本發(fā)明屬于微生物技術領域，具體涉及一株蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13及其應用。

背景技術：

松材線蟲病(Bursaphelenchus xylophilus)又稱松樹萎蔫病，是松樹的一種毀滅性流行病害，在我國松墨天牛(Monochamus Alternatus Hope)是其主要的傳播媒介。該病已在中國、日本、韓國、墨西哥等國造成了巨大經(jīng)濟損失，成為世界上許多國家最重要的病蟲害檢疫對象。目前，對松材線蟲病還沒有特別有效的防治措施，主要還是采取傳統(tǒng)的化學防治。但由于化學藥物存在很多弊端(持效性差、易產(chǎn)生抗藥性、污染環(huán)境及破壞生態(tài)平衡等)，其應用正在受到越來越多的限制。所以生物防治正日益受到各國的重視。近年來，從不同來源的生物中，尋找對松材線蟲具有較高殺線活性的殺線劑已成為松材線蟲病生物防治研究的熱點，其中研究最多的是有殺線活性的生防微生物。至今已發(fā)現(xiàn)了大量具有殺線活性的生防微生物，主要包括捕食線蟲真菌、內(nèi)寄生真菌、產(chǎn)毒真菌以及能分泌殺線物質(zhì)的細菌和放線菌等。由于細菌的培養(yǎng)簡便、生長繁殖快等特點，使生防細菌在生防微生物的研究中占有重要的地位。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了多種對植物寄生線蟲有較高毒效作用的細菌，研究較多的有蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、巴氏桿菌(Pasteuria penetrans)、假單胞菌(Pseudomonas spp.)及其他一些土壤細菌等，但是上述生防細菌主要用于根結線蟲的防治，尚沒有用于松材線蟲防治的商品化生防細菌的報道。由于松材線蟲病是發(fā)生在松樹上，篩選的殺線細菌將在松林中應用，殺線細菌能否在松林中良好的定殖，對其防治效果會有很大的影響。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一株蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13，滿足殺松材線蟲的使用。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13的應用。

技術方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

一株殺松材線蟲的蠟樣芽孢桿菌，其分類命名為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)NJSZ-13，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2016660，保藏日期為2016年11月20日，保藏地址為中國武漢武漢大學。

所述的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13在殺松材線蟲中的應用。

所述的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13的菌懸液在殺松材線蟲中的應用。

所述的應用，保存于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13接入含牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基50mL的三角瓶中，于28℃和無光照條件下以200r/min轉(zhuǎn)速搖培；將搖培4d后的細菌培養(yǎng)液用濾膜孔徑為0.22μm的細菌過濾器將菌體過濾后，所得的濾液為無菌發(fā)酵濾液；將以上過濾器的濾膜放入裝有50mL PBS緩沖液的三角瓶中常溫震蕩十分鐘，取出濾膜后所剩液體為菌懸液。其中，菌懸液的濃度為10⁵cfu/mL。

所述的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13的無菌發(fā)酵液在殺松材線蟲中的應用。

所述的應用，保存于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13接入含牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基50mL的三角瓶中，于28℃和無光照條件下以200r/min轉(zhuǎn)速搖培；將搖培4d后的細菌培養(yǎng)液用濾膜孔徑為0.22μm的細菌過濾器將菌體過濾后，所得的濾液為無菌發(fā)酵濾液。

細菌的篩選：從南京中山陵、上海辰山植物園、洛陽隋唐植物園的黑松、馬尾松、濕地松和火炬松莖部共分離到細菌菌株137株，對137株細菌進行殺線活性的測定。從中篩選出一株無菌發(fā)酵濾液和菌體水懸液都對松材線蟲有毒殺作用的細菌NJSZ-13。

NJSZ-13的鑒定：菌株NJSZ-13在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(NA)上培養(yǎng)48h，菌落呈圓形，稍微隆起，顏色為淡乳白色，不透明，表面較粗糙，蠟油狀，邊緣有細波狀。細胞呈桿狀，革蘭氏染色陽性，大小為(1.0～1.1)μm×(2.6～5.0)μm，芽孢卵圓形，中生或近中生，兩端鈍圓，鏈狀排列，有鞭毛，具運動性。革蘭氏染色陽性，氧化酶反應陰性，接觸酶反應陽性，明膠水解陽性，淀粉水解陽性，甲基紅試驗陰性，V-P反應陽性。在Biolog鑒定板上培養(yǎng)16～24h后，測得NJSZ-13為Bacillus cereus/Bacillus thuringiensis，SIM值為0.802。將NJSZ-13的16SrDNA序列(SEQ ID NO.1所示)與GenBank中的序列進行BLAST比對與NJSZ-13菌株相似性最高的是Bacillus cereus，同源性達到99％。將比對獲得的同源序列和測定序列運用ClustalX軟件進行多重序列的同源性分析，然后利用MEGA6.05軟件構建系統(tǒng)進化樹。由構建的系統(tǒng)進化樹可以看出，NJSZ-13與Bacillus cereus同屬一個遺傳分枝。最終確定菌株NJSZ-13為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，命名為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)NJSZ-13。

有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明從松樹體內(nèi)分離的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13具有較好的競爭能力和定殖能力，該蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13的無菌發(fā)酵液和菌體水懸液對松材線蟲都有較強的殺線活性。經(jīng)試驗，在處理36h后，無菌發(fā)酵液對松材線蟲的致死率能達到100％，并且可以消解線蟲蟲體，而在處理48h后，菌體水懸液對松材線蟲的致死率能達到86.5％，具有很好的實用性。

附圖說明

圖1是蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌體水懸液對松材線蟲的致死作用結果圖；

圖2是蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13無菌發(fā)酵液對松材線蟲的毒殺作用結果圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

實施例1

1)供試線蟲的培養(yǎng)和線蟲懸浮液的制備

供試松材線蟲由南京林業(yè)大學江蘇省有害生物入侵預防與控制重點實驗室提供，分離于江蘇省連云港地區(qū)發(fā)病的黑松上。松材線蟲采用灰葡萄孢(Botrytis cinerca)培養(yǎng)，將線蟲接種在長滿灰葡萄孢的PDA平板上，放置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至灰葡萄孢菌絲消失，線蟲長滿平板。采用貝爾曼漏斗法分離收集線蟲，然后離心消毒濃縮配制成約20條/μL的線蟲懸液。

2)NJSZ-13的無菌發(fā)酵濾液和菌體水懸液的制備

保存于牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基上的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13接入含牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基50mL的三角瓶中，于28℃和無光照條件下以200r/min轉(zhuǎn)速搖培。將搖培4d后的細菌培養(yǎng)液用濾膜孔徑為0.22μm的細菌過濾器將菌體過濾后，所得的濾液為試驗中的無菌發(fā)酵濾液。

將以上過濾器的濾膜放入裝有50mL PBS緩沖液的三角瓶中常溫震蕩十分鐘，取出濾膜后所剩液體為含細菌菌體的水懸液，用分光光度計調(diào)整其濃度為10⁵cfu/mL，即為供試菌體水懸液。

3)蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13無菌發(fā)酵濾液殺線活性的測定

取以上無菌發(fā)酵濾液1mL加入1.5mL的離心管中，接著加入50μL線蟲懸液約1000條線蟲，混合。分別于處理12h、24h和36h后吸取混合液50μL約50條線蟲在體視顯微鏡下觀察線蟲死亡情況以及蟲體的消解情況，計算線蟲的死亡率和消解率。每處理重復三次，以不接菌的NA液體培養(yǎng)基和清水為對照。線蟲死亡標準是蟲體僵直，用解剖針攪動或接觸刺激時仍不活動，如圖1和圖2所示。

表1蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13的無菌發(fā)酵濾液對松材線蟲的殺傷效果

結果(表1)表明：松材線蟲經(jīng)蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13的無菌發(fā)酵液處理36h后，死亡率可以達到100％。蟲體也隨之發(fā)生消解，說明其具有高效毒殺松材線蟲的活性。

4)蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌體水懸液殺線活性的測定

取供試菌體水懸液1mL加入1.5mL的離心管中，接著加入50μL線蟲懸液約1000條線蟲，混合。分別于處理24h、48h后吸取混合液50μL約50條線蟲在體視顯微鏡下觀察線蟲死亡情況，計算線蟲的死亡率。每處理重復三次，以PBS緩沖液為對照。線蟲死亡標準是蟲體僵直，用解剖針攪動或接觸刺激時仍不活動。

表2蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13的菌體水懸液對松材線蟲的殺傷效果

結果(表2)表明：蠟樣芽孢桿菌的菌體水懸液對松材線蟲有較強的殺線活性。在處理48h后，菌體水懸液對松材線蟲的致死率能達到86.5％，而對照PBS緩沖液對松材線蟲的致死率僅為1.8％。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林業(yè)大學

<120> 一株蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13及其應用

<130> 100

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1427

<212> DNA

<213> Bacillus cereus

<400> 1

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