本發(fā)明涉及DNA指紋圖譜
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合以及應(yīng)用和方法。
背景技術(shù)：
：枸杞是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，在中藥材領(lǐng)域具有重要的地位。寧夏作為枸杞地道產(chǎn)區(qū)，枸杞種植歷史悠久，在枸杞育種、栽培、加工等方面成果頗豐。近年來，隨著枸杞育種方法的不斷進(jìn)步，新的枸杞品種也不斷涌現(xiàn)，這些枸杞種質(zhì)資源有許多優(yōu)異品種未能被合理利用。因此，將這些枸杞種質(zhì)資源進(jìn)行有效分類和鑒定，對(duì)枸杞種質(zhì)資源的研究、品種創(chuàng)新尤為重要。DNA指紋圖譜技術(shù)對(duì)植物品種進(jìn)行分離和鑒定的有效手段。DNA指紋圖譜是指DNA樣品用特定分子標(biāo)記技術(shù)處理顯示出具有特定DNA片段的總稱。DNA指紋圖譜技術(shù)最早用于在刑偵或親子鑒定上確定人的身份，而后隨著生物技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，DNA指紋圖譜技術(shù)在很多植物上得到廣泛的應(yīng)用。目前，常用于構(gòu)建DNA指紋圖譜的分子標(biāo)記有SSR、AFLP、SRAP、SCoT、RAPD、SNP以及ISSR。不同分子標(biāo)記構(gòu)建的DNA指紋圖譜各有其特點(diǎn)。其中，以ISSR、SSR、SRAP應(yīng)用最廣泛。目前，DNA指紋圖譜的在枸杞上的應(yīng)用研究并不多，由其是以SSR分子標(biāo)記技術(shù)來構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的更未見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合，該引物組合可用于構(gòu)建出枸杞DNA指紋圖譜。本發(fā)明的另一目的在于提供上述引物組合在構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的方法，該方法所構(gòu)建出的枸杞DNA指紋圖譜能夠準(zhǔn)確反應(yīng)出枸杞DNA指紋圖譜的信息。本發(fā)明的另一目的在于提供采用上述方法得到的枸杞DNA指紋圖譜在鑒定枸杞種質(zhì)資源中的應(yīng)用。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合，其包括第1-15引物對(duì)，上述第1-15引物對(duì)的堿基序列分別如SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4、SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10、SEQIDNO.11-12、SEQIDNO.13-14、SEQIDNO.15-16、SEQIDNO.17-18、SEQIDNO.19-20、SEQIDNO.21-22、SEQIDNO.23-24、SEQIDNO.25-26、SEQIDNO.27-28、SEQIDNO.29-30所示。上述的用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合在構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜中的應(yīng)用。一種構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的方法，其包括：用上述的用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合的第1-15引物對(duì)分別對(duì)多個(gè)枸杞種質(zhì)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；將上述擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳，得到擴(kuò)增帶型數(shù)；將上述擴(kuò)增帶型數(shù)進(jìn)行編碼處理，得到每一種上述枸杞種質(zhì)的DNA對(duì)應(yīng)上述第1-15引物對(duì)的第1-15編號(hào)，串聯(lián)上述第1-15編號(hào)形成字符串。上述的構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的方法所得到的枸杞DNA指紋圖譜在鑒定枸杞種質(zhì)資源中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)枸杞基因組序列進(jìn)行分析篩選，得到可用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合，該引物組合包括SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4、SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10、SEQIDNO.11-12、SEQIDNO.13-14、SEQIDNO.15-16、SEQIDNO.17-18、SEQIDNO.19-20、SEQIDNO.21-22、SEQIDNO.23-24、SEQIDNO.25-26、SEQIDNO.27-28、SEQIDNO.29-30所示的15個(gè)引物對(duì)，該15個(gè)引物對(duì)可用于構(gòu)建枸杞品種或枸杞種質(zhì)的DNA指紋圖譜，所得到的枸杞DNA指紋圖譜可以是以電泳圖譜表示的或者是以字符串表示的，其反應(yīng)的指紋信息準(zhǔn)確可靠，該枸杞DNA指紋圖譜作為枸杞種質(zhì)資源鑒定的參考依據(jù)，為枸杞的市場(chǎng)流通、栽培管理等領(lǐng)域得到進(jìn)一步的推廣利用提供支持。同時(shí)也為為DNA指紋圖譜的在枸杞上的進(jìn)一步應(yīng)用研究提供了堅(jiān)實(shí)的理論支持。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。圖1為本發(fā)明用第3引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖2為本發(fā)明用第5引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖3為本發(fā)明用第7引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖4為本發(fā)明用第11引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖5為本發(fā)明用第13引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖6為本發(fā)明用第8引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖7為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖8為本發(fā)明用第14引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖9為本發(fā)明用第1引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖10為本發(fā)明用第15引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖11為本發(fā)明用第12引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖12為本發(fā)明用第4引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖13為本發(fā)明用第2引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖14為本發(fā)明用第9引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖15為本發(fā)明用第6引物對(duì)對(duì)寧杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖16為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)寧杞5號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖17為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)寧杞7號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖18為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)寧農(nóng)杞9號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖19為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)蒙杞1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖20為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)寧夏黃果擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖21為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)寧杞菜1號(hào)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖22為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)黑果擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖23為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)中國(guó)擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖24為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)北方擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖25為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)云南擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖26為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)蔓生擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖27為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)新疆?dāng)U增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖28為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)紅枝擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖29為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)柱筒擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖30為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)截萼擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖31為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)CJ擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖32為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)HB擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖33為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)SC擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖34為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)AN擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖35為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)W30擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖36為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)HZ01擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖37為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)ZH08擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖38為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)W27擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖39為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)W15擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖40為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)ZH02擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖41為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)W13擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖42為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)W26擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖43為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)W37擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖44為本發(fā)明用第10引物對(duì)對(duì)白花擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖譜；圖45為本發(fā)明實(shí)施例8得到的寧杞1號(hào)的DNA指紋圖譜的二維碼圖片。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合以及應(yīng)用和方法進(jìn)行具體說明。SSR標(biāo)記，又稱微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellite)，又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeats，STRs)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simplesequencerepeats，SSR)，是均勻分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，由2～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，因此微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用非常廣泛。每個(gè)微衛(wèi)星DNA都有核心序列和側(cè)翼序列組成，側(cè)翼DNA序列位于核心序列兩端，是保守的特異性單拷貝序列。根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的引物，利用熒光標(biāo)記的PCR引物對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過高分辨率的凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行分離，通過熒光檢測(cè)系統(tǒng)確定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度以檢測(cè)分析微衛(wèi)星序列的多態(tài)性。微衛(wèi)星序列的多態(tài)性即可反應(yīng)不同物種或相似物種之間的差異性。基于此，本發(fā)明的發(fā)明人在對(duì)枸杞基因組的測(cè)序結(jié)果的基礎(chǔ)上開發(fā)并篩選得到具有多態(tài)性的可用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的核心SSR引物。據(jù)此，提出了如下幾方面的內(nèi)容請(qǐng)求保護(hù)。一方面，本發(fā)明提供了用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合，其包括第1-15引物對(duì)(即SSR引物)，第1-15引物對(duì)的堿基序列分別如SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4、SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10、SEQIDNO.11-12、SEQIDNO.13-14、SEQIDNO.15-16、SEQIDNO.17-18、SEQIDNO.19-20、SEQIDNO.21-22、SEQIDNO.23-24、SEQIDNO.25-26、SEQIDNO.27-28、SEQIDNO.29-30所示。結(jié)合常規(guī)的PCR擴(kuò)增技術(shù)和電泳技術(shù)，利用引物組合即可實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)枸杞種質(zhì)或枸杞品質(zhì)的DNA指紋圖譜的構(gòu)建目的。優(yōu)選地，第1-15引物對(duì)中每個(gè)引物對(duì)的上游引物的5’端標(biāo)記有熒光基因；或者第1-15引物對(duì)中每個(gè)引物對(duì)的下游引物的5’端標(biāo)記有熒光基因。為了便于后續(xù)PCR擴(kuò)增提高特異性和產(chǎn)物濃度以擴(kuò)大檢測(cè)信號(hào)，優(yōu)選地，可在第1-15引物對(duì)中每個(gè)引物對(duì)的上游引物的5’端連接M13通用引物的序列，熒光標(biāo)記基因標(biāo)記在M13通用引物的5’端。當(dāng)然，在其他的實(shí)施例中，也可以不用標(biāo)記熒光基因。通過對(duì)第1-15引物對(duì)進(jìn)行標(biāo)記熒光基團(tuán)，使得擴(kuò)增的產(chǎn)物可通過高分辨率的電泳技術(shù)例如毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行分離并被自動(dòng)熒光檢測(cè)，大大地提高了對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分型準(zhǔn)確率，確保所得枸杞DNA指紋圖譜的所反應(yīng)的信息也更準(zhǔn)確。優(yōu)選地，熒光基因?yàn)檫x自FAM、TAMRA、HEX和ROX中的任意一種。另一方面，本發(fā)明提供了用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合在構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜中的應(yīng)用。再一方面，本發(fā)明還提供了構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的方法，其其包括：采用上述的用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合的第1-15引物對(duì)分別對(duì)多個(gè)枸杞種質(zhì)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；將擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳，得到擴(kuò)增帶型數(shù)；將擴(kuò)增帶型數(shù)進(jìn)行編碼處理，得到每一種枸杞種質(zhì)的DNA對(duì)應(yīng)第1-15引物對(duì)的第1-15編號(hào)，串聯(lián)第1-15編號(hào)形成字符串。優(yōu)選地，編碼處理是指：將第1-15引物對(duì)中每對(duì)引物對(duì)對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增帶型數(shù)按照升序排列，并按順序標(biāo)號(hào)，當(dāng)序號(hào)數(shù)小于9時(shí)，用數(shù)字1-9順序表示，當(dāng)序號(hào)數(shù)大于9時(shí)，用英文字母A-Z順序表示。未擴(kuò)增出條帶的用0表示。當(dāng)然，在其他的實(shí)施例中，編碼處理還可以是指：將第1-15引物對(duì)中每對(duì)引物對(duì)對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增帶型數(shù)按照降序方式排列，并按順序標(biāo)號(hào)，用數(shù)字9-1順序表示，當(dāng)序號(hào)數(shù)小于1時(shí)，用英文字母Z-A順序表示。未擴(kuò)增出條帶的用0表示。當(dāng)然，編碼處理的標(biāo)號(hào)規(guī)則可根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)整或選擇，其并不限于所述的兩種編碼處理方式。只要是利用本發(fā)明提供引物組合或提供構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的方法來構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜，無(wú)論采用何種編碼處理方式均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。此外，優(yōu)選地，串聯(lián)第1-15編號(hào)形成字符串是指：按第1編號(hào)、第2編號(hào)、第3編號(hào)、第4編號(hào)、第5編號(hào)、第6編號(hào)、第7編號(hào)、第8編號(hào)、第9編號(hào)、第10編號(hào)、第11編號(hào)、第12編號(hào)、第13編號(hào)、第14編號(hào)、第15編號(hào)的順序進(jìn)行串聯(lián)形成字符串。當(dāng)然，在其他的優(yōu)選的實(shí)施例中，串聯(lián)第1-15編號(hào)形成字符串還可以是指：按第15編號(hào)、第14編號(hào)、第13編號(hào)、第12編號(hào)、第11編號(hào)、第10編號(hào)、第9編號(hào)、第8編號(hào)、第7編號(hào)、第6編號(hào)、第5編號(hào)、第4編號(hào)、第3編號(hào)、第2編號(hào)、第1編號(hào)的順序進(jìn)行串聯(lián)形成字符串。同樣，串聯(lián)第1-15編號(hào)形成字符串的具體串聯(lián)順序也并不限于上述的串聯(lián)順序，采用其他的順序進(jìn)行串聯(lián)第1-15編號(hào)形式述字符串也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。進(jìn)一步地，構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的方法還包括：利用二維碼技術(shù)將字符串形成二維碼圖形。通過以二維碼圖形表示的DNA指紋圖譜，使得所構(gòu)建的DNA指紋圖譜不僅能正確反應(yīng)枸杞種質(zhì)的DNA指紋圖譜信息，還能在枸杞的市場(chǎng)流通、栽培管理等領(lǐng)域得到進(jìn)一步的推廣利用，并且還可以應(yīng)用于可追溯體系建設(shè)和管理。進(jìn)一步地，PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，10個(gè)循環(huán)；95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；95℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，10個(gè)循環(huán)；72℃5min。再一方面，本發(fā)明還提供了上述的構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的方法所得到的枸杞DNA指紋圖譜在鑒定枸杞種質(zhì)資源中的應(yīng)用。綜上，本發(fā)明首次基于枸杞基因測(cè)序結(jié)果基礎(chǔ)上開發(fā)篩選得到具有多態(tài)性的核心骨干SSR引物，即可用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的第1-15引物對(duì)。且利用SSR分子標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)構(gòu)建出了枸杞DNA指紋圖譜，并進(jìn)一步克服了傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率低、靈敏度低、數(shù)據(jù)分析困難等缺點(diǎn)。使得采用發(fā)明提供的引物組合或構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜方法在構(gòu)建的過程具有分辨率高、靈敏度高、數(shù)據(jù)分析便捷等特點(diǎn)。為DNA指紋圖譜在枸杞上的應(yīng)用研究提供更多的理論支持，同時(shí)本發(fā)明得到枸杞DNA指紋圖譜也為對(duì)枸杞種質(zhì)資源或枸杞加工產(chǎn)品的鑒定、分類、流通以及管理等領(lǐng)域提供便捷可靠的參考依據(jù)。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例1本實(shí)施例提供的用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合，其包括第1-15引物對(duì)，各引物對(duì)的上游引物(F)和下游引物(R)的堿基序列如下表1所示。其中，各引物對(duì)的上游引物的5’端連接有M13通用引物，其序列如表1中的下劃線部分所示。當(dāng)然，在其他的實(shí)施例中也可以不用連接M13通用引物。表1.本實(shí)施例提供的用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的第1-15引物對(duì)的堿基序列表1中的引物命名SF1、SF3、SF5、SF12、SF13、SF14、SF15、SF20、SF30、SF51、SF61、SF63、SF68、SF92、SF107分別對(duì)應(yīng)于第1引物對(duì)、第2引物對(duì)、第3引物對(duì)、第4引物對(duì)、第5引物對(duì)、第6引物對(duì)、第7引物對(duì)、第8引物對(duì)、第9引物對(duì)、第10引物對(duì)、第11引物對(duì)、第12引物對(duì)、第13引物對(duì)、第14引物對(duì)、第15引物對(duì)。采用本實(shí)施例提供的第1-15引物對(duì)構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的方法如下。1.1枸杞DNA的提取1.1.1利用CTAB法提取各枸杞品種的DNA，紫外分光光度計(jì)定量后，稀釋到50ng/μl，4℃或-20℃保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜诤罄m(xù)步驟。具體步驟如下：稱取枸杞幼嫩葉片0.1g置于2mL離心管中，加液氮研磨至粉末；之后加入800μL預(yù)熱(65℃)2％CTAB提取液，輕搖混勻；65℃水浴1h，每隔10min輕搖一次；冷卻至室溫后加入800μL氯仿異戊醇(V:V＝24:1)，混勻20min；1000rpm離心10min；吸取上清液移到1.5mL的離心管中，加入600μL預(yù)冷的異丙醇，混勻后置于4℃沉淀1h或-20℃30min；1000rpm離心10min；棄上清液，用70％乙醇洗滌3次，自然晾干；加入100μLddH2O和1μLRNAase，37℃水浴30min；待充分溶解后，用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和純度；稀釋成工作液-20℃保存?zhèn)溆?。利用上述方法分別提取30份枸杞品種的DNA，它們分別是寧杞1號(hào)、寧杞5號(hào)、寧杞7號(hào)、寧農(nóng)杞9號(hào)、蒙杞1號(hào)、寧夏黃果、寧杞菜1號(hào)、黑果、中國(guó)、北方、云南、蔓生、新疆、紅枝、柱筒、截萼、CJ、HB、SC、AN、W30、HZ01、ZH08、W27、W15、ZH02、W13、W26、W37、白花，分別得到30份枸杞品種的DNA模板。1.2PCR擴(kuò)增采用本實(shí)施例提供的引物組合的第1-15引物對(duì)，分別對(duì)上述步驟得到的30份DNA模板進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增。1.2.1PCR擴(kuò)增體系15μL：其中10ng/μLDNA模板2μL，10×PCRBuffer1.5μL，2.5μM的引物各1μL(即單個(gè)引物對(duì)的上、下游引物)，2.5mM的dNTP1.2μL，50mM的Mg2+0.4μL，5μM的M13引物0.8μL，5U/μL的TaqHS酶0.1μL，加ddH20至15μL。1.2.2PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，10個(gè)循環(huán)；95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；95℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，10個(gè)循環(huán)；72℃5min。通過上述PCR擴(kuò)增步驟，分別得到每個(gè)枸杞品種所對(duì)應(yīng)的第1-15引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物。1.3凝膠電泳將上述每個(gè)枸杞品種所對(duì)應(yīng)的第1-15引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，即得到30分別枸杞品種的以電泳圖譜表示的DNA指紋圖譜。采用本實(shí)施例提供的用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合可對(duì)30份枸杞品種構(gòu)建DNA指紋圖譜，所得到的以電泳圖譜形式表示的DNA指紋圖譜可作為枸杞種質(zhì)資源鑒定或分類的參考依據(jù)。實(shí)施例2由于在實(shí)施例1中采用的是普通的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)現(xiàn)來分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的效果，其存在著分辨率低，對(duì)于相差堿基數(shù)的條帶分離效果不明顯，容易導(dǎo)致得到的以電泳圖譜表示的DNA指紋圖譜結(jié)果不準(zhǔn)確的現(xiàn)象。因此，本實(shí)施例本著進(jìn)一步完善和改進(jìn)發(fā)明的目的，對(duì)用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合進(jìn)行熒光基因的標(biāo)記，使得本實(shí)施例所提供的用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合，所擴(kuò)增得到的產(chǎn)物能夠用于毛細(xì)管凝膠電泳，提高電泳圖譜的分辨率，保證所得到的DNA指紋圖譜更準(zhǔn)確。本實(shí)施例所提供的用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合，其包括包括第1-15引物對(duì)。第1-15引物對(duì)中每個(gè)引物對(duì)的上游引物的5’端標(biāo)記有熒光基因，其中，第1-10引物對(duì)和第13引物對(duì)的上游引物的熒光基因是FAM；第11引物對(duì)、第12引物對(duì)、第14引物對(duì)以及第15引物對(duì)的上游引物的熒光基因是HEX。本實(shí)施例提供的第1-15引物對(duì)中的各引物對(duì)的上游引物(F)和下游引物(R)的堿基序列同實(shí)施例1。實(shí)施例3本實(shí)施例所提供的用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合，其包括包括第1-15引物對(duì)。第1-15引物對(duì)中每個(gè)引物對(duì)的上游引物的5’端標(biāo)記有熒光基因，其中，第1-10引物對(duì)和第13引物對(duì)的上游引物的熒光基因是TAMRA；第11引物對(duì)、第12引物對(duì)、第14引物對(duì)以及第15引物對(duì)的上游引物的熒光基因是HEX。本實(shí)施例提供的第1-15引物對(duì)中的各引物對(duì)的上游引物(F)和下游引物(R)的堿基序列同實(shí)施例1。實(shí)施例4本實(shí)施例所提供的用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合，其包括包括第1-15引物對(duì)。第1-15引物對(duì)中每個(gè)引物對(duì)的下游引物的5’端標(biāo)記有熒光基因，其中，第1-10引物對(duì)和第13引物對(duì)的下游引物的熒光基因是TAMRA；第11引物對(duì)、第12引物對(duì)、第14引物對(duì)以及第15引物對(duì)的下游引物的熒光基因是ROX。本實(shí)施例提供的第1-15引物對(duì)中的各引物對(duì)的上游引物(F)和下游引物(R)的堿基序列同實(shí)施例1。實(shí)施例5本實(shí)施例所提供的用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合，其包括包括第1-15引物對(duì)。第1-15引物對(duì)中每個(gè)引物對(duì)的下游引物的5’端標(biāo)記有熒光基因FAM。本實(shí)施例提供的第1-15引物對(duì)中的各引物對(duì)的上游引物(F)和下游引物(R)的堿基序列同實(shí)施例1。實(shí)施例6本實(shí)施例所提供的用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合，其包括包括第1-15引物對(duì)。第1-15引物對(duì)中每個(gè)引物對(duì)的上游引物的5’端標(biāo)記有熒光基因HEX。本實(shí)施例提供的第1-15引物對(duì)中的各引物對(duì)的上游引物(F)和下游引物(R)的堿基序列同實(shí)施例1。實(shí)施例7本實(shí)施例提供了構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的方法，其包括如下步驟。7.1分別提取30份枸杞種質(zhì)DNA，操作步驟參考實(shí)施例1中的步驟1。分別得到30份枸杞品種(分別是寧杞1號(hào)、寧杞5號(hào)、寧杞7號(hào)、寧農(nóng)杞9號(hào)、蒙杞1號(hào)、寧夏黃果、寧杞菜1號(hào)、黑果、中國(guó)、北方、云南、蔓生、新疆、紅枝、柱筒、截萼、CJ、HB、SC、AN、W30、HZ01、ZH08、W27、W15、ZH02、W13、W26、W37、白花)的DNA模板。7.2PCR擴(kuò)增采用實(shí)施例2提供的引物組合的1-15引物對(duì)，分別對(duì)上述步驟得到的30份DNA模板進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增。7.2.1PCR擴(kuò)增體系15μL：其中10ng/μLDNA模板2μL，10×PCRBuffer1.5μL，2.5μM的引物各1μL(即單個(gè)引物對(duì)的上、下游引物)，2.5mM的dNTP1.2μL，50mM的Mg2+0.4μL，5μM的M13引物0.8μL，5U/μL的TaqHS酶0.1μL，加ddH20至15μL。7.2.2PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，10個(gè)循環(huán)；95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；95℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，10個(gè)循環(huán)；72℃5min。通過上述PCR擴(kuò)增步驟，分別得到每個(gè)枸杞品種所對(duì)應(yīng)的第1-15引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物。7.3毛細(xì)管凝膠電泳在96孔板中每孔加入分子量?jī)?nèi)標(biāo)和甲酰胺的混合液9μL(其中，分子量?jī)?nèi)標(biāo)和甲酰胺的體積比為0.5：8.5)，單份PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.0μL，95℃變性3min。按上述設(shè)置條件，對(duì)得到的每個(gè)枸杞品種所對(duì)應(yīng)的第1-15引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI3730儀器上進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳，并進(jìn)行熒光檢測(cè)，檢測(cè)得到的原始電泳圖譜，部分電泳圖譜如圖1-44所示，其中：圖1-圖15為用第1-15引物對(duì)分別對(duì)寧杞1號(hào)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行的毛細(xì)管電泳圖。圖16-圖44為第10引物(SF51引物)對(duì)29份枸杞種質(zhì)(不包括寧杞1號(hào))的DNA擴(kuò)增后的毛細(xì)管電泳圖。通過軟件對(duì)每個(gè)枸杞種質(zhì)的電泳圖譜進(jìn)行分析，得到每個(gè)枸杞種質(zhì)的對(duì)應(yīng)第1-15引物對(duì)所擴(kuò)增的擴(kuò)增帶型數(shù)，擴(kuò)增帶型數(shù)包括的信息有所擴(kuò)增的條帶數(shù)量以及相應(yīng)條帶的大小。7.4編碼處理將擴(kuò)增帶型數(shù)進(jìn)行編碼處理，得到每一種枸杞種質(zhì)的DNA的對(duì)應(yīng)第1-15引物對(duì)的第1-15編號(hào)，按預(yù)設(shè)的順序串聯(lián)該第1-15編號(hào)形成字符串。本實(shí)施例的編碼處理方法具體為：將第1-15引物對(duì)中每對(duì)引物對(duì)對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增帶型數(shù)按照升序排列，并按順序標(biāo)號(hào)(也就是編號(hào))，當(dāng)序號(hào)數(shù)小于9時(shí)，用數(shù)字1-9順序表示，當(dāng)序號(hào)數(shù)大于9時(shí)，用英文字母A-Z順序表示。沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的以數(shù)字0表示。本實(shí)施例將第1-15引物對(duì)對(duì)上述的30份枸杞種質(zhì)所擴(kuò)增得到的擴(kuò)增帶型數(shù)進(jìn)行編碼處理的結(jié)果如表2所示。表2.第1-15引物對(duì)分別對(duì)30份枸杞種質(zhì)擴(kuò)增得到的擴(kuò)增帶型數(shù)的編碼處理結(jié)果7.5串聯(lián)編號(hào)得到字符串通過上述編碼處理后根據(jù)每個(gè)枸杞種質(zhì)的對(duì)應(yīng)第1-15引物對(duì)的擴(kuò)增帶型數(shù)，結(jié)合表2中的編碼處理結(jié)果，得到每個(gè)枸杞種質(zhì)的對(duì)應(yīng)第1-15引物對(duì)的擴(kuò)增帶型數(shù)的第1-15編號(hào)(其中，第1編號(hào)為第1引物對(duì)所擴(kuò)增得到的擴(kuò)增帶型數(shù)的編號(hào)，第2編號(hào)為第2引物對(duì)所擴(kuò)增得到的擴(kuò)增帶型數(shù)的編號(hào)，依次類推，第15編號(hào)為第15引物對(duì)所擴(kuò)增得到的擴(kuò)增帶型數(shù)的編號(hào))。串聯(lián)第1-15編號(hào)形成字符串，該字符串即為相應(yīng)枸杞種質(zhì)的以數(shù)字或字母表示的DNA指紋圖譜。本實(shí)施例中串聯(lián)第1-15編號(hào)具體為：按第3編號(hào)、第5編號(hào)、第7編號(hào)、第11編號(hào)、第13編號(hào)、第8編號(hào)、第10編號(hào)、第14編號(hào)、第1編號(hào)、第15編號(hào)、第12編號(hào)、第4編號(hào)、第2編號(hào)、第9編號(hào)、第6編號(hào)的順序進(jìn)行串聯(lián)形成字符串。以寧杞1號(hào)為例對(duì)上述編號(hào)處理進(jìn)行說明，寧杞1號(hào)的DNA用第3引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增后的電泳條帶大小為176(如圖1所示)，根據(jù)表2中對(duì)應(yīng)的編號(hào)可得到第3編號(hào)為1；用第5引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增后的電泳條帶大小為177，根據(jù)表2中對(duì)應(yīng)的編號(hào)可得到第5編號(hào)為7；用第7引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增后的電泳條帶有兩條，分別是177和180，根據(jù)表2中對(duì)應(yīng)的編號(hào)可得到第7編號(hào)為5；以此類似，即可得到寧杞1號(hào)的第1-15編號(hào)，按上述的順序按第3編號(hào)(1)、第5編號(hào)(7)、第7編號(hào)(5)、第11編(6)號(hào)、第13編號(hào)(9)、第8編號(hào)(A)、第10編號(hào)(4)、第14編號(hào)(A)、第1編號(hào)(C)、第15編號(hào)(B)、第12編號(hào)(9)、第4編號(hào)(G)、第2編號(hào)(F)、第9編號(hào)(4)、第6編號(hào)(H)的順序進(jìn)行串聯(lián)形成字符串17569A4ACB9GF4H(也可稱為分子身份證編號(hào))，以表示的DNA指紋圖譜。7.6根據(jù)步驟6.5的串聯(lián)編號(hào)的方法，分別得到30份枸杞種質(zhì)的以數(shù)字或字母即字符串表示的DNA指紋圖譜，結(jié)果如表3所示。表3.本實(shí)施得到的30份枸杞種質(zhì)的以字符串表示的DNA指紋圖譜序號(hào)枸杞種質(zhì)名稱分子身份證編號(hào)(即字符串)1寧杞1號(hào)17569A4ACB9GF4H2寧杞5號(hào)26339748AAECEAD3寧杞7號(hào)26339948BA8CEAE4寧農(nóng)杞9號(hào)1637A74BABDI94I5蒙杞1號(hào)1637A759ABAF86D6寧夏黃果1326227BBD37GKL7寧杞菜1號(hào)1343A564B6FA3388黑果32571A40074GGII9中國(guó)14426713842F54B10北方3383956534H947711云南3258484515HEBE012蔓生428434A31673KF213新疆2639852AB0CDAF14紅枝5546871674CECC415柱筒16549858ABBCHAC16截萼16339848D9ECEAD17CJ61817323681881318HB13839533549918519SC1344951659FFAA620AN128156332CIH8G121W30135397829956D5M22HZ0153639777BA64E9K23ZH0813138071BE418HJ24W27267397489ADJI5G25W1516339791995BDJM26ZH0273638271B542KDA27W131385976342H928528W26564391B793656B929W3716339791995D7JM30白花26349848A9BG72D通過本實(shí)施例提供的構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的方法得到30份枸杞種質(zhì)的DNA指紋圖譜也可稱為SSR指紋。該DNA指紋圖譜結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為枸杞種質(zhì)資源鑒定的重要依據(jù)和參考，或者用于枸杞種質(zhì)資源鑒定、枸杞加工產(chǎn)品的鑒定等領(lǐng)域中。綜上，本實(shí)施例體用構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的方法，利用實(shí)施例2的引物組合，構(gòu)建出了30份枸杞種質(zhì)的以字符串表示的DNA指紋圖譜，所得到的DNA指紋圖譜能夠直觀正確地反應(yīng)出30份枸杞種質(zhì)的DNA指紋圖譜信息，該DNA指紋圖譜同樣可作為枸杞種質(zhì)資源鑒定或分類的參考依據(jù)，或者用于枸杞苗或枸杞加工產(chǎn)品的鑒定中。實(shí)施例8本實(shí)施例提供了構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的方法，其步驟基本同實(shí)施例6，不同之處在于，本實(shí)施例提供的構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的方法還包括：在得到以字符串表示的DNA指紋圖譜后，利用二維碼技術(shù)將字符串形成二維碼圖形，如圖45所示，其為寧杞1號(hào)的以二維碼圖形表示的DNA指紋圖譜。這樣，通過以二維碼圖形表示的DNA指紋圖譜，使得所構(gòu)建的DNA指紋圖譜不僅能正確反應(yīng)30份枸杞種質(zhì)的DNA指紋圖譜信息，還能在枸杞的市場(chǎng)流通、栽培管理等領(lǐng)域得到進(jìn)一步的推廣利用，并且還可以應(yīng)用于可追溯體系建設(shè)和管理。綜上，本發(fā)明首次基于枸杞基因測(cè)序結(jié)果基礎(chǔ)上開發(fā)篩選得到具有多態(tài)性的核心骨干SSR引物，即可用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的第1-15引物對(duì)。且進(jìn)一步地利用SSR分子標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)構(gòu)建出了以字符串或二維碼圖形表示的直觀化的枸杞DNA指紋圖譜，使得采用發(fā)明提供的引物組合或構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜方法在構(gòu)建的過程具有分辨率高、靈敏度高、數(shù)據(jù)分析便捷等特點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率低、靈敏度低、數(shù)據(jù)分析困難等缺點(diǎn)。也為DNA指紋圖譜在枸杞上的應(yīng)用研究提供更多的理論支持，同時(shí)本發(fā)明得到枸杞DNA指紋圖譜也為對(duì)枸杞種質(zhì)資源或枸杞加工產(chǎn)品的鑒定、分類、流通以及管理等領(lǐng)域提供便捷可靠的參考依據(jù)。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞工程技術(shù)研究所<120>一種用于構(gòu)建枸杞DNA指紋圖譜的引物組合以及應(yīng)用和方法<160>30<170>PatentInversion3.5<210>1<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>1tgtaaaacgacggccagtgacacgaaatttaagaaagtaga41<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2cccctaaagtactaaaaggaca22<210>3<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>3tgtaaaacgacggccagtaaccccatttcgagttttgag39<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4agcacaaaactttctgattcttg23<210>5<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>5tgtaaaacgacggccagttccttattgattatgctttggaa41<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6gttccattttacttggccctta22<210>7<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>7tgtaaaacgacggccagtgtgtgtatatattgatgcaactct42<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>8acattatatagtgggatggagg22<210>9<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>9tgtaaaacgacggccagtcagggacagaaacaaactagga40<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10cattcatccttccacaaatcttta24<210>11<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>11tgtaaaacgacggccagtttcagttccctctcagcca37<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>12ttgttcttgcataagaaattgg22<210>13<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>13tgtaaaacgacggccagtcaaagaacaaaagggctagga39<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>14tttgttgttgtatcagatccca22<210>15<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>15tgtaaaacgacggccagttgtggaattacactgggtatgt40<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>16gagaaccgtttcattgatatac22<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>17tgtaaaacgacggccagttatttcacgttgctccagaaag40<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>18atcgccccctgaattaaag19<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>19tgtaaaacgacggccagtcagcgaagaattagaaaaagac40<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>20gcaagtgctaatataacctccat23<210>21<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>21tgtaaaacgacggccagtttggaaccaatgctaatggaag40<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>22gggacatcagttggaaattag21<210>23<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>23tgtaaaacgacggccagttgaaaacaaacaaagaaaagc39<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>24tcaaggggttgttagattct20<210>25<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>25tgtaaaacgacggccagtttccaccattttgctactcaa39<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>26aagagatttttagccgattga21<210>27<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>27tgtaaaacgacggccagtcgggtttctaatggtacctcta40<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>28tgactctacaaatttgaaaaacaa24<210>29<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>29tgtaaaacgacggccagtaaggaaataagcaaacgcatg39<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>30ggacatgacatcatcagtcaa21當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3