本發(fā)明涉及一株產紅青霉菌及其應用，具體涉及一株對多種農作物具有促生長作用的產紅青霉菌，屬于生物
技術領域：
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背景技術：
：植物內生菌(Endophyte)是一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內部的真菌或細菌。但不像病原菌具有明顯的病癥，植物內生菌不表現任何明顯的癥狀，并普遍存在于高等植物中，木本、草本植物，單子葉植物和雙子葉植物內均有內生菌。近幾十年的研究表明，有些植物內生菌的醇提取物具有促進植物生長、提高抗旱、增加肥料的吸收等作用，引起植物學家們的關注。研究表明，每種野生植物至少有幾十種內生菌存在。粗略估計，植物內生菌的種類大約有40萬種之多。從植物進化角度分析，植物的多樣性也必然導致其內生菌的多樣性。所以，這些內生菌極有可能是有價值的化合物的寶庫。目前已成為生物防治中有潛力的微生物農藥、增產菌或作為潛在的生防載體菌而加以利用。近年來，我國肥料生產和用量一直以較快的速度增長，但土壤退化、肥料利用率低及由此造成的資源、能源和人力極大的浪費一直是我國農業(yè)生產面臨的巨大問題。青霉屬(Penicillium)菌種是一類重要的微生物菌種資源，是微生物多樣性的組成部分，其分布范圍廣泛，常分布于土壤、大氣、食物、腐生木材等，與人類生活、研究和生產緊密相關，并為真菌學研究、農業(yè)及生物技術產業(yè)持續(xù)發(fā)展提供菌種資源，具有重要的經濟意義。產紅青霉屬于青霉屬的一種真菌，目前對其研究較少，已報道該種的國家有英國、美國、比利時、中國，基物包括發(fā)霉的哈密瓜、未發(fā)酵的葡萄汁、啤酒瓶蓋等。對于產紅青霉菌應用的研究則更為少見，弗萊明發(fā)現的產青霉素產紅青霉P.rubens是一種細菌培養(yǎng)污染物(Houbrakenetal.2011)。而具有促進作為生長功能的產紅青霉目前尚未見報道。技術實現要素：針對上述現有技術，本發(fā)明的目的是提供一株產紅青霉菌及其應用。為實現上述目的，本發(fā)明采用下述技術方案：根據本發(fā)明的第一方面，提供一株產紅青霉，命名為產紅青霉(Penicilliumrubens)PR1，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，菌種保藏號為CGMCCNO.13189。該菌株是從巴西野生花生樣品中分離得到，菌株在PDA上培養(yǎng)7d，直徑27-29mm，菌落面平坦；質地絨狀或兼輕微絮狀；分生孢子結構大量產生，分生孢子面綠色或灰綠色；菌絲體白色；無滲出液；反面黃綠色或淡黃色；菌核無。孢梗莖36-120×3.0-4.0μm，無色，壁光滑；帚狀枝三輪生，偶有雙輪生和四輪生；瓶梗安瓿形，6.9-9.1×2.7-3.7μm，梗頸短；分生孢子球形、近球形或橢圓形，3.2-4.2×2.7-3.5μm，壁光滑；分生孢子鏈呈現疏松的圓柱形。根據本發(fā)明的第二方面，提供一種植物誘抗劑，其活性成分為上述產紅青霉(Penicilliumrubens)PR1的發(fā)酵后菌絲體的乙醇提取物。本發(fā)明還提供上述植物誘抗劑的制備方法，包括：發(fā)酵上述的產紅青霉(Penicilliumrubens)PR1，將發(fā)酵液離心過濾，得到菌絲體的步驟；以及將菌絲體采用乙醇進行提取的步驟。上述制備方法中，發(fā)酵采用的發(fā)酵培養(yǎng)基的原料組成為：馬鈴薯提取液1000ml、酵母膏1.0g、蛋白胨3.0g、葡萄糖15.0g、瓊脂17.0g。所述馬鈴薯提取液的制備方法為：取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加蒸餾水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000毫升。上述制備方法中，發(fā)酵的條件為：接種量為5-15％(體積百分數)、發(fā)酵培養(yǎng)溫度為20-30℃，培養(yǎng)4-6天；優(yōu)選的，發(fā)酵的條件為：接種量為10％、發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)5天。上述制備方法中，乙醇提取的操作為：將菌絲體干燥、粉碎，加入乙醇冷浸20-30h，然后超聲提取0.5-1.5h；重復提取2-4次，合并濾液，即得。所述乙醇提取的操作為：將菌絲體在50℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸12小時，然后超聲提取2h；重復提取2次，合并濾液。所述乙醇的加入量為菌絲體(干燥后)重量的15-30％；每次提取加入乙醇的量相同。根據本發(fā)明的第三方面，提供上述產紅青霉(Penicilliumrubens)PR1和/或植物誘抗劑在促進農作物生長或者促進農作物增產中的應用。上述應用中，所述農作物為花生、豇豆和蘿卜。本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明系首次從巴西野生花生中分離、純化出一種產紅青霉菌株。該內生菌可與植株呈互利共生關系，植物把光合作用產物、水和礦物質提供給內生菌；同時，內生菌產生次生代謝產物刺激植物生長發(fā)育，提高抗蟲害、抗病菌、抗逆性和宿主對環(huán)境脅迫的抵抗力等。將其次生代謝產物與新型肥料結合開發(fā)新型生物功能型肥料(緩控釋肥、有機肥、水溶肥、氮肥等傳統(tǒng)肥料等)具有功能優(yōu)勢、成本優(yōu)勢、減肥增效優(yōu)勢、節(jié)能環(huán)保優(yōu)勢，符合當前產業(yè)發(fā)展要求，將大幅度提高我國新型肥料水平。(2)本發(fā)明通過對發(fā)酵后的菌絲體進行乙醇提取，能夠有效的對產紅青霉產生的次生代謝產物進行富集，提高了其對農作物的促生長和增產作用。附圖說明圖1：PR1菌株的菌落形態(tài)。圖2：PR1菌株的菌絲形態(tài)和孢子形態(tài)(40×0.65和100×1.4)。圖3：菌株PR1通過ITS序列分析建立的系統(tǒng)發(fā)育樹。具體實施方式下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規(guī)實驗方法，檢測方法等。實施例1：菌株的分離和鑒定1.菌株的分離與篩選：(1)菌株的分離巴西野生花生樣品采集后用自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌，晾干后切成0.5cm小段，置于70-75％乙醇消毒3-5min，沖洗干凈后再用10％巴氏消毒液洗18分鐘，最后用無菌水沖洗4次，晾干表面水分后備用。將上述消毒過的根在無菌條件下接種于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，置于25℃度培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天后，即可見樣品切割過的邊緣長出菌絲，經平板(孟加拉紅培養(yǎng)基)反復分離、純化，最后得到一株菌，編號為PR1；孟加拉紅培養(yǎng)基配方及制作方法如下：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5g，瓊脂20g，1/3000孟加拉紅溶液100mL，蒸餾水1000mL，氯霉素0.1g。上述各成分加入蒸餾水中溶解后，再加孟加拉紅溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培養(yǎng)基中，分裝后，121℃滅菌20min。2.菌株PR1的形態(tài)及生物學特性測定將菌株PR1在室溫，PDA上培養(yǎng)7d，直徑27-29mm，菌落面平坦；質地絨狀或兼輕微絮狀；分生孢子結構大量產生，分生孢子面綠色或灰綠色；菌絲體白色；無滲出液；反面黃綠色或淡黃色；菌核無。孢梗莖36-120×3.0-4.0μm，無色，壁光滑；帚狀枝三輪生，偶有雙輪生和四輪生；瓶梗安瓿形，6.9-9.1×2.7-3.7μm，梗頸短；分生孢子球形、近球形或橢圓形，3.2-4.2×2.7-3.5μm，壁光滑；分生孢子鏈呈現疏松的圓柱形。該菌具有青霉屬的特征，初步判斷為產紅青霉菌(Penicilliumrubens)。該菌的菌落形態(tài)如圖1所示，不同放大倍率下的菌株的菌絲形態(tài)和孢子形態(tài)如圖2所示(左圖放大倍率為40×0.65，右圖放大倍率為100×1.4)。3.菌株PR1的分子生物學鑒定以ITS1和ITS4為引物，對從野生花生根部中分離的真菌PR1菌株進行了擴增，并對擴增產物進行了測序；ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。擴增產物的序列如SEQIDNO.1所示，具體如下：基于blast搜索，選取與研究菌株序列最接近的種或最靠近的進化分支代表菌株的序列進行比對，利用Mega6.0軟件通過ML算法，利用bootstrap1000次建樹結果建立進化樹(如圖3所示)。結果表明PR1真菌與產紅青霉(Penicilliumrubens)的同源相似性達到99％，氨基酸序列的相似性也達到了99％。通過形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定，最終鑒定結果菌株PR1為產紅青霉(Penicilliumrubens)。將篩選分離得到的菌株命名為產紅青霉(Penicilliumrubens)PR1，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，菌種保藏號為CGMCCNO.13189。實施例2：植物誘抗劑的制備具體制備方法如下：1.發(fā)酵培養(yǎng)：將4℃下保存在試管斜面上的實施例1分離保藏的產紅青霉(Penicilliumrubens)PR1的菌種，接到平板PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)6天，用打孔器瓊脂挖塊接種于裝有50mL種子培養(yǎng)液(PDA液體培養(yǎng)基)的250mL三角瓶，于25℃，180r/min下旋轉搖床上培養(yǎng)3天作為種子，以10％量接種入裝有150mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，同樣條件下培養(yǎng)5天，終止發(fā)酵，得種子液。PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml。發(fā)酵培養(yǎng)基配方：馬鈴薯提取液1.0L，酵母膏1.0g，蛋白胨3.0g，葡萄糖15.0g，瓊脂17.0g。馬鈴薯提取液的制備：取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加蒸餾水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000毫升。2.乙醇提取：將發(fā)酵液離心過濾，得菌絲體，將菌絲體在60℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸24小時，然后超聲提取1h；重復提取3次，合并濾液，即得植物誘抗劑。所述乙醇的加入量為菌絲體重量的20％；每次提取加入乙醇的量相同。實施例3：植物誘抗劑在花生促生和增產中的應用1.試驗方法：處理1：拌種(0.1克實施例2制備的植物誘抗劑拌30公斤種子)。處理2：拌種加一次噴霧(0.01克實施例2制備的植物誘抗劑拌30公斤種子，開花中后期0.02克實施例2制備的植物誘抗劑兌15公斤水稀釋噴霧)。處理3：拌種加二次噴霧(0.01克實施例2制備的植物誘抗劑拌30公斤種子。開花中后期0.02克實施例2制備的植物誘抗劑兌15公斤水稀釋噴霧；收獲前1個月第二次噴霧)。每個處理重復3次。露地栽培，株距20厘米，行距為50厘米。每畝基施某品牌專用復合肥50公斤。測產方法：每處理選擇生長比較均勻的壟收獲2米壟長，摘下花生果曬干帶皮稱重和去殼稱重。2.試驗結果：表1：植物誘抗劑對黑花生的增產結果(單位：公斤)處理毛重增產(平均值)粒重增產(平均值)CK0.79/0.57/處理10.87510.8％0.64513.1％處理21.06534.8％0.79539.5％處理30.88512.0％0.6514.0％實驗結果表明，處理2的增產幅度最大，毛重和凈重分別達到34.8％和39.5％，處理1和處理2的增產幅度接近。測產過程可以看出，處理2的花生果和粒都明顯大于其它處理，未成熟果較少，對照成熟較晚，未成熟的水粒比較多。實施例4：植物誘抗劑在豇豆促生和增產中的應用1.試驗方法：使用方法：出苗后10天后0.02克實施例2制備的植物誘抗劑兌30公斤水灌根，每株1000毫升，開花后0.02克實施例2制備的植物誘抗劑兌15公斤水稀釋噴霧。每次收獲后噴霧一次。栽培中期用0.02克實施例2制備的植物誘抗劑兌30公斤水結合滴灌追肥一次。栽培方式：春季溫室栽培。株行距為20×60厘米，每穴2株。每畝基施某品牌專用復合肥50公斤。測產方法：每次收獲稱重，累計最初5次收獲的產量累加作為產量標準。2.試驗結果：前五次收獲比對照增產幅度45％，處理的除產量指標外，各處理結豆莢的數量大小等指標明顯高于對照，后期受架高限制，產量形成受到影響，后期產量沒有計算在內。在生產過程中可以明顯提高豇豆前期的收獲量，有利于農產品的早期產量形成，由于前期蔬菜的價格較高，所以具有雙重的增收效果。實施例5：植物誘抗劑在蘿卜促生和增產中的應用1.試驗方法：處理方法：分2個處理濃度，分別為0.02克實施例2制備的植物誘抗劑和0.01克實施例2制備的植物誘抗劑兌水15公斤噴霧。在出苗放出真葉后用噴淋，以浸濕根部為準，20天后噴一次，封壟后再噴一次。栽培方法：入伏后在露地栽培。株行距為20×30厘米，單株栽培。三次重復。每畝基施富友牌專用復合肥50公斤。測產方法：收獲是拔出蘿卜，除去葉片，稱重蘿卜。2.試驗結果：各處理產量分別為0.02克每壺水處理10.3公斤，0.01克每壺水處理11.7公斤，對照產量為7.5公斤。分別增產37.3％和56％，同時處理的蘿卜品質明顯得到改善，具有水果的甜脆口感，辛辣很弱，可直接鮮食，而對照非常辛辣，不易鮮食。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內，根據本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>泰安市煜達生物科技有限公司<120>一株產紅青霉菌及其應用<130>2016<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>677<212>DNA<213>菌株PR1<400>1ttgatatgcttaagttcagcgggtatccctacctgatccgaggtcaacctggataaaaat60ttgggttgatcggcaagcgccggccgggcctacagagcgggtgacaaagccccatacgct120cgaggaccggacgcggtgccgccgctgcctttcgggcccgtcccccgggatcggaggacg180gggcccaacacacaagccgtgcttgagggcagaaatgacgctcggacaggcatgcccccc240ggaataccagggggcgcaatgtgcgttcaaagactcgatgattcactgaatttgcaattc300acattacgtatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccggaaccaagagatccgttgt360tgaaagttttaaataatttatattttcactcagactacaatcttcagacagagttcgagg420gtgtcttcggcgggcgcgggcccgggggcgtaagccccccggcggccagttaaggcgggc480ccgccgaagcacaaggtaaaataaacacgggtgggaggttggacccagagggccctcact540cggtaatgatccttccgcaggttcacctacggaagccaggggggctccaaaaagcgctgg600actacctgatccgaggtcacctggataaaaatttgggttgatcggcaagcgccggccggg660cctacagagcgggtgac677當前第1頁1 2 3