本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及植物抗旱相關(guān)蛋白EtSnRK2.2及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：小麥作為我國(guó)重要的糧食作物之一，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、鹽堿等逆境脅迫條件嚴(yán)重影響著小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約著我國(guó)小麥糧食安全。利用基因工程技術(shù)從分子水平上深入研究植物與非生物逆境之間的關(guān)系，揭示植物對(duì)逆境脅迫信號(hào)傳導(dǎo)及基因表達(dá)調(diào)控分子機(jī)理，克隆抗逆相關(guān)基因?yàn)榕嘤魑锟鼓嫘路N質(zhì)提供候選抗逆基因資源。蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶家族(SnRKs)在植物的許多生理過(guò)程中起著重要的作用，例如激素信號(hào)傳導(dǎo)、非生物脅迫和植物的生長(zhǎng)發(fā)育等。SnRK2家族基因在功能上表現(xiàn)出差異性，擬南芥中SnRK家族成員中有9個(gè)基因被甘露醇或NaCl高滲脅迫誘導(dǎo)，5個(gè)基因被ABA誘導(dǎo)，但均不受冷脅迫誘導(dǎo)。水稻中SnRK基因，通過(guò)蛋白磷酸化分析表明所有成員都能被高滲脅迫激活，但是只有OsSAPK8、OsSAPK9和OsSAPK10這三個(gè)基因受ABA誘導(dǎo)表達(dá)。在小麥中，第一個(gè)SnRK2成員是從ABA處理的小麥胚胎cDNA文庫(kù)中分離得到的PKABA1，PKABA1的表達(dá)除受ABA和干旱脅迫所誘導(dǎo)。TaSnRK2.4基因過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱、高鹽的脅迫耐性，同時(shí)不會(huì)造成植物的生長(zhǎng)矮化現(xiàn)象。TaSnRK2.7基因功能分析顯示，在糖代謝、降低滲透勢(shì)、增強(qiáng)光系統(tǒng)II的活性以及促進(jìn)植物生根等生理生化過(guò)程中起著重要作用；TaSnRK2.8基因過(guò)表達(dá)的擬南芥對(duì)干旱、低溫、高鹽、高溫等均有一定脅迫耐性。因此，克隆、分離抗逆相關(guān)SnRK蛋白激酶基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種植物抗旱相關(guān)蛋白EtSnRK2.2。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述植物抗旱相關(guān)蛋EtSnRK2.2的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明的另一目的提供上述植物抗旱相關(guān)蛋白EtSnRK2.2的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的抗旱相關(guān)蛋白EtSnRK2.2，來(lái)源于毛穗偃麥草，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明的蛋白激酶由343個(gè)氨基酸殘基組成，是SnRK類蛋白激酶。自SEQIDNO.1的氨基末端第10-30位氨基酸殘基是ATP結(jié)合域，自SEQIDNO.1的第115-130位氨基酸殘基為絲氨酸/蘇氨酸結(jié)合域。SEQIDNO：1為了使蛋白EtSnRK2.2便于純化，可在由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的SEQIDNO.1序列，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子EtSnRK2.2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。根據(jù)本發(fā)明的EtSnRK2.2編碼基因具有如SEQIDNO.2所示cDNA序列。SEQIDNO.2含有EtSnRK2.2基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有EtSnRK2.2基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用EtSnRK2.2構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育耐逆植物的方法。本發(fā)明所提供的培育耐逆植物的方法，是將上述任一種含有EtSnRK2.2基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，得到耐逆植物。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的SnRK蛋白激酶EtSnRK2.2基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對(duì)干旱和鹽等非生物逆境脅迫耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有編碼基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如：擬南芥、小麥、毛穗偃麥草、擬南芥、水稻、玉米、黃瓜、番茄、楊樹(shù)、草坪草、苜宿等。本發(fā)明以抗旱性較強(qiáng)的毛穗偃麥草(ElytrigiatrichophoraL.)為實(shí)驗(yàn)材料，得到了抗逆相關(guān)的EtSnRK2.2蛋白及其編碼基因，并將其導(dǎo)入小麥，顯著提高了轉(zhuǎn)基因小麥的抗旱性。本發(fā)明的抗旱相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)Ω牧?、增?qiáng)小麥抗逆性，提高產(chǎn)量、加速抗逆分子育種進(jìn)程，以及有效節(jié)省水資源具有十分重要的理論和實(shí)際意義。下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。附圖說(shuō)明圖1顯示EtSnRK2.2轉(zhuǎn)基因小麥分子檢測(cè)結(jié)果。M：Trans2KPlusDNAmarker；7：陰性對(duì)照；2-6為不同轉(zhuǎn)基因小麥株系。圖2顯示EtSnRK2.2轉(zhuǎn)基因小麥旱棚抗旱鑒定結(jié)果，其中，京冬18為受體對(duì)照；446-1，463-2，660-1，471-3為不同轉(zhuǎn)基因株系。圖3顯示EtSnRK2.2轉(zhuǎn)基因小麥田間抗旱生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果，主要測(cè)定了446-1，463-2，660-1，471-3轉(zhuǎn)基因株系及受體京冬18的可溶性糖及葉綠素?zé)晒狻D4顯示了EtSnRK2.2轉(zhuǎn)基因小麥不同株系表型比較，主要考察了421-1、437-8、471-2、582-1轉(zhuǎn)基因株系及受體京冬18的穗粒數(shù)、株高、穗長(zhǎng)等數(shù)據(jù)。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。實(shí)施例1：毛穗偃麥草抗旱相關(guān)EtSnRK2.2基因的cDNA克隆對(duì)生長(zhǎng)30天左右的毛穗偃麥草幼苗進(jìn)行干旱處理5小時(shí)，用Trizol提取毛穗偃麥草總RNA。應(yīng)用5’RACE試劑盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058)和3’RACE試劑盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18373-019)獲得EtSnRK2.2基因的全長(zhǎng)序列1032bp。用Trizol提取毛穗偃麥草幼苗的總RNA，用superscriptII(invitrogen)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得到cDNA。根據(jù)EtSnRK2.2基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物P1和P2。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物P1和P2的序列如下：P1：5’-ATGGATCGGTACGAGGTGGT-3’，P2：5’-TTACAAAGGGCACACGAAATCC-3’。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到分子量約為1kb左右的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。回收該片段，將該回收片段與pGEM-TEasy(Promega)連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)pGEM-TEasy載體上的氨卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動(dòng)子序列為引物對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增到的EtSnRK2.2基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)為SEQIDNo.2的自5’末端第1至1032位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白質(zhì)。將含序列SEQIDNo.2所示EtSnRK2.2基因的重組載體命名為pTE-EtSnRK2.2。EtSnRK2.2基因?yàn)橐粋€(gè)新基因，進(jìn)一步用引物P1和P2在毛穗偃麥草基因組中進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示該基因的基因組序列大小與cDNA長(zhǎng)度大小一致，不含有內(nèi)含子序列。實(shí)施例2：用EtSnRK2.2基因增強(qiáng)植物的抗旱性1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1)Ubi-EtSnRK2.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建以毛穗偃麥草的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用含有HindIII和BamHI接頭序列的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后HindIII和BamHI雙酶切PCR產(chǎn)物回收，將酶切產(chǎn)物正向插入載體pNT112的Ubi啟動(dòng)子之后的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體Ubi::EtSnRK2.2。引物序列如下：EtSnRK2.2[HindIII]5’-TCAAGCTTATGGATCGGTACGAGGTGGT-3’EtSnRK2.2[BamHI]5’-GGGGATCCTTACAAAGGGCACACGAAATCC-3’2、轉(zhuǎn)基因小麥獲得和功能鑒定1)轉(zhuǎn)基因小麥材料的獲得將上述構(gòu)建的重組表達(dá)載體pUbi::EtSnRK2.2分別用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌C58C1，再用pUbi::EtSnRK2.2的根癌農(nóng)桿菌C58C1轉(zhuǎn)化小麥，用含200mg/LBasta的MS培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。將篩選得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株用PCR做進(jìn)一步鑒定篩選，PCR所用的一對(duì)引物為P3和P4。P3(上游引物):5’-GGAGATTATGAACCACCGGT-3’，P4(下游引物):5’-TCTCCGGGATGGTTATTCGC-3’。對(duì)Ubi::EtSnRK2.2轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR擴(kuò)增可獲得1000bp左右條帶，結(jié)果獲得轉(zhuǎn)Ubi::EtSnRK2.2小麥56株(圖1)。同時(shí)將pNT112空載體導(dǎo)入小麥，方法同上，作為對(duì)照，獲得10個(gè)株系的轉(zhuǎn)空載體小麥，篩選獲得的轉(zhuǎn)基因小麥用T2代表示。2)EtSnRK2.2轉(zhuǎn)基因小麥抗旱性鑒定在全生育期只澆返青水情況下，對(duì)種植的EtSnRK2.2轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行旱棚抗旱性篩選。對(duì)田間抗旱表型鑒定發(fā)現(xiàn)，EtSnRK2.2轉(zhuǎn)基因株系持綠性較好，旗葉仍然能夠正常進(jìn)行光合作用，籽粒灌漿充足，千粒重增加顯著；而對(duì)照京冬18持綠性差，旗葉及其他部位葉片發(fā)黃、早衰嚴(yán)重，不能正常進(jìn)行光合作用(圖2)。可溶性糖、葉綠素?zé)晒馍碇笜?biāo)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，EtSnRK2.2轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素?zé)晒庵?、可溶性糖含量均比?duì)照積累較多(圖3)。此外，從收獲的考種數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系的穗粒數(shù)、根系、穗長(zhǎng)等性狀均優(yōu)于對(duì)照，從而使得EtSnRK2.2轉(zhuǎn)基因材料耐旱性顯著增強(qiáng)(圖4)。<110>北京市農(nóng)林科學(xué)院<120>植物抗旱相關(guān)蛋白EtSnRK2.2及其編碼基因和應(yīng)用<160>2<210>1<211>343<212>PRT<213>偃麥草<400>1MDRYEVVRDIGSDNFGVAKLVRDVRTKEHFAVKFIKRGRKIDEHVQREIMNHRSLKHPNI60IRFKEVVLTPTHLAIIMEYASGGELFQRICNAGRFSEDEGRFFFQQLISGVSYCHSMQVC120HRDLKLENTLLDGSVAPRLKICGFGYSKSSVLHSQPKSTVGTPAYIAPEVLSRREYDGKV180ADVWSCGVTLYVMLVGAYPFEDPDEPRNFRKTITRILSVQYSVPDYVRVSMDCIHLLSRI240FVGNPQQRITIPEIKNHPWFLKRLPVEMTDEYQRSMQLADMNTPSQSLEEAMAIIHEARK300PGDSALGIAGQVARLGSMDLDDIDFDDIDDIDIENSGDFVCPL343<210>2<211>1032<212>DNA<213>偃麥草<400>2atggatcggtacgaggtggtgagggacatcgggtccgacaacttcggggtggcgaagctg60gtgcgggacgtcaggaccaaggagcacttcgccgtcaagttcatcaagcgaggccgcaag120attgatgaacatgttcaaagggagattatgaaccaccggtcactcaagcatccaaatatt180atccgattcaaggaggtcgtgctaactcccacacatttggcaataattatggaatatgcc240tctgggggcgagctatttcaaaggatttgcaacgcagggagatttagcgaggatgaggga300aggttcttcttccaacaattgatttctggagtgagctattgtcactctatgcaagtatgt360catagagatttgaaactagagaatactctcttggatggtagtgttgcacctcgactcaag420atttgtggcttcggttactccaagtcttctgtcttgcattctcaaccgaagtcaactgtt480ggcacaccggcatacatcgccccggaggtcctctctagaagagagtatgatggaaaggtc540gctgatgtttggtcttgtggagtaacgctctatgtgatgcttgtcggggcatatcctttc600gaggaccctgatgagccaaggaacttccgcaaaacaatcactaggatactcagtgtacag660tactctgttccggactacgttcgagtctccatggattgcatacatctgctgtcccgcatt720ttcgttggaaatcctcagcagcgaataaccatcccggagatcaagaaccatccatggttc780ctcaaacgcctgcccgttgagatgaccgatgagtaccaaaggagcatgcagttggcagac840atgaacacgccgtcacagagcctggaagaagccatggcgatcatccatgaggcacggaaa900ccgggtgatagcgccctagggattgctgggcaggttgcccgcctggggagcatggatcta960gatgacattgatttcgacgatatcgacgacattgacattgagaacagcggggatttcgtg1020tgccctttgtaa1032當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3