本發(fā)明涉及一種浮萍轉(zhuǎn)錄因子LmMYB基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)錄因子是轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中RNA聚合酶的輔助因子，若缺少轉(zhuǎn)錄因子，RNA聚合酶無(wú)法催化DNA模板鏈轉(zhuǎn)錄成RNA，則基因無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的加工和翻譯，只有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在相應(yīng)順式元件的核心DNA序列上，基因才能正常表達(dá)，可見轉(zhuǎn)錄因子在植物的各種生命活動(dòng)中有著不可替代的位置。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝、細(xì)胞的形態(tài)和模式建成等生理過(guò)程有關(guān)的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物中普遍存在，同時(shí)也是植物中最大的轉(zhuǎn)錄家族之一，MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物的代謝和調(diào)控中發(fā)揮重要作用。MYB基因家族中只有極少數(shù)成員在調(diào)控某些生理生化過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用，一般起正調(diào)控作用，以MYB類轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)植物逆境過(guò)程為例，MYB基因表達(dá)量越高，其抵抗逆境的能力越強(qiáng)。

現(xiàn)有研究表明MYB基因在農(nóng)作物、鮮花、水果、煙草中都大量存在，如擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)198個(gè)MYB基因，棉花、草莓和番茄等植物中都發(fā)現(xiàn)超過(guò)200個(gè)MYB基因。

大多數(shù)MYB蛋白在N端含有一段氨基酸殘基組成的MYB結(jié)構(gòu)域，根據(jù)這個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征可將MYB轉(zhuǎn)錄因子分為四類：

1R-MYB/MYB-related；R2R3-MYB；3R-MYB；4R-MYB(4個(gè)R1/R2的重復(fù))。MYB轉(zhuǎn)錄因子具有多種生物學(xué)功能，廣泛參與植物根、莖、葉、花的生長(zhǎng)發(fā)育，與此同時(shí)，MYB基因家族對(duì)干旱、鹽漬、冷害等非生物脅迫過(guò)程也有響應(yīng)，此外MYB轉(zhuǎn)錄因子還與某些經(jīng)濟(jì)作物的品質(zhì)好壞密切相關(guān)。

氨氮是指水中以游離氨(NH₃)和銨離子(NH₄⁺)形式存在的氮，是水體中主要的污染物之一，會(huì)造成富營(yíng)養(yǎng)化、水生植物多樣性減少等危害。我國(guó)從“十二五”開始將氨氮納入污染物控制指標(biāo)，畜禽養(yǎng)殖業(yè)是氨氮減排重點(diǎn)之一。畜禽養(yǎng)殖廢水中含有較高濃度的氨氮，目前主要采用厭氧-好氧工藝進(jìn)行脫氮除磷，其中好氧過(guò)程耗能較高。人工濕地、氧化塘等低能耗工藝能夠有效的利用植物和微生物的共同作用達(dá)到良好的脫氮效果，但是過(guò)高的氨氮會(huì)對(duì)植物造成傷害，不利于其正常運(yùn)轉(zhuǎn)。NH₃和NH₄⁺都可以對(duì)植物造成傷害，但是這二者之間的轉(zhuǎn)換受環(huán)境溫度和pH控制，在大多數(shù)的土壤或水體環(huán)境中游離氨所占比例較低，對(duì)植物造成影響的主要是NH₄⁺，因此NH₄⁺毒害也受到更多的關(guān)注。

NH₄⁺毒害會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)農(nóng)業(yè)和其它生態(tài)系統(tǒng)有一定的負(fù)面影響，如一些地區(qū)的糧食減產(chǎn)、森林面積降低、水生植物減少被認(rèn)為與土壤中或水環(huán)境中NH₄⁺的升高密切相關(guān)。尤其是在農(nóng)業(yè)方面，過(guò)度氮肥的使用、不合理的施肥方式以及大氣NH₃/NH₄⁺沉降的加劇等因素都會(huì)使土壤中NH₄⁺濃度增加，NH₄⁺毒害對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的威脅將越來(lái)越明顯。提高作物自身的抗高銨能力有利于減少由NH₄⁺毒害帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。提高水生植物對(duì)高銨的耐受能力有助于更好的利用這些植物凈化廢水。

未見浮萍的MYB基因相關(guān)的報(bào)道，也未見MYB基因與植物抗高銨脅迫相關(guān)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了浮萍Lemna minor L.的MYB基因及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供了浮萍轉(zhuǎn)錄因子LmMYB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供了一種重組載體，它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

優(yōu)選地，所述重組載體是重組pCAMBIA1302質(zhì)粒。

本發(fā)明還提供了一種重組菌，它包括前述重組載體。

優(yōu)選地，所述重組菌是重組根癌農(nóng)桿菌。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述重組根癌農(nóng)桿菌是重組根癌農(nóng)桿菌EHA105。

本發(fā)明還提供了一種浮萍轉(zhuǎn)錄因子LmMYB蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了前述的基因、蛋白、重組載體和/重組菌在提高植物耐高銨能力中的用途。

本發(fā)明還提供了一種提高植物耐高銨脅迫的方法，步驟如下：取前述的基因、重組載體和/重組菌，轉(zhuǎn)入植物的基因組中，即可。

本發(fā)明還提供了一種制備轉(zhuǎn)基因水稻的方法，取水稻，轉(zhuǎn)入前述的基因、重組載體和/重組菌，即可。

本發(fā)明的LmMYB基因是能夠針對(duì)性調(diào)控植物耐高銨能力提高的轉(zhuǎn)錄因子基因；且該抗逆基因來(lái)自植物本身，對(duì)環(huán)境影響較小。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)LmMYB基因轉(zhuǎn)化水稻進(jìn)行該基因的功能研究，獲得效果如下：

1.獲得了對(duì)高銨脅迫有較高耐受性的轉(zhuǎn)基因水稻。

2.LmMYB基因具有抵抗高銨脅迫逆境的功能，為利用該基因在其他植物上的應(yīng)用而提高植物抗逆性提供了理論依據(jù)及利用價(jià)值。

本發(fā)明LmMYB基因能夠提高植物耐高銨脅迫的能力，制備得到的含有LmMYB基因的轉(zhuǎn)基因水稻在高銨環(huán)境下生長(zhǎng)良好，可以克服由于高銨污染導(dǎo)致的農(nóng)作物減產(chǎn)等等問(wèn)題，應(yīng)用前景良好。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中浮萍葉狀體總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中，M泳道：分子量標(biāo)記(AL2000 DNAMarker，購(gòu)自艾德萊公司)，1泳道：浮萍葉狀體總RNA。

圖2為實(shí)施例1中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)使用的LmMYB基因中間片段序列。

圖3為實(shí)施例1中3'Race擴(kuò)增LmMYB基因的下游片段電泳圖，圖中，M泳道：分子量標(biāo)記(AL2000 DNAMarker)，1泳道：LmMYB下游片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

圖4為實(shí)施例1中5'Race擴(kuò)增LmMYB基因的上游片段電泳圖，圖中，M泳道：分子量標(biāo)記(AL2000 DNAMarker)，1泳道：LmMYB上游片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

圖5為實(shí)施例1中LmMYB基因ORF的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖，圖中，M泳道：分子量標(biāo)記(AL2000 DNAMarker)，1泳道：LmMYB基因ORF的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

圖6為L(zhǎng)mMYB與水稻、玉米等植物MYB家族轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列同源性比對(duì)。

圖7為L(zhǎng)mMYB與水稻、玉米等其他植物MYB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列比對(duì)后所作進(jìn)化樹。

圖8為L(zhǎng)mMYB基因在不同濃度銨(NH₄Cl)處理?xiàng)l件下的誘導(dǎo)表達(dá)譜變化情況。

圖9為PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果。

圖10為RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。

圖11為轉(zhuǎn)浮萍LmMYB基因水稻材料(B、D)與對(duì)照(A、C)分別在84mg/L(A、B)和840mg/L(C、D)的NH₄⁺-N的Hoagland培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)情況。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如Sambrook等著的分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或按照制造廠商所建議的條件及實(shí)驗(yàn)步驟。

下述實(shí)施例中，所用浮萍為實(shí)驗(yàn)室從廢水中獲得的一株耐高銨浮萍，浮萍為無(wú)性繁殖，所有材料均來(lái)自同一個(gè)克隆，長(zhǎng)期培養(yǎng)在Hoagland培養(yǎng)液中。培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為23±1℃，光周期12/12h。

實(shí)施例1：浮萍LmMYB基因的分子克隆

1、浮萍葉片總RNA的提取

浮萍葉片總RNA的提取使用Plant RNeasy Kit(Qiagen)，具體步驟如下：

1)取浮萍葉片≤0.1g，液氮充分研磨，加入450μl RLC(預(yù)先加入β-巰基乙醇)，劇烈振蕩；

2)將液體移入紫色濾柱中，置于2ml收集管，室溫，14,000rpm離心2min，濾液入1.5ml EP管，小心勿吸入沉淀；

3)加入相當(dāng)于濾液1/2體積的無(wú)水乙醇，抽打混勻；

4)將樣品，包括沉淀移入粉色濾柱，室溫，10,000rpm離心15s，棄濾液；

5)加入700μl RW1buffer，室溫，10,000rpm離心15s，清洗過(guò)柱；

6)加入500μl RPE，室溫，10,000rpm離心15s，清洗過(guò)柱，重復(fù)該操作一次；

7)室溫，14,000rpm離心1min，棄濾液；

8)將濾柱放入1.5ml收集管中，加入30～50μl RNase-free水，室溫，10,000rpm離心1min即得浮萍葉片總RNA。

其瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。

2、浮萍LmMYB基因3'端部分片段和5'端部分片段克隆的獲得

2.1Reverse Transcriptase M-MLV合成cDNA第一鏈

按照反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(TaKaRa)的操作說(shuō)明進(jìn)行，以步驟1所得浮萍葉狀體總RNA為模板，Oligo(dT)₁₈為引物。

在RNase-free的0.2ml PCR管中加入浮萍葉狀體總RNA3μl(約500ng)，Oligo(dT)₁₈(50μM)1μl，用RNase-free ddH₂O將體積補(bǔ)充至6μl?；靹蚝?，70℃保溫10min后迅速在冰上急冷2min以上，然后短暫離心使管中溶液集于EP管底部。在冰上依次加入以下試劑：5×M-MLV Buffer 2μl；dNTP(10μM)0.5μl；RNase Inhibitor 0.3μl；RTase M-MLV 0.5μl；RNase-free ddH₂O 0.7μl?；旌暇鶆蚝笤俅畏湃隤CR儀42℃反應(yīng)1h，70℃反應(yīng)10min，存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

引物Oligo(dT)₁₈序列為：

5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)₁₈-3′

2.2浮萍LmMYB基因3'端部分片段克隆的獲得

本研究以課題組前期實(shí)驗(yàn)獲得的浮萍高銨脅迫處理轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，用獲得的LmMYB部分序列(圖2)為基礎(chǔ)，分別設(shè)計(jì)3’和5’RACE引物。利用正向引物L(fēng)mMYB3-1和AP進(jìn)行3′-RACE PCR擴(kuò)增，第一輪擴(kuò)增反應(yīng)如下：

PCR反應(yīng)體系配比表(20μL)

PCR循環(huán)系統(tǒng)

第二輪PCR將所得到的第一輪PCR產(chǎn)物用ddH₂O稀釋50倍(0.4ul一擴(kuò)PCR產(chǎn)物+19.6ulddH₂O)為模板，以LmMYB 3-2和AP₁為引物進(jìn)行PCR。第二輪PCR如下：

PCR反應(yīng)體系配比表(50μl)

PCR循環(huán)系統(tǒng)

將獲得的第二次PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)凝膠成像儀篩選目的DNA條帶，在紫外割膠儀下割下目的條帶，用天跟公司的DNA試劑盒進(jìn)行膠回收，回收后DNA片段連接pEASY-T1載體(TransGen Biotech)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，挑選白色菌落進(jìn)行菌落PCR，菌落經(jīng)PCR驗(yàn)證后選擇陽(yáng)性克隆測(cè)序分析，挑取陽(yáng)性菌落送往北京六合華大基因有限公司測(cè)序，所得序列長(zhǎng)度為550bp(圖3)。

2.3、浮萍LmMYB基因5'端部分片段克隆的獲得

5′-RACE采用TaKaRa公司Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)法進(jìn)行：

1)首鏈cDNA的合成，將10μl的浮萍葉狀體RNA與0.5μl的引物L(fēng)mMYB5-RT(LmMYB5-RT：TCTCGTTGTCTGTTCTACCC)和1μl的RNase inhibitor混合均勻，70℃放置10min后冰浴2min，短暫離心；隨后加入5μl的5×RT Buffer，1.25μl的dNTP Mixture(各10mmol/L)和2.25μl的DTT(100mmol/L)，加去RNase水至總體積24μl，混勻后42℃放置1min，再加入1μl的AMV Reverse Transcriptase XL，55℃下反應(yīng)2h，再70℃處理15min后，短暫離心。

2)RNA的降解和cDNA的純化，將前一步得到的25μl cDNA和1μl的RNase混合，37℃下放置30min；隨后用天根公司的DNA回收柱進(jìn)行純化cDNA。

3)cDNA末端加尾反應(yīng)體系如下：5μl 5×TDT Buffer，15μl cDNA，2.5μl0.1％BSA，0.5μl dATP(100mmol/L)，加入ddH₂O至總體積24μl。將上述反應(yīng)液94℃處理2～3min后冰浴1min，加入1μl TdT，37℃放置12h，然后65℃處理10min，冰上冷卻后短暫離心。

4)以上一步獲得的反應(yīng)液為模板，以LmMYB5-1(LmMYB5-1:GATAGCGGACCATTTGTTGC)和AP(Oligo dT-3sites Adaptor Primer)為引物，用ExTaq酶PCR，反應(yīng)中退火溫度為50℃，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物電泳觀察結(jié)果。將所得產(chǎn)物用ddH₂O稀釋50倍為模板，再以

LmMYB5-2(LmMYB5-2:GCCCTTTTTTCAAGCCCG)和AP1為引物進(jìn)行第二輪PCR。所得產(chǎn)物經(jīng)回收后克隆到pEASY-T1載體上，轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞。菌落經(jīng)PCR產(chǎn)物電泳觀察結(jié)果驗(yàn)證后，挑取陽(yáng)性菌落送往北京六合華大基因有限公司測(cè)序，所得序列長(zhǎng)度為490bp(圖4)。并將所得序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)分析。

3、浮萍LmMYB基因開放閱讀框(ORF)的獲得

根據(jù)已獲得的中間片段、3'片段和5'片段拼接出LmMYB基因全長(zhǎng)cDNA，據(jù)此設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF的特異引物L(fēng)mMYB1和LmMYB2，以浮萍葉狀體的cDNA為模板，于冰上在一個(gè)0.2ml的EP管中加入以下組分：

引物序列如下：

LmMYB 1：5′-ATGGGGAGGAGTCCCTGCTG-3′

LmMYB 2：5′-TTAGAATCGTTGATTGGAGACGGAG-3′循環(huán)條件為：95℃3min，35個(gè)循環(huán)(94℃30s、62℃30s、72℃1min)，72℃10min。

經(jīng)測(cè)序得到642bp的ORF全長(zhǎng)(圖5)，其序列(SEQ ID NO：1)：

ATGGGGAGGAGTCCCTGCTGCGAGAACGCGGGCTTGAAAAAAGGGCAGTGGACGGCGCAAGAGGACCAGATACTCGTCTCCTATATTCGCCAATTCGGCCACGCCAACTGGCGCGCTCTCCCCAAGCTCGCCGGCCTTGCGAGATGCGGCAAGAGCTGCAGGCTTCGGTGGATGAACTATCTCCGACCGGATATCAAGCGGGGAAACTTCTCCCCAGAGGAGGAGGACGCCATCCTCAGGCTTCACGCGTCGCTCGGCAACAAATGGTCCGCTATCGCTGCCGAGCTCCCGGGTAGAACAGACAACGAGATCAAGAACGTGTGGCACACGCACTTGAAGAAGAGGGCCAGCCTCCGCAAGATCGATCGTGGCGAACCGTCTTGCGGCGACCTATCTTCGTCTTCTTCTTCTTGTGCGACCGAAGATGGGGCTCAGTTGCTCCCCGAGCTTCTGGAGATGGATGACGAGGAATGGTGGTCGGAGGCTCTCTTCCAGGAGACTTGTACGTCGAATTTGGGATCATCCAGGGCTTCGTCCGAAGGGGGGACGGACGCGTCGTCA GAGGAAGGCGACGACAATTTCTGGGTGAGGCTGCTGATGGCGACCGAGTTTCCCGACTCCGTCTCCAATCAACGATTCTAA。

其編碼的蛋白的氨基酸序列為(SEQ ID NO：2)：

MGRSPCCENAGLKKGQWTAQEDQILVSYIRQFGHANWRALPKLAGLARCGKSCRLRWMNYLRPDIKRGNFSPEEEDAILRLHASLGNKWSAIAAELPGRTDNEIKNVWHTHLKKRASLRKIDRGEPSCGDLSSSSSSCATEDGAQLLPELLEMDDEEWWSEALFQETCTSNLGSSRASSEGGTDASSEEGDDNFWVRLLMATEFPDSVSNQRF

實(shí)施例2：浮萍LmMYB基因的分析

1、生物信息學(xué)分析

使用軟件DNAMAN、Primer Premier5.0及NCBI上的Blast程序?qū)mMYB序列(序列表中SEQ ID NO：1)和LmMYB基因編碼的多肽的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO：2)進(jìn)行同源性分析和保守區(qū)域分析。

2、熒光定量PCR檢測(cè)LmMYB基因表達(dá)模式

2.1熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)克隆出的LmMYB cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)了QP1和QP2作為檢測(cè)LmMYB基因表達(dá)水平的熒光定量PCR引物，選取18S作為內(nèi)參基因，引物為18SP1和18SP2。引物序列如下：

QP1：5′-TGGATGAACTATCTCCGACCG-3′

QP2：5′-CAGCGATAGCGGACCATTTG-3′

18SP1：5′-AGAGGAACAGTCGGGGGCATT-3′

18SP2：5′-CGGCATCGTTTACGGTTGAGA-3′

2.2準(zhǔn)備不同濃度銨脅迫條件下基因表達(dá)模式分析所用材料

NH₄Cl脅迫處理：將浮萍洗干凈后，以Hoagland培養(yǎng)液(84mg L-1 NO₃^--N)為對(duì)照，設(shè)84和840mg L^-1 2個(gè)高銨濃度處理，處理7天，分別在0d、2d、4d和7d取葉狀體。

2.3RT

按照實(shí)施例1的浮萍葉狀體總RNA的提取方法，從2.2不同濃度銨脅迫條件下的浮萍葉狀體中分別提取它們的總RNA，所得總RNA使用BIO-RAD公司的iScript^TM cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用硅化槍頭在0.2ml的RNase-free硅化EP管中加入以下組分：

在PCR儀上按以下程序進(jìn)行反應(yīng)：25℃5min，42℃30min，85℃5min。所得cDNA用Nuclease-free water稀釋10倍，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4熒光定量PCR

熒光定量PCR所用試劑盒為BIO-RAD公司的SsoFast^TMSuperemix，PCR反應(yīng)在IQ5PCR儀(BIO-RAD公司)上進(jìn)行，用硅化槍頭在0.2ml的硅化EP管中加入以下組分：

反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性2min后，進(jìn)入95℃10s，60℃1min的45個(gè)循環(huán)，最后從65℃到95℃進(jìn)行溶解曲線分析，去除引物二聚體和其他非特異性擴(kuò)增。每個(gè)樣品均重復(fù)三次以避免加樣誤差，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用iQ5-Cycler軟件進(jìn)行分析，分析方法為ΔΔCt法。

3、結(jié)果

3.1同源性分析

以序列表中SEQ ID NO：1所述LmMYB基因序列編碼的多肽的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO：2)為詢問(wèn)序列，在NCBI上進(jìn)行Blastp，發(fā)現(xiàn)其與水稻(Oryza sativa，CAA74603.1)和玉米(Zea mays，XP_008669188.1)的MYB家族轉(zhuǎn)錄因子基因同源性較高，均為80％。隨后分別用DNAMAN軟件和Mega4.0軟件對(duì)NCBI公布的高等植物MYB家族轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化樹繪制，結(jié)果與NCBI Blastp相同，由圖6和圖7看出，與LmMYB親緣關(guān)系最近的是水稻，其次是玉米和大麥。

3.2保守區(qū)域分析

通過(guò)同源性比對(duì)，如圖6所示，本發(fā)明所述LmMYB基因編碼的氨基酸序列包含2個(gè)MYB家族共有的保守區(qū)域，即MYB DNA binding site.

3.3不同濃度銨(NH₄Cl)脅迫下基因表達(dá)模式分析

目前對(duì)于MYB蛋白功能研究的比較深入的是擬南芥，其家族不同成員可被NaCl、干旱及冷等其他非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，但未有報(bào)道MYB蛋白可被銨脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，為推測(cè)LmMYB蛋白的生物功能，本發(fā)明使用不同濃度銨(NH₄Cl)對(duì)浮萍進(jìn)行脅迫處理，如圖8所示，本發(fā)明所述LmMYB基因的表達(dá)受到銨脅迫所誘導(dǎo)。

在84mg/L的銨條件下LmMYB基因的表達(dá)量是同等硝態(tài)氮濃度下的7倍，在840mg/L的銨條件下該基因的表達(dá)量增加到15倍左右。

綜合上述LmMYB基因的各類分析，初步推測(cè)LmMYB基因可能參與浮萍抗高銨的生物應(yīng)答活動(dòng)當(dāng)中。故構(gòu)建真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型水稻植株，進(jìn)一步檢驗(yàn)其功能。

實(shí)施例3：真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能驗(yàn)證

1、材料

1.1植物材料

水稻品種粳稻種子由武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司所提供。種子于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，28℃光照16h，黑暗8h。

1.2菌株

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α:購(gòu)自TIANGEN公司；

農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105：購(gòu)自北京全式金公司。

1.3質(zhì)粒

pEASY–T1：是一種高效克隆PCR產(chǎn)物(TA cloning)的專用載體，購(gòu)自TransGen Biotech；

植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1302：含有潮霉素抗性基因Hyg、CaMV35S啟動(dòng)子，由農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4培養(yǎng)基和溶液

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 5g/L。LB固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入12.5g/L瓊脂粉。

YEB液體培養(yǎng)基：牛肉浸膏5g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L。YEB固體培養(yǎng)基：在液體YEB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加15g/L的瓊脂粉。

基本培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基，愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代，轉(zhuǎn)化與篩選及分化與生根培養(yǎng)基如下(所有培養(yǎng)基的PH均用KOH來(lái)調(diào)節(jié))：

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：NB+2,4-D 2mg/L；PH＝5.8-6.0

繼代培養(yǎng)基：NB+2,4-D 2mg/L+Vc 40mg/L；PH＝5.8-6.0

預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：NB+2,4-D 2mg/L；PH＝5.8-6.0

菌體懸浮培養(yǎng)基：AAM+AS 100μmol/L；PH＝5.2

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：NB+2,4-D 2mg/L+AS 100μmol/L；PH＝5.8-6.0

篩選培養(yǎng)基一：NB+2,4-D 2mg/L+Ti 100mg/L+Hyg 30mg/L；PH＝5.8-6.0

篩選培養(yǎng)基二：NB+2,4-D 2mg/L+Ti 100mg/L+Hyg 50mg/L；PH＝5.8-6.0

分化培養(yǎng)基：NB+KT 10mg/L+NAA 0.4mg/L；PH＝5.8-6.0

生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA 0.1mg/L；PH＝5.8-6.0

上述培養(yǎng)基和溶液均在121℃高壓滅菌20min后備用，抗生素需待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時(shí)加入。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1LmMYB基因ORF全長(zhǎng)的獲得

經(jīng)測(cè)序分析得知，LmMYB基因的ORF序列中沒(méi)有BamH I和Hind III的酶切位點(diǎn)，因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了構(gòu)建真核重組質(zhì)粒的引物如下(粗體字為保護(hù)堿基，斜體字為酶切位點(diǎn))：

BamH-F1：5′-ATGGGGAGGAGTCCCTGCTG-3'

Hind-R1：5′-GAATCGTTGATTGGAGACGGAG-3'

按實(shí)施例1中的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行RT-PCR，循環(huán)條件為：95℃3min，35個(gè)循環(huán)(94℃30s、62℃30s、72℃1min)，72℃10min。然后進(jìn)行膠回收、連接pEASY–T1載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌后測(cè)序。

本發(fā)明LmMYB基因ORF全長(zhǎng)也可以按照SEQ ID NO：1所示序列直接合成。

2.2pEASY-LmMYB質(zhì)粒提取

選取測(cè)序成功的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit I(Omega)，得到質(zhì)粒pEASY-LmMYB。所有操作均在常溫下進(jìn)行，具體步驟如下：

1)取菌液1.5～5ml，10,000rpm離心1min，棄上清；

2)向沉淀中加250μl Solution I/RNase A，振蕩懸菌；

3)加250μl Solution II，輕擺幾次，待菌液澄清后放置2min；

4)加350μl Solution III，上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次至白色絮狀物出現(xiàn)；

5)于13,000rpm，離心10min，取上清或靜置待用時(shí)取上清；

6)將Hibind DNA結(jié)合柱置于收集管，加200μl Buffer GPS，室溫放置3～5min；

7)于12,000rpm，離心2min，棄濾液；

8)取步驟5)的上清于Hibind DNA結(jié)合柱中，13,000rpm離心1min，棄濾液；

9)加500μl Buffer HB，10,000rpm，離心1min，棄濾液；

10)加700μl DNA Wash Buffer(含無(wú)水乙醇)，10,000rpm離心1min，棄濾液；

11)重復(fù)步驟10)一次；

12)空柱，13,000rpm，離心2min，棄濾液，室溫放置3～5min，揮干乙醇；

13)將Hibind DNA結(jié)合柱置于新離心管上，取30～50μl無(wú)菌水或Elution Buffer懸空滴加入結(jié)合柱中；

14)室溫放置1～2min，13,000rpm，離心2min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pCAMBIA1302-LmMYB

構(gòu)建方法，操作如下：

將pEASY-LmMYB和pCAMBIA1302分別以BamH I、Hind III(購(gòu)自TaKaRa)進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下：

輕輕混勻，37℃水浴12～16h后，跑凝膠電泳分別回收帶酶切位點(diǎn)的LmMYB基因片段和pCAMBIA1302載體酶切片段。再用T4連接酶(購(gòu)自TaKaRa)對(duì)上述兩種雙酶切的膠回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下：

輕輕混勻后，16℃溫育12h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選取測(cè)序正確的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒pCAMBIA1302-LmMYB。

2.4農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備

1)從YEB固體培養(yǎng)基上挑取農(nóng)桿菌EHA105的單菌落，接種到10ml YEB液體培養(yǎng)基(含100μg/ml利福平)中，28℃，200rpm搖菌過(guò)夜；

2)吸取1ml菌液，加至50ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm搖菌至OD₆₀₀為0.5左右。

3)4℃，5,000rpm，離心5min，棄上清；

4)菌體用10ml預(yù)冷的20mM CaCl₂重懸，冰浴30min；

5)4℃，5,000rpm，離心5min，棄上清；

6)菌體用約1ml預(yù)冷的20mM CaCl₂重懸，分裝后于-70℃保存。

2.5農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

1)從超低溫冰箱中取出農(nóng)桿菌感受態(tài)，冰浴凍融；

2)將10μl本實(shí)施例2.3所構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒pCAMBIA1302-LmMYB加入農(nóng)桿菌感受態(tài)，輕輕混勻，冰浴30min；

3)于37℃水浴5min，迅速至冰上放置3～5min；

4)在無(wú)菌條件下加入800μl液體YEB培養(yǎng)基，于28℃，175rpm搖菌3～6h；

5)室溫下，4,000rpm離心2min，棄上清；

6)菌體用約80μl液體YEB培養(yǎng)基重懸后涂布平板，于28℃培養(yǎng)兩天；7)挑取單菌落，用LmMYB全長(zhǎng)特異引物L(fēng)mMYB 1和LmMYB 2(MYB1302-F:CGCggatccATGGGGAGGAGTCCCTGC；MYB1302-R:CCCaagcttGAATCGTTGATTGGAGACGG)進(jìn)行菌落PCR(PCR反應(yīng)條件為：94℃5min，35個(gè)循環(huán)(94℃30s、60℃30s、72℃30s)，72℃5min)，選取PCR成功的培養(yǎng)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6農(nóng)桿菌侵染水稻

(1)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)

選取自然分散，結(jié)構(gòu)致密，顏色鮮黃且直徑約為2-3mm的胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)接至預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱28℃暗培養(yǎng)3-5d。

(2)農(nóng)桿菌的處理與轉(zhuǎn)化

在YEB固體培養(yǎng)基(Kan 50mg/L，Rif 50mg/L)劃線，然后在28℃暗培養(yǎng)兩天后，將農(nóng)桿菌放置4℃冰箱中保存，侵染前兩天在固體YEB培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)。

農(nóng)桿菌在固體YEB培養(yǎng)基上28℃暗培養(yǎng)2d后，用5-10ml AAM培養(yǎng)基(100μmol/L AS)將農(nóng)桿菌洗脫，懸浮于100ml AAM培養(yǎng)基(100μmol/L AS)中，振蕩調(diào)整菌液濃度至OD_600nm＝0.1-1.0，形成懸浮液，28℃靜置1h。將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)至滅菌的50ml培養(yǎng)瓶中，加入上述處理的農(nóng)桿菌懸浮液，輕微搖動(dòng)后，靜置30min，倒掉菌液，然后將愈傷于無(wú)菌濾紙上晾干并轉(zhuǎn)接于共培養(yǎng)基中，28℃中暗培養(yǎng)3d。

(3)洗脫農(nóng)桿菌

暗培養(yǎng)3d后，挑取愈傷組織接于滅菌的50ml廣口培養(yǎng)瓶中，用滅菌的雙蒸餾水沖洗，直至水中不見絲狀菌體，最后一次沖洗用含100mg/L Ti的無(wú)菌水靜置1h，然后倒掉水，將愈傷組織置于無(wú)菌濾紙上在操作臺(tái)中吹干，然后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基一上進(jìn)行篩選。

(4)抗性愈傷組織的篩選

每?jī)芍軐⒂鷤{(diào)換至新的篩選培養(yǎng)基上，約需三周即可見抗性愈傷組織從褐化干癟的愈傷組織中長(zhǎng)出。將抗性愈傷轉(zhuǎn)接于篩選培養(yǎng)基中，10d左右觀察抗性愈傷組織的色澤，顏色鮮黃，結(jié)構(gòu)致密的抗性愈傷組織保留，并轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基二中，顏色暗淡的愈傷則淘汰掉。

抗性愈傷轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基2周后開始出現(xiàn)綠點(diǎn)，3周后可長(zhǎng)出幼芽，并伴隨根也長(zhǎng)出。待幼苗長(zhǎng)至2-3cm時(shí)轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，每試管中1個(gè)克隆。幼苗長(zhǎng)至10cm左右且根系生長(zhǎng)旺盛時(shí)開始煉苗，7-10d后，移出試管，洗凈根上的培養(yǎng)基，然后移至大田栽種。

2.7轉(zhuǎn)基因水稻的種植管理

轉(zhuǎn)基因水稻當(dāng)代(T0代)植株隨批及時(shí)種植。T0代自交種子(T1代)于2015年10月播種于海南，11月插秧，插植規(guī)格為20cm×20cm，單本植，按豐產(chǎn)田進(jìn)行管理，力求均勻一致，及時(shí)防治病蟲和其它危害。

2.8轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定

2.8.1PCR檢測(cè)基因整合情況

1)水稻葉片DNA模板的制備

CTAB法制備水稻基因組PCR模板

(a)取約0.1g的水稻葉片在液態(tài)中磨成粉末，將適量的粉末材料轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中。

(b)加入600μl預(yù)熱(95℃)的1.5×CTAB緩沖液，然后65℃溫浴45min。

(c)取出EP管，冷卻后加入600μl氯仿:異戊醇(24:1)混合均勻，然后10,000rpm離心10min，取出后吸取上清液到另一新的EP管中。

(d)加入2/3體積的異丙醇混合均勻，冰浴至DNA絲狀物出現(xiàn)。

(e)稍微離心沉淀DNA，倒掉上清液。

(f)加入600μl 75％乙醇洗滌，放置30min。

(g)倒掉上清液，室溫下吹干DNA。

(h)加入100μl TE溶解DNA。

2)PCR檢測(cè)

以上述水稻葉片DNA(野生和轉(zhuǎn)基因)為模板、LmMYB全長(zhǎng)的特異引物L(fēng)mMYB1和LmMYB2進(jìn)行PCR，循環(huán)條件為：95℃3min，35個(gè)循環(huán)(94℃30s、62℃30s、72℃1min)，72℃10min。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.8.2RT-PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況

按實(shí)施例1方法提取轉(zhuǎn)基因水稻的總RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用LmMYB全長(zhǎng)的特異引物

LmMYB1和LmMYB2進(jìn)行PCR，該反應(yīng)以水稻的Actin rRNA為參考基因，引物序列如下：

OsActin_f:5'-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3'

OsActin_r:5'-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3'

循環(huán)條件為：95℃3min，35個(gè)循環(huán)(94℃30s、62℃30s、72℃1min)，72℃10min。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.8.3轉(zhuǎn)基因水稻種子的篩選

1)用50μg/ml的Hyg(潮霉素)水溶液徹底浸水濾紙，至于培養(yǎng)皿中，將收獲的T₀代種子均勻撒在濾紙上，28度培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)兩天后，于28度光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每?jī)商煅a(bǔ)一次Hyg水；

2)一周后，將萌發(fā)的Hyg抗性水稻幼苗移栽至花盆中，于光照培養(yǎng)箱生長(zhǎng)為T₁代植株，經(jīng)PCR驗(yàn)證成功的植株分別收獲水稻T₂代種子并做好記錄；

3)將鑒定成功的水稻T₂代種子置于花盆中繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.9轉(zhuǎn)基因水稻的抗高銨脅迫能力驗(yàn)證

以Hoagland培養(yǎng)液(84mg/L NO₃^--N)為對(duì)照，設(shè)84和840mg L^-1 2個(gè)高銨濃度(NH₄Cl)處理，將經(jīng)過(guò)潮霉素篩選和PCR鑒定的陽(yáng)性植株轉(zhuǎn)入對(duì)照和處理中，以沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的水稻苗為對(duì)照，10d后測(cè)定植株高度、根長(zhǎng)等指標(biāo)。

3、結(jié)果

3.1轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

3.1.1PCR檢測(cè)

分別提取野生型水稻和轉(zhuǎn)LmMYB基因植株葉片的DNA，用LmMYB基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因水稻葉片擴(kuò)增出642bp的特異片段(如圖9)，而野生型對(duì)照水稻葉片沒(méi)有擴(kuò)增出該片段，因此判定LmMYB基因已整合入水稻的基因組DNA中。

3.1.2RT-PCR檢測(cè)

為研究LmMYB基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)情況，對(duì)鑒定出的轉(zhuǎn)基因水稻葉片在mRNA水平上進(jìn)行了檢測(cè)。分別以轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻葉片cDNA為模板，以LmMYB基因的特異引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，以水稻Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因(如圖10)。結(jié)果表明3棵陽(yáng)性株全部都可擴(kuò)增到目的片段，野生型水稻中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明整合到轉(zhuǎn)基因水稻基因組中的LmMYB基因可成功轉(zhuǎn)錄。

3.1.3潮霉素抗性篩選水稻種子

T1代陽(yáng)性種子的比率為75.3％，T2代陽(yáng)性種子的比率為80.2％.

3.2水稻轉(zhuǎn)基因植物的結(jié)果及分析

如圖11所示轉(zhuǎn)LmMYB基因水稻材料(B、D)與對(duì)照(A、C)分別在84mg/L(A、B)和840mg/L(C、D)的NH₄⁺-N的Hoagland培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)情況,具體的數(shù)據(jù)如下表所示：

如上表和圖11所示，在正常條件下，對(duì)照組與本發(fā)明含有LmMYB基因的轉(zhuǎn)基因水稻的生長(zhǎng)類似，在高銨脅迫下，對(duì)照組生長(zhǎng)不佳，而含有本發(fā)明LmMYB基因的轉(zhuǎn)基因水稻則仍然生長(zhǎng)良好，說(shuō)明轉(zhuǎn)入本發(fā)明LmMYB基因可以有效對(duì)抗高銨脅迫，并且三株轉(zhuǎn)基因植物的抗高銨脅迫能力均顯著提升，說(shuō)明含有本發(fā)明LmMYB基因的轉(zhuǎn)基因植物穩(wěn)定性較好。

綜上，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了浮萍轉(zhuǎn)錄因子LmMYB基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，確定了其可以調(diào)解植物耐高銨脅迫的能力，可以通過(guò)轉(zhuǎn)入該基因來(lái)增加植物耐高銨脅迫的能力，對(duì)生長(zhǎng)受到高銨脅迫的植物有重要意義，具有良好的應(yīng)用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所

<120> 浮萍轉(zhuǎn)錄因子LmMYB基因及其應(yīng)用

<130> GY181-16P1567

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 642

<212> DNA

<213> 本發(fā)明LmMYB ORF全長(zhǎng)

<400> 1

atggggagga gtccctgctg cgagaacgcg ggcttgaaaa aagggcagtg gacggcgcaa 60

gaggaccaga tactcgtctc ctatattcgc caattcggcc acgccaactg gcgcgctctc 120

cccaagctcg ccggccttgc gagatgcggc aagagctgca ggcttcggtg gatgaactat 180

ctccgaccgg atatcaagcg gggaaacttc tccccagagg aggaggacgc catcctcagg 240

cttcacgcgt cgctcggcaa caaatggtcc gctatcgctg ccgagctccc gggtagaaca 300

gacaacgaga tcaagaacgt gtggcacacg cacttgaaga agagggccag cctccgcaag 360

atcgatcgtg gcgaaccgtc ttgcggcgac ctatcttcgt cttcttcttc ttgtgcgacc 420

gaagatgggg ctcagttgct ccccgagctt ctggagatgg atgacgagga atggtggtcg 480

gaggctctct tccaggagac ttgtacgtcg aatttgggat catccagggc ttcgtccgaa 540

ggggggacgg acgcgtcgtc agaggaaggc gacgacaatt tctgggtgag gctgctgatg 600

gcgaccgagt ttcccgactc cgtctccaat caacgattct aa 642

<210> 2

<211> 213

<212> PRT

<213> 本發(fā)明LmMYB編碼的蛋白的氨基酸序列

<400> 2

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Asn Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Ala Gln Glu Asp Gln Ile Leu Val Ser Tyr Ile Arg Gln Phe

20 25 30

Gly His Ala Asn Trp Arg Ala Leu Pro Lys Leu Ala Gly Leu Ala Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Asn Phe Ser Pro Glu Glu Glu Asp Ala Ile Leu Arg

65 70 75 80

Leu His Ala Ser Leu Gly Asn Lys Trp Ser Ala Ile Ala Ala Glu Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Val Trp His Thr His Leu

100 105 110

Lys Lys Arg Ala Ser Leu Arg Lys Ile Asp Arg Gly Glu Pro Ser Cys

115 120 125

Gly Asp Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Ala Thr Glu Asp Gly Ala

130 135 140

Gln Leu Leu Pro Glu Leu Leu Glu Met Asp Asp Glu Glu Trp Trp Ser

145 150 155 160

Glu Ala Leu Phe Gln Glu Thr Cys Thr Ser Asn Leu Gly Ser Ser Arg

165 170 175

Ala Ser Ser Glu Gly Gly Thr Asp Ala Ser Ser Glu Glu Gly Asp Asp

180 185 190

Asn Phe Trp Val Arg Leu Leu Met Ala Thr Glu Phe Pro Asp Ser Val

195 200 205

Ser Asn Gln Arg Phe

210

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物Oligo(dT)18序列

<400> 3

gctgtcaacg atacgctacg taacggcatg acagtgtttt tttttttttt tttt 54

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> LmMYB5-RT(LmMYB5-RT

<400> 4

tctcgttgtc tgttctaccc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> LmMYB5-1

<400> 5

gatagcggac catttgttgc 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> LmMYB5-2

<400> 6

gccctttttt caagcccg 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> LmMYB 1

<400> 7

atggggagga gtccctgctg 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> LmMYB 2

<400> 8

ttagaatcgt tgattggaga cggag 25

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> QP1

<400> 9

tggatgaact atctccgacc g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> QP2

<400> 10

cagcgatagc ggaccatttg 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 18SP1

<400> 11

agaggaacag tcgggggcat t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 18SP2

<400> 12

cggcatcgtt tacggttgag a 21

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> BamH-F1

<400> 13

cgcggatcca tggggaggag tccctgctg 29

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> Hind-R1

<400> 14

cccaagcttg aatcgttgat tggagacgga g 31

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> MYB1302-F

<400> 15

cgcggatcca tggggaggag tccctgc 27

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> MYB1302-R

<400> 16

cccaagcttg aatcgttgat tggagacgg 29

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Os18sF

<400> 17

gactctggtg atggtgtcag c 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Os18sR

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