本發(fā)明涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205及其篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

金黃色葡萄球菌腸毒素是由金黃色葡萄球菌分泌的具有超抗原活性的外毒素。金黃色葡萄球菌腸毒素可不經(jīng)抗原提呈細(xì)胞加工，直接與MHCⅡ類(lèi)分子非限制性的結(jié)合，形成的復(fù)合物與T淋巴細(xì)胞抗原受體的β鏈V區(qū)結(jié)合，大量激活T淋巴細(xì)胞，使其活化、增殖，并釋放大量的炎性細(xì)胞因子引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致炎癥失控和多器官的損害，引起毒素休克等疾病。此外，由于金黃色葡萄球菌腸毒素較能抗消化，耐熱以及只需很小劑量就可引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答，金黃色葡萄球菌腸毒素也被作為腫瘤治療的超抗原藥物。

金黃色葡萄球菌腸毒素有多個(gè)血清型，分別是A型、B型、C1型、C2型、C3型、D型、E型、G型、H型、I型、M型、N型、O型和毒性休克綜合癥1型毒素、毒性休克綜合癥2型毒素等，其中金黃色葡萄球菌腸毒素C2不僅與金黃色葡萄球菌相關(guān)感染有關(guān)，同時(shí)也是金黃色葡萄球菌腸毒素中應(yīng)用最多的超抗原藥物。

檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素C2主要采用免疫學(xué)方法，包括沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、ELISA、固相RIA、生物傳感器等，這些方法使用抗體作為金黃色葡萄球菌腸毒素C2檢測(cè)的識(shí)別元件，而抗體的制備存在周期長(zhǎng)，步驟繁瑣，成本高等不足之處。近年來(lái)，以檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素C2基因?yàn)槟繕?biāo)的分子生物學(xué)方法發(fā)展較快，但PCR等分子生物學(xué)方法仍存在假陽(yáng)性、假陰性等技術(shù)難題。因此，研制具有更高靈敏度、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的金黃色葡萄球菌腸毒素C2檢測(cè)新技術(shù)，對(duì)于食品衛(wèi)生監(jiān)督、臨床金黃色葡萄球菌感染的診療等都有重要意義。

治療金黃色葡萄球菌腸毒素C2引起的毒素休克，臨床常采用抗炎、補(bǔ)液等對(duì)癥支持療法。最新研究發(fā)現(xiàn)，抑制金黃色葡萄球菌腸毒素C2的超抗原活性，在初始階段阻斷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，是治療金黃色葡萄球菌腸毒素C2相關(guān)疾病的有效策略?；诖瞬呗裕兄聘鞣N多肽藥物、抗體藥物、疫苗等，已成為的金黃色葡萄球菌腸毒素C2生物技術(shù)新藥研究的熱點(diǎn)。

金黃色葡萄球菌腸毒素C2超抗原藥物的獲得，常采用基因克隆的方法，將金黃色葡萄球菌腸毒素C2基因片段克隆至原核表達(dá)載體中，在大腸桿菌中表達(dá)并純化。但這種方法中純化步驟常采用離子交換方法或帶標(biāo)簽的親和純化方法，前者吸附選擇特異性差，后者試劑成本較高。

適配體又被稱(chēng)為“合成抗體”、“化學(xué)抗體”，其化學(xué)本質(zhì)是一條單鏈寡核酸分子(ssDNA或RNA)折疊成特定三維結(jié)構(gòu)與靶物質(zhì)高親和力和高特異性結(jié)合。適配體的獲得通過(guò)指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,SELEX)的體外篩選過(guò)程。核酸適配體具有高親和力、高特異性、可體外合成、可通過(guò)修飾改變其功能及藥代動(dòng)力學(xué)特性、無(wú)免疫原性、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)?；谏鲜鰞?yōu)勢(shì)開(kāi)發(fā)的核酸適配體藥物可特異性阻斷靶標(biāo)功能；將核酸適配體作為識(shí)別元件，還可開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便、精準(zhǔn)的檢測(cè)新技術(shù)以及高效、經(jīng)濟(jì)的親和純化系統(tǒng)。因此，篩選出高特異性、高親和力結(jié)合金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體具有重要的科研、臨床和市場(chǎng)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有高特異性和高親和力的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205及其篩選方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205，它的序列如下：

AGGGCCGAGCTCACTTGTGGGGCAGGTGATCGGCAGTGGC 40

TTTGGCGCGCGCTCCGCCGGCACAATTGTGC 71

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205的篩選方法，基于核酸適配體的體外SELEX篩選技術(shù)，利用羧基磁珠作為固相介質(zhì)，以金黃色葡萄球菌腸毒素C2為靶標(biāo)，通過(guò)金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠從ssDNA文庫(kù)中篩選得到與金黃色葡萄球菌腸毒素C2特異性結(jié)合的核酸適配體。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205的應(yīng)用，在分離、純化金黃色葡萄球菌腸毒素C2中的應(yīng)用。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205的應(yīng)用，在分析檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素C2中的非疾病診斷和治療方法應(yīng)用。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205的應(yīng)用，在金黃色葡萄球菌腸毒素C2為效應(yīng)分子的靶向治療中的應(yīng)用。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205的應(yīng)用，在治療金黃色葡萄球菌感染中以及在治療金黃色葡萄球菌腸毒素C2引起相關(guān)綜合癥中的應(yīng)用。

較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1.該核酸適配體C205無(wú)毒性，分子量小，滲透性好，易于合成與標(biāo)記。

2.該核酸適配體C205的合成成本較抗體制備的成本低，且周期短，重現(xiàn)性好。

3.該核酸適配體C205能高親和力、高特異性地與金黃色葡萄球菌腸毒素C2結(jié)合，解離常數(shù)為21.6±3.1nM，且它對(duì)其他同源蛋白不具有識(shí)別功能。

4.該核酸適配體C205在金黃色葡萄球菌腸毒素C2的分離、純化，金黃色葡萄球菌腸毒素C2相關(guān)的食品安全檢測(cè)，金黃色葡萄球菌腸毒素C2相關(guān)疾病的診斷和治療，金黃色葡萄球菌感染的診斷和治療，金黃色葡萄球菌腸毒素C2介導(dǎo)的靶向治療等領(lǐng)域方面具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的科學(xué)、社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為核酸適配體C205二級(jí)結(jié)構(gòu)的生物學(xué)信息學(xué)模擬圖。

圖2為熒光結(jié)合率實(shí)驗(yàn)分析核酸適配體C205的特異性圖。在圖2中，橫坐標(biāo)為分析的蛋白，縱坐標(biāo)為熒光結(jié)合率。

圖3為熒光結(jié)合率實(shí)驗(yàn)分析核酸適配體C205結(jié)合金黃色葡萄球菌腸毒素C2的解離常數(shù)繪制曲線。解離常數(shù)(Kd)為21.6±3.1nM。在圖3中，橫坐標(biāo)為DNA濃度(pM)，縱坐標(biāo)為熒光結(jié)合率。

圖4為CCK-8法測(cè)定核酸適配體C205對(duì)金黃色葡萄球菌腸毒素C2誘導(dǎo)的PBMC增殖活性的作用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明：

一種金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205，它的序列如下：

AGGGCCGAGCTCACTTGTGGGGCAGGTGATCGGCAGTGGC 40

TTTGGCGCGCGCTCCGCCGGCACAATTGTGC 71

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205，在25℃，100mM Na⁺，1mM Mg²⁺的條件下，其空間結(jié)構(gòu)如下：

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205，對(duì)所述核酸適配體C205的5’端或3’端進(jìn)行FITC、氨基、生物素、地高辛化學(xué)修飾。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205，對(duì)所述核酸適配體C205做截短或延長(zhǎng)或部分堿基替換的結(jié)構(gòu)改造所得到的產(chǎn)物進(jìn)行FITC、氨基、生物素、地高辛化學(xué)修飾。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205的篩選方法，基于核酸適配體的體外SELEX篩選技術(shù)，利用羧基磁珠作為固相介質(zhì)，以金黃色葡萄球菌腸毒素C2為靶標(biāo)，通過(guò)金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠從ssDNA文庫(kù)中篩選得到與金黃色葡萄球菌腸毒素C2特異性結(jié)合的核酸適配體。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205的篩選方法，它包括以下步驟：

(1)篩選文庫(kù)的準(zhǔn)備：準(zhǔn)備以下序列所示的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)：

5’-AGGGCCGAGCTCACTTGT-N₃₅-CCGCCGGCACAATTGTGC-3’；

(2)將金黃色葡萄球菌腸毒素C2與羧基磁珠偶聯(lián)制備金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠；

(3)將ssDNA文庫(kù)進(jìn)行熱激活處理；

(4)將經(jīng)步驟(3)后的ssDNA文庫(kù)與步驟(2)所得的金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠進(jìn)行孵育；

(5)磁性分離經(jīng)步驟(4)后的金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠，洗去金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠表面未結(jié)合、弱結(jié)合及非特異性結(jié)合的ssDNA；加熱金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠，收集與金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠特異性結(jié)合的ssDNA，即ssDNA富集文庫(kù)；

(6)PCR擴(kuò)增：將步驟(5)所得的ssDNA富集文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中PCR擴(kuò)增所用的引物為：

引物P1：5’-FAM-AGGGCCGAGCTCACTTGT-3’

引物P2：5’-Biotin-GCACAATTGTGCCGGCGG-3’；

(7)PCR產(chǎn)物的純化：利用小片段純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；將純化后的dsDNA與鏈霉親和素磁珠進(jìn)行孵育，結(jié)合dsDNA的鏈霉親和素磁珠經(jīng)洗滌、dsDNA解鏈后，用磁力架分離，收集上清；上清經(jīng)乙醇沉淀后獲得用于下一輪篩選的次級(jí)ssDNA文庫(kù)；

(8)循環(huán)篩選：將步驟(7)所得的FAM標(biāo)記的次級(jí)ssDNA文庫(kù)，作為下一輪篩選的次級(jí)文庫(kù)，并重復(fù)步驟(3)～(7)的篩選過(guò)程。

實(shí)施例一：核酸適配體C205的篩選

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205的篩選方法，它包括以下步驟：

(1)篩選文庫(kù)的準(zhǔn)備：設(shè)計(jì)兩端固定區(qū)域?yàn)?8個(gè)核苷酸、中間隨機(jī)區(qū)域?yàn)?5個(gè)核苷酸的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)(5’-AGGGCCGAGCTCACTTGT-N₃₅-CCGCCGGCACAATTGTGC-3’)，并委托生工生物工程股份有限公司合成。

(2)金黃色葡萄球菌腸毒素C2與羧基磁珠偶聯(lián)：所述金黃色葡萄球菌腸毒素C2蛋白購(gòu)自美國(guó)Toxin Technology公司，所述羧基磁珠及其偶聯(lián)試劑購(gòu)自美國(guó)Bangs Laboratories公司，操作參照制造商提供的說(shuō)明書(shū)；通過(guò)BCA法蛋白濃度測(cè)定耦聯(lián)前后金黃色葡萄球菌腸毒素C2溶液中蛋白濃度的變化，經(jīng)計(jì)算磁珠的耦聯(lián)效率為85％；將金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠分散于PBS緩沖液中，4℃保存。

(3)取2nmol隨機(jī)ssDNA文庫(kù)溶于500μL選擇緩沖液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM MgCl₂，5mM KCl，pH 7.4)，然后經(jīng)熱激活處理。其中，熱激活處理的方法為：95℃變性5min后，立即置于冰水浴中冰浴10min，隨后置于室溫10min。

(4)將經(jīng)步驟(3)后的ssDNA文庫(kù)與步驟(2)所得的金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠(金黃色葡萄球菌腸毒素C2載量為100ng)以及酵母tRNA(摩爾量為ssDNA文庫(kù)的5倍)混合并于室溫孵育1h。

(5)磁性分離經(jīng)步驟(4)后的金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠，用含0.2％BSA的選擇緩沖液洗去金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠表面未結(jié)合、弱結(jié)合及非特異性結(jié)合的ssDNA；然后將金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠用200μL ddH₂O重懸，100℃熱水浴5min后，置于磁力架1-2min，收集上清，獲得與金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠特異性結(jié)合的ssDNA，即ssDNA富集文庫(kù)。

(6)PCR擴(kuò)增：將步驟(5)所得的ssDNA富集文庫(kù)加入到1mL PCRmix中；漩渦振蕩混勻后，按每管50μL分裝進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min后；94℃變性30S，58℃退火30S，72℃延伸30S，15-25個(gè)循環(huán)。

其中1mL PCRmix中含有：10×PCR緩沖液100μL；pfu酶3μL；dNTP 20μL；引物P1：5’-FAM-AGGGCCGAGCTCACTTGT-3’和引物P2：5’-Biotin-GCACAATTGTGCCGGCGG-3’各3μL；所述引物P1和引物P2均委托生工生物工程股份有限公司合成。

(7)PCR產(chǎn)物的純化：兩端分別標(biāo)有生物素和熒光基團(tuán)FAM的PCR產(chǎn)物，使用小片段純化試劑盒純化(所述的小片段純化試劑盒購(gòu)自生工生物工程股份有限公司)，將純化后的dsDNA與鏈霉親和素磁珠(購(gòu)自Invitrogen-Dynal公司)在37℃孵育20min，用洗滌緩沖液(5mM Tris-HCl，pH 7.5，1M NaCl，500μMEDTA)洗滌結(jié)合dsDNA的鏈霉親和素磁珠三次后，用50μL NaOH溶液(0.1M)在37℃孵育30min使dsDNA解鏈；用磁力架分離，收集上清，上清經(jīng)乙醇沉淀獲得FAM標(biāo)記的次級(jí)ssDNA文庫(kù)，并溶解于選擇緩沖液中，作為下一輪篩選的次級(jí)文庫(kù)。

(8)篩選過(guò)程共進(jìn)行9輪。從第二輪開(kāi)始，次級(jí)文庫(kù)的用量均為50pmol。

實(shí)施例二：核酸適配體C205序列的分析：

(1)經(jīng)過(guò)9輪篩選后，收集富集的ssDNA文庫(kù)，并委托上海派森諾生物科技股份有限公司利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)文庫(kù)序列進(jìn)行分析，分析過(guò)程為：PCR擴(kuò)增富集文庫(kù)，并加上測(cè)序接頭和Index部分；通過(guò)凝膠電泳選擇純化文庫(kù)；利用Agilent 2100Bioanalyzer通過(guò)Agilent High Sensitivity DNA Kit對(duì)文庫(kù)質(zhì)控；利用Quant-iT PicogGreen dsDNA Assay Kit對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量；利用IlluminateNextSeq 500平臺(tái)，以單鏈文庫(kù)為模板進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增、測(cè)序引物退火、邊合成邊測(cè)序；并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和富集分析。

(2)利用UNAFold網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)分析在25℃，100mM Na⁺，1mM Mg²⁺的條件下，核酸適配體C205序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。分析出核酸適配體C205序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

實(shí)施例三：核酸適配體C205的特異性分析：

(1)體外化學(xué)合成FAM標(biāo)記的核酸適配體C205，并將其溶于選擇緩沖液。

(2)參照實(shí)施例一中步驟(2)，將BSA、金黃色葡萄球菌腸毒素A、金黃色葡萄球菌腸毒素B以及金黃色葡萄球菌腸毒素C1分別與羧基磁珠耦聯(lián)制備BSA磁珠、金黃色葡萄球菌腸毒素A磁珠、金黃色葡萄球菌腸毒素B磁珠、金黃色葡萄球菌腸毒素C1磁珠以及金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠。其中，所述BSA購(gòu)自Sigma公司，所述金黃色葡萄球菌腸毒素A、金黃色葡萄球菌腸毒素B以及金黃色葡萄球菌腸毒素C1均購(gòu)自美國(guó)Toxin Technology公司。

(3)取200μL步驟(1)所得的核酸適配體C205溶液分別與步驟(2)制得的BSA磁珠、金黃色葡萄球菌腸毒素A磁珠、金黃色葡萄球菌腸毒素B磁珠、金黃色葡萄球菌腸毒素C1磁珠以及金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠混合，在暗盒中室溫孵育1h，設(shè)空白磁珠為對(duì)照。

(4)用0.1％PBST洗滌經(jīng)步驟(3)的上述磁珠3遍，與上述磁珠結(jié)合的核酸適配體，用200μL選擇緩沖液100℃煮沸5min洗脫。

(5)利用熒光定量?jī)x分別測(cè)定初始溶液和洗脫液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算熒光結(jié)合率＝(初始熒光強(qiáng)度-洗脫熒光強(qiáng)度)/初始熒光強(qiáng)度×100％，用計(jì)算值初步代表核酸適配體C205與靶分子的結(jié)合率。

如圖2所示，核酸適配體C205與金黃色葡萄球菌腸毒素C2的結(jié)合率均顯著高于其與BSA、金黃色葡萄球菌腸毒素A、金黃色葡萄球菌腸毒素B、金黃色葡萄球菌腸毒素C1的結(jié)合率，表明核酸適配體C205與金黃色葡萄球菌腸毒素C2的結(jié)合具有較好的特異性。

實(shí)施例四：核酸適配體C205的親和力分析

(1)取不同濃度的FAM標(biāo)記核酸適配體C205溶液分別與金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠混合，在暗盒中室溫孵育1h。

(2)參照實(shí)施例三中的步驟(4)和步驟(5)，實(shí)驗(yàn)獲得并計(jì)算不同濃度核酸適配體C205溶液與金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠的熒光結(jié)合率。

(3)利用熒光結(jié)合率的計(jì)算值，繪制核酸適配體C205結(jié)合金黃色葡萄球菌腸毒素C2的飽和結(jié)合曲線，通過(guò)非線性回歸分析計(jì)算核酸適配體C205結(jié)合金黃色葡萄球菌腸毒素C2的解離常數(shù)。

如圖3所示，我們獲得了核酸適配體C205的飽和結(jié)合曲線，經(jīng)計(jì)算核酸適配體C205的解離常數(shù)為21.6±3.1nM，表明核酸適配體C205與金黃色葡萄球菌腸毒素C2結(jié)合的結(jié)合能力強(qiáng)，解離常數(shù)在納摩爾級(jí)別。

實(shí)施例五：核酸適配體C205抑制金黃色葡萄球菌腸毒素C2的超抗原活性

(1)無(wú)菌抽取健康成年志愿者外周血，肝素抗凝后用等量RPMI1640培養(yǎng)液稀釋?zhuān)糜诹馨图?xì)胞分離液上，采用常規(guī)密度梯度離心法(2000rmp，20min)分離獲取人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)。

(2)用含5％新生牛血清(NBS)和5％人自體血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1～2×10⁶/mL，鋪96孔板，每孔100μL。

(3)各組加入核酸適配體C205的濃度分別依次為0μM、10μM，每孔加入終濃度為250ng/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素C2，設(shè)置即不加金黃色葡萄球菌腸毒素C2，也不加核酸適配體C205的空白對(duì)照組。

(4)將細(xì)胞置于37℃、5％CO₂的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，每孔加入10μL的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4h。

(5)分光光度計(jì)檢測(cè)每孔在450nm的吸光度(OD)。

如圖4所示，橫坐標(biāo)為核酸適配體C205的濃度，縱坐標(biāo)為450nm處的OD值。當(dāng)核酸適配體C205為10μM時(shí)，金黃色葡萄球菌腸毒素C2刺激PBMCs的增殖水平明顯降低(P＜0.05)，上述結(jié)果表明核酸適配體C205在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)金黃色葡萄球菌腸毒素C2的超抗原活性具有明顯地抑制作用，是一種潛在的金黃色葡萄球菌腸毒素C2抑制劑。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院

<120> 金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C205及其篩選方法和應(yīng)用

<160> 3

<210> 1

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agggccgagc tcacttgtgg ggcaggtgat cggcagtggc 40

tttggcgcgc gctccgccgg cacaattgtg c 71

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agggccgagc tcacttgt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcacaattgt gccggcgg 18