，48，60，72，84，96，108，120 h后稱重，計(jì)算保濕率。保濕率計(jì)算公式：保濕率%=（m_n﹣m₀）/m_n×100%，式中：m_n為放置之前樣品質(zhì)量，m₀為放置之后樣品質(zhì)量。

由圖3可以看出，在相對(duì)濕度60%的條件下，在120 h時(shí)，EPS、HA-H、HA-L和Gl的保濕率分別為61.87%，53.87%，56.96%和50.18%。因此，在該相對(duì)濕度條件下，干巴菌胞外多糖（EPS）的保濕能力要高于透明質(zhì)酸（HA）和甘油（Gl）。由圖4可以看出，在相對(duì)濕度43%的條件下，在120 h時(shí)，EPS、HA-H、HA-L和Gl的保濕率分別為88.47%，88.12%，86.63%和84.19%。因此，在該相對(duì)濕度條件下，干巴菌胞外多糖（EPS）的保濕能力要優(yōu)于透明質(zhì)酸（HA）和甘油（Gl）。由圖5可以看出，在120 h時(shí)，EPS、HA-H、HA-L和Gl的保濕率分別為29.87%，38.34%，34.72%和18.71%。因此，在該相對(duì)濕度的條件下，干巴菌胞外多糖（EPS）的保濕能力要低于透明質(zhì)酸（HA）而高于甘油（Gl）。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡(jiǎn)化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。