本發(fā)明屬于功能性纖維領(lǐng)域，具體涉及一種透明質(zhì)酸混紡納米纖維固定酶的制備方法。

背景技術(shù)：

利用含有功能性基團的高聚物為基體，通過混紡技術(shù)，合成具有特定表面性質(zhì)的功能性高分子材料用以固定脂肪酶一直是酶固定領(lǐng)域的研究重點。表面富含羧基的PMA-AA納米纖維雖然具有較大的比表面積，但該基體在接枝反應過程中，形態(tài)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，甚至于完全失去納米纖維形態(tài)，此外該納米纖維呈現(xiàn)疏水性能。

靜電紡絲技術(shù)制備納米纖維，當前此類酶固定載體一方面以普通聚合物為基體，此類基體生物相容性差，難以為酶提供溫和的微環(huán)境。另一方面以吸附或者共價鍵的方式接枝殼聚糖等生物相容性材料對納米纖維表面進行改性；此類方法步驟繁瑣，由于較大的空間位阻，接枝率低；物理吸附的改性材料容易脫落。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種透明質(zhì)酸混紡納米纖維固定酶的制備方法，以PMA-AA納米纖維為基體，通過靜電紡絲技術(shù)混紡透明質(zhì)酸鈉。對混紡后得到的纖維進行酸化，得到混紡有透明質(zhì)酸的納米纖維，形態(tài)穩(wěn)定，孔隙率高，比表面積大，表面含有大量的羧基。將其作為脂肪酶的固定化載體進行固定化酶，形態(tài)穩(wěn)定，有較高的穩(wěn)定性和活性。

本發(fā)明提供的一種透明質(zhì)酸混紡納米纖維固定酶的制備方法，包括以下步驟：

1)將PMA-PAA溶液與透明質(zhì)酸鈉溶液混合，震蕩混勻后，即得到紡絲前驅(qū)體溶液；

2)取紡絲前驅(qū)體溶液，采用靜電紡絲技術(shù)進行紡絲，得到納米纖維膜；

3)室溫下，將納米纖維膜沖洗后，浸泡于鹽酸溶液中，再沖洗去除表面鹽酸，吹干后置于EDC/NHS溶液中反應活化，再沖洗，吹干后置于酶溶液中，震蕩反應后，即得透明質(zhì)酸混紡納米纖維固定酶。

進一步的，步驟1)中，所述PMA-PAA溶液的制備方法為：

將2mL丙烯酸和14mL丙烯酸甲酯溶于40mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.2～0.3g偶氮二異丙腈，充氮氣10～12min后，放到60～80℃恒溫水浴鍋加熱，反應15～24小時，即可得到黏稠、透明、均一的PMA-PAA溶液。

步驟1)中，所述透明質(zhì)酸鈉溶液的制備方法為：

將DMF溶液和蒸餾水混合后，將透明質(zhì)酸鈉固體加入其中，溶解得到透明質(zhì)酸鈉溶液；其中，DMF溶液、蒸餾水和透明質(zhì)酸鈉固體的用量比為：3ml:3ml：8～48mg。

步驟(1)中透明質(zhì)酸鈉溶液與PMA-PAA溶液的體積比為(0.5-3):5。

步驟2)中所述靜電紡絲技術(shù)進行紡絲具體為：紡絲在室溫條件下進行，濕度30％～40％，溶液注射速度為0.3～0.5mL/h，電壓為16～18kV，噴絲口與接收屏距離為12～18cm，針頭直徑為5.5mm針頭接入正極，鋁箔接入負極。紡絲液在電場中產(chǎn)生穩(wěn)定細流，細流經(jīng)過分裂與拉伸，最終收集到接收鋁箔上，接收時間24～26小時。所紡出纖維直徑在200-500nm。

步驟3)中所述鹽酸溶液濃度為0.01mol/L；納米纖維膜與鹽酸溶液的體積比為：1:5g/mL；浸泡時間為1h；

步驟3)中所述EDC/NHS溶液中EDC和NHS的摩爾比為1:2；優(yōu)選的，EDC和濃度0.1M，NHS的濃度0.2M。

步驟3)中納米纖維膜在EDC/NHS溶液中活化時間為0.6-1.5h；

進一步的，步驟3)中，所述酶溶液酶濃度在4～10mg/mL；優(yōu)選的為南極假絲酵母酶溶液；所述震蕩反應是指25℃水浴中振蕩反應18-24小時；

步驟3)具體為：

取步驟2)制備的納米纖維膜，用蒸餾水和磷酸鹽緩沖溶液分別沖洗后，將納米纖維膜放入0.01mol/L的鹽酸溶液浸泡1h，取出后用磷酸鹽緩沖溶液反復沖洗，以除去表面粘附的鹽酸，將酸化的膜分別浸入磷酸鹽緩沖溶液和超純水中超聲1分鐘，取出吹干保存?zhèn)溆?，然后，?5℃水浴條件下，將納米纖維膜放入EDC/NHS溶液中反應活化1h，活化的膜用磷酸鹽緩沖溶液和超純水沖洗，以除去表面粘附的活化劑，吹干后，將表面活化的納米纖維膜浸入配制好的南極假絲酵母酶溶液中，酶濃度在4～10mg/mL，于25℃水浴中振蕩反應20小時后將膜取出，用磷酸鹽緩沖溶液和超純水沖洗，以除去表面附著的酶液，晾干備用。

所述磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.05M，pH為7.0。

酶載量測定：

首先將100mL 95％乙醇、200mL88％磷酸和350mg考馬斯亮藍混合，配置Bradford儲存液，在棕色瓶中4℃保存。然后將蒸餾水、88％磷酸、95％乙醇、和Bradford儲存液按425：15：30：30的體積混合，用濾紙過濾，將工作液在棕色瓶中4℃保存。每次使用前需要再過濾。移取0.3mL牛血清蛋白(BSA)溶液和3.0mLBradford工作液于干燥潔凈的小離心管中，充分混合，于25℃水浴振蕩下密閉顯色10min。同時取0.3mLPBS(0.o5M，pH7.0)和3.0mLBradford工作液混合，于25℃水浴振蕩下顯色10min，作為空白。用紫外分光光度計于710nm處檢測蛋白溶液的吸光度。將樣品溶液的吸光度值與脂肪酶標準曲線比較，確定其蛋白濃度。依據(jù)下面公式計算酶載量。

式中，Ae：載酶量(mg/g)，C₀：固定化前酶液中蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)配制1mg/mL濃度的CALB脂肪酶液。C：固定化后酶液中蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)，V：固定化酶所用酶溶液的體積(mL)，取15mL。C_W：洗滌固定化酶后PBS緩沖液中的酶液濃度(mg/mL)，V_W：所用PBS緩沖液的體積(mL)，取4mL。W：納米纖維膜的質(zhì)量。

酶活測定：

取一定濃度橄欖油于圓底燒瓶中，加入40-60mg的固定化酶膜材料，攪拌10min，立即加入8mL甲苯，繼續(xù)攪拌10min，終止反應，將萃取生成的脂肪酸取4ml溶液轉(zhuǎn)移至離心試管中，離心取上層有機相加入1mL顯色劑，產(chǎn)生的脂肪酸與Cu生成綠色絡(luò)合物。離心取上層含有脂肪銅的甲苯溶液，用分光光度計在710nm處測其吸光度，以甲苯為標準液，4組離心液為待測液，每組測三次，取其平均值，即得該待測液的吸光度，一分鐘釋放1μM的脂肪酶為1單位酶活。

本發(fā)明是基于靜電紡絲技術(shù)制備混紡PMA-AA@透明質(zhì)酸納米纖維，從而使其具有生物相容性好，保水性能好，固定位點多等特征，提高固定酶的各類性能。傳統(tǒng)酶固定所用的靜電紡納米纖維固定位點少、生物相容性差。而透明質(zhì)酸的混紡可有效提高載體的生物相容性和保水性。研究還發(fā)現(xiàn)：透明質(zhì)酸鈉濃度為0.5mg/L時，酶載量最高，達143mg/g；此外，相比于游離酶，該固定化酶對于pH、溫度、時間耐受性有顯著增加。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用靜電紡絲技術(shù)，使用生物相容性好且具有特殊保水性的透明質(zhì)酸改性納米纖維，并將此功能性納米纖維應用于酶的固定，操作相對簡便且能制備特定的固定化酶技術(shù)，在上述實驗技術(shù)的操作下，本發(fā)明具有如下效果：

(1)本發(fā)明所述的混紡PMA-AA@透明質(zhì)酸納米纖維形態(tài)穩(wěn)定、孔隙率高、比表面積大，并含有大量的羧基。

(2)本發(fā)明所述的PMA-AA@透明質(zhì)酸納米纖維可應用于酶固定領(lǐng)域，顯著提高酶的固載量和活性，具有顯著的功能性。

附圖說明

圖1混紡PMA-AA@透明質(zhì)酸鈉納米纖維SEM形貌圖；

圖2混紡PMA-AA@透明質(zhì)酸鈉納米纖維固定酶SEM形貌圖；

圖3是固定化酶和游離酶的在不同pH下的對比圖；

圖4是固定化酶和游離酶的在不同溫度下的對比圖；

圖5是固定化酶和游離酶儲存不同時間的對比圖；

圖6為反應過程示意圖。

具體實施方式

實施例1

一種透明質(zhì)酸混紡納米纖維固定酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)透明質(zhì)酸溶液的配置

用量取1.5mLDMF溶液和1.5mL蒸餾水加入試管中，用電子天平稱取4mg透明質(zhì)酸鈉固體加入其中溶解得到透明質(zhì)酸鈉溶液。

(2)PMA-AA二元共聚體的配置

將2mL丙烯酸和14mL丙烯酸甲酯溶于40mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.2～0.3g偶氮二異丙腈，充氮氣10～12min后，放到60～80℃恒溫水浴鍋加熱，反應15～24小時，即可得到黏稠、透明、均一的PMA-PAA溶液。(3)紡絲前驅(qū)體的配置

量取5mLPMA-PAA溶液加入3mL透明質(zhì)酸鈉溶液，充分振蕩后即得到紡絲前驅(qū)體溶液。

(4)靜電紡絲法制備含透明質(zhì)酸的納米纖維膜

采用靜電紡絲裝置進行復合電紡纖維的制備。紡絲在室溫條件下進行，濕度30％，溶液注射速度為0.3mL/h，電壓為18kV，噴絲口與接收屏距離為18cm，針頭直徑為5.5mm針頭接入正極，鋁箔接入負極。紡絲液在電場中產(chǎn)生穩(wěn)定細流，細流經(jīng)過分裂與拉伸，最終收集到接收鋁箔上，接收時間24小時。

(5)酶的固定化

取60mg混紡的納米纖維膜，分別用蒸餾水和磷酸鹽緩沖溶液分別沖洗后，將納米纖維膜放入0.01mol/L的鹽酸溶液浸泡1h，取出后用磷酸鹽緩沖溶液反復沖洗，以除去表面粘附的鹽酸，將酸化的膜分別浸入磷酸鹽緩沖溶液和超純水中超聲1分鐘，取出吹干，然后將納米纖維膜放入含有0.1M EDC和0.2M NHS混合溶液中，在25℃水浴中浸泡1h后取出?；罨哪び昧姿猁}緩沖溶液和超純水沖洗，以除去表面粘附的活化劑，吹干備用。將表面活化的納米纖維膜浸入6mg/mL酶溶液中，于25℃水浴中振蕩反應20小時后將膜取出。用大量PBS和超純水沖洗，晾干備用。

(6)酶載量測定。首先將100mL95％乙醇、200mL88％磷酸和350mg考馬斯亮藍混合，配置Bradford儲存液，在棕色瓶中4℃保存。然后將蒸餾水、88％磷酸、95％乙醇、和Bradford儲存液按425:15:30:30的體積混合，用濾紙過濾，將工作液在棕色瓶中4℃保存。每次使用前需要再過濾。移取0.3mL蛋白溶液和3.0mLBradford工作液于干燥潔凈的小離心管中，充分混合，于25℃水浴振蕩下密閉顯色10min。同時取0.3mLPBS(0.o5M，pH7.0)和3.0mLBradford工作液混合，于25℃水浴振蕩下顯色10min，作為空白。用紫外分光光度計于710nm處檢測蛋白溶液的吸光度。將樣品溶液的吸光度值與脂肪酶標準曲線比較，確定其蛋白濃度。酶載量高達143mg/g。

實施例2

一種透明質(zhì)酸混紡納米纖維固定酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)透明質(zhì)酸溶液的配置

用量取1.5mLDMF溶液，1.5mL蒸餾水加入試管中，用電子天平稱取4mg透明質(zhì)酸鈉固體加入其中溶解得到透明質(zhì)酸鈉溶液。

(2)PMA-AA二元共聚體的配置

將2mL丙烯酸和14mL丙烯酸甲酯溶于40mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.2～0.3g偶氮二異丙腈，充氮氣10～12min后，放到60～80℃恒溫水浴鍋加熱，反應15～24小時，即可得到黏稠、透明、均一的PMA-PAA溶液。

(3)紡絲前驅(qū)體的配置

量取5mLPMA-PAA溶液加入0.5mL透明質(zhì)酸鈉溶液，充分振蕩后即得到紡絲前驅(qū)體溶液。

(4)靜電紡絲法制備含透明質(zhì)酸的納米纖維膜

采用靜電紡絲裝置進行復合電紡纖維的制備。紡絲在室溫條件下進行，濕度30％左右，溶液注射速度為0.3mL/h，電壓為18kV，噴絲口與接收屏距離為18cm，針頭直徑為5.5mm針頭接入正極，鋁箔接入負極。紡絲液在電場中產(chǎn)生穩(wěn)定細流，細流經(jīng)過分裂與拉伸，最終收集到接收鋁箔上。接收時間24小時。

(5)酶的固定化

取60mg混紡的納米纖維膜，分別用蒸餾水和磷酸鹽緩沖溶液分別沖洗后，將納米纖維膜放入0.01mol/L的鹽酸溶液浸泡1h，取出后用磷酸鹽緩沖溶液反復沖洗，以除去表面粘附的鹽酸，將酸化的膜分別浸入磷酸鹽緩沖溶液和超純水中超聲1分鐘，取出吹干，然后將納米纖維膜放入含有0.1M EDC和0.2M NHS混合溶液中，在25℃水浴中浸泡1h后取出。活化的納米纖維膜用大量PBS和超純水沖洗，吹干備用。將表面活化的納米纖維膜浸入6mg/mL酶溶液中，于25℃水浴中振蕩反應20小時后將膜取出。用大量PBS和超純水沖洗，晾干備用。

(6)酶載量測定：

首先將100mL95％乙醇、200mL88％磷酸和350mg考馬斯亮藍混合，配置Bradford儲存液，在棕色瓶中4℃保存。然后將蒸餾水、88％磷酸、95％乙醇、和Bradford儲存液按425:15:30:30的體積混合，用濾紙過濾，將工作液在棕色瓶中4℃保存。每次使用前需要再過濾。移取0.3mL蛋白溶液和3.0mLBradford工作液于干燥潔凈的小離心管中，充分混合，于25℃水浴振蕩下密閉顯色10min。同時取0.3mLPBS(0.05M，pH7.0)和3.0mLBradford工作液混合，于25℃水浴振蕩下顯色10min，作為空白。用紫外分光光度計于710nm處檢測蛋白溶液的吸光度。將樣品溶液的吸光度值與脂肪酶標準曲線比較，確定其蛋白濃度，酶載量62mg/g。