本發(fā)明屬于基因工程應用
技術領域：
，涉及一種黃瓜轉(zhuǎn)錄因子CsERF025及其在促進黃瓜果實順直發(fā)育中的應用。
背景技術：
：黃瓜是設施栽培中的重要蔬菜，也是我國保護地栽培的第一大作物。但是我國黃瓜生產(chǎn)的標準商品率卻很低，平均二級以上的商品率僅有65％，每年因果實彎曲畸形導致商品性喪失，給農(nóng)民造成很大的經(jīng)濟損失(Zhouetal.,2009)。為了解決自然生長的黃瓜容易出現(xiàn)彎瓜現(xiàn)象，菜農(nóng)大多選擇“蘸花藥（氯吡脲）”處理，促使黃瓜順直，從而提高黃瓜的商品價值。研究黃瓜果實彎曲形成的分子機理，將會對于指導黃瓜育種和栽培、減少“蘸花藥”的使用、提高黃瓜生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)商品率、增加農(nóng)民收入等具有極其重要的生產(chǎn)實際意義。此外，闡明調(diào)控黃瓜果實彎曲形成的機理，將會幫助我們更好地理解黃瓜果實發(fā)育的分子機制。因此，對黃瓜果實彎曲形成機理進行研究不僅具有重要的生產(chǎn)應用價值，同時也具有重要的理論研究意義，其相關成果在推動本學科領域在果實發(fā)育調(diào)控等方面的研究和技術應用將有重要作用。ERF是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，具有一個保守的ERF型DNA結合域。ERF轉(zhuǎn)錄因子影響植物的發(fā)育可能是影響ABA、乙烯等植物激素的合成的間接結果（Wuetal.,2002;Zhangetal.,2005）。如在擬南芥中超表達番茄ERF轉(zhuǎn)錄因子Pti4時，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出抑制根和下胚軸的延伸、頂端過度彎曲以及葉片尺寸變小等表型，這可能是Pti4影響轉(zhuǎn)基因擬南芥乙烯合成的結果（Wuetal.,2002）。超表達TERF1轉(zhuǎn)基因煙草具有乙烯過量生成的形態(tài)，表現(xiàn)為黑暗生長的超表達煙草表現(xiàn)出典型的“三重反應”形態(tài)，正常光照條件下生長的煙草也表現(xiàn)出葉片狹小、細長的乙烯過量生成形態(tài)（Zhangetal.,2009）。在之前研究中，通過解剖學和細胞學研究表明，彎曲果實腹部細胞伸長受到抑制，細胞液泡化，核膜、液泡膜等部分降解，細胞呈現(xiàn)衰老趨勢，導致腹部生長緩慢。進而利用Illumina技術對轉(zhuǎn)錄組進行測序分析，經(jīng)qRT-PCR檢測，確定轉(zhuǎn)錄因子CsERF025和乙烯合成關鍵基因CsACS2的表達存在一致性，并且CsERF025在黃瓜果實腹部上調(diào)表達量是脊部的70倍，表明CsERF025在黃瓜果實彎曲形成過程中發(fā)揮著重要作用。乙烯應答反應因子ERF在植物的生長發(fā)育與逆境應答反應過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但在黃瓜中ERF因子是否調(diào)控乙烯生物合成影響黃瓜果實彎曲還未見報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是從黃瓜（CucumissativusL.）中分離、克隆得到一個調(diào)控果實順直和彎曲發(fā)育的ERF轉(zhuǎn)錄因子CsERF025，并通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化將其導入黃瓜中，鑒定其在果實發(fā)育中的功能。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：本發(fā)明以彎曲果實cDNA為模板，以下述引物進行擴增：正向引物：5′-ATGATCACTACAAAGGAATCCGCT-3′；反向引物：5′-CTAGTGGTAGCTCCAAAGATTTCCA-3′；得到一個新黃瓜基因CsERF025，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，CsERF025全長513bp；其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，編碼170個氨基酸，屬于AP2/ERF家族蛋白基因。本發(fā)明利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化黃瓜，獲得的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)生物學功能驗證，表明本發(fā)明所克隆的CsERF025基因具有促進果實順直發(fā)育的功能，其表達量為彎曲果實＞順直果實，并且彎曲果實的表達量為脊部＞腹部。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：1、依托本發(fā)明能有效促進果實的順直發(fā)育，一旦獲得轉(zhuǎn)基因材料，生產(chǎn)上可有效減少使用“蘸花藥（氯吡脲）”，節(jié)約資源，降低生產(chǎn)成本。另一方面，本發(fā)明可根據(jù)實際生產(chǎn)需求用于改善砧木材料或是其它，應用廣泛，易于被接受認可。2、通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化將該基因?qū)У街仓曛?，鑒定其在果實發(fā)育中的功能，為植物順直果實分子設計育種提供新的基因資源，為實施綠色農(nóng)業(yè)、安全農(nóng)業(yè)提供新的遺傳資源；同時該基因的開發(fā)和利用有利于指導黃瓜育種和栽培、提高黃瓜生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)商品率、降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本、增加農(nóng)民收入，減少果實彎曲給農(nóng)民帶來的經(jīng)濟損失，提高黃瓜栽培的經(jīng)濟效益，促進農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)高效發(fā)展。附圖說明圖1為本發(fā)明的技術流程圖。圖2為本發(fā)明的CsERF025基因在順直和彎曲黃瓜果實不同發(fā)育時期的表達模式示意圖。圖3為本發(fā)明的CsERF025基因在順直和彎曲黃瓜果實不同部位表達模式示意圖。圖4為本發(fā)明的CsERF025基因亞細胞定位熒光示意圖，圖中Bright為明場，GFP為綠色熒光，Chlorophy為葉綠素自發(fā)熒光，Merged為疊加結果，圖中標尺為10μm。圖5為本發(fā)明的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化流程圖。圖6為本發(fā)明的CsERF025正義轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定示意圖，圖中M是DNAmarkerDL2000；+是陽性對照（pCXSN-CsERF025質(zhì)粒）；—是陰性對照（水）；1-15是CsERF025正義轉(zhuǎn)基因植株。圖7為本發(fā)明的CsERF025反義轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定示意圖，圖中M是DNAmarkerDL2000；+是陽性對照（pCXSN-CsERF025質(zhì)粒）；—是陰性對照（水）；1-18是CsERF025反義轉(zhuǎn)基因植株。圖8為本發(fā)明的轉(zhuǎn)CsERF025基因植株的qRT-PCR鑒定示意圖，圖中WT是野生型株系；Col-2是空載對照；3,4,5,6,8,13,14是轉(zhuǎn)CsERF025正義轉(zhuǎn)基因株系；轉(zhuǎn)CsERF0252,3,4,5,6,7,9:反義轉(zhuǎn)基因株系。圖9為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因黃瓜果實彎曲比率和彎曲度的動態(tài)變化比較示意圖，圖中A是F2代的15個單株彎曲果實的比率示意圖；B是正義表達株系果實彎曲度的動態(tài)變化示意圖；OE1、OE2、OE3是3個正義表達株系；AS1、AS2、AS3是3個反義表達株系。具體實施方式下面結合附圖對本發(fā)明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍中。實施例1：CsERF025基因分離克隆及表達分析對黃瓜果實坐果期（開花2d）彎曲果實脊部和腹部，順直果實進行轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定出一個在彎曲果實腹部和脊部表達差異顯著的ERF轉(zhuǎn)錄因子CsERF025基因，為了得到其全長序列信息，我們在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.icugi.org/）中搜索CsERF025的全長序列，利用Primerpremier5.0設計特異性引物，進行PCR擴增。引物序列如下：CsERF025-F：5′-ATGATCACTACAAAGGAATCCGCT-3′；CsERF025-R：5′-CTAGTGGTAGCTCCAAAGATTTCCA-3′。首先使用Trizol（InvetrigenTM）法提取黃瓜果實、莖、葉、花的總RNA（試劑盒購自Invetrigen公司，操作方法按照說明書）。而后取1ul中RNA樣品，根據(jù)Toyobo反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTraAceqPCRRT-Kit說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1鏈。所得的第一鏈cDNA用于熒光定量PCR反應擴增目的基因的模板。反轉(zhuǎn)錄體系中各組分如表1：表1成分加入量（μL）5×RTBuffer2RTEnzymeMix0.5PrimerMix0.5RNA模板1Nuclease-freeWater6總體系10通過在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.icugi.org/）中搜索ID號為Csa3M042390.1的CDS全長序列（命名為CsERF025），利用Primer5.0設計特異性引物，進行PCR擴增。PCR克隆體系中各組分如表2：表2成份加入量（μL）10×PCRBuffer（含20mmol·L-1Mg2+）2dNTPs（10mmol·L-1）2上游引物（20μmol·L-1）0.5下游引物（20μmol·L-1）0.5Taq酶（2U）0.2cDNA2ddH2O12.8總體系20PCR擴增反應在Bio-RadDNAEngine?Systems擴增儀上按以下程序完成：94℃預變性5min；94℃變性30s、54℃退火30s、72℃延伸1min（共30個循環(huán)）；循環(huán)完成后72℃延伸10min。PCR擴增結束后產(chǎn)物于-20℃保存。PCR擴增產(chǎn)物的回收是使用1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下快速切下目的條帶，回收CsABC19基因的目的片段，具體方法參照北京全式金膠回收試劑盒說明書進行。pEASY-T3載體連接與陽性克隆篩選是將CsERF025基因的膠回收產(chǎn)物與北京全式金公司的pEASY-T3載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，具體方法參照北京全式金公司pEASY-T3載體說明書，進行藍白斑篩選。挑取若干白色單菌落于含有抗性LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，200rpm/min振蕩培養(yǎng)箱過夜，以菌液為模板，進行PCR檢驗，以及EcoRI酶切驗證陽性菌落（PCR體系同上），將鑒定獲得的CsERF025基因的陽性菌液，送至蘇州金唯智有限公司進行測序。酶切反應體系如表3：表3成分加入量（μL）Buffer1EcorI1質(zhì)粒3ddH2O6總體系10為了探究CsERF025基因在黃瓜果實不同發(fā)育時期表達模式，利用QRT-PCR分析極易彎曲品種“長春密刺”的表達模式。結果表明：CsERF025基因果實中表達最高，其次在雌花和根中表達。在莖、葉、莖尖和雄花中表達相對很低（圖2）。不同發(fā)育時期，順直果實CsERF025呈現(xiàn)緩慢上升表達，2-8d彎曲果實CsERF025基因的表達高于順直果實，在果實發(fā)育2d腹部的表達是脊部的2.73倍，然而從果實發(fā)育4d開始，脊部的表達高于腹部表達，并且4d脊部與腹部差異最大，為5.39倍（圖3）。因此推斷，CsERF025基因很可能與黃瓜果實彎曲的形成有關。實施例2：CsERF025基因亞細胞定位在線定位預測指出CsERF025基因定位于細胞核，本發(fā)明利用擬南芥原生質(zhì)體細胞來研究CsERF025基因的亞細胞定位。在這里我們選用了EGFP載體構建CsERF025基因的定位載體。利用RT-PCR擴增出CsERF025基因整個ORF（閱讀框），利用PCR擴增無終止密碼子序列，純化PCR產(chǎn)物與pEASY-T3載體連接，使用HindIII和BamhI雙酶切帶有開放閱讀框的pEASY-T3載體和EGFP載體，回收目的片段，用T4-DNA連接酶25℃過夜連接，將目的片段融合到綠色熒光蛋白（GFP）上游HindIII和BamhI中間的位置，構建植物綠色熒光表達載體CsERF025-EGFP，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α（方法和體系同上），篩選并驗證陽性菌落，送至蘇州金唯智有限公司測序。取10μL測序正確且無終止密碼的CsERF025-EGFP菌液，加入到50mL（含有50μLKan）LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200rpm的恒溫搖床中過夜培養(yǎng)。菌液分裝后用提取20管質(zhì)粒，再將提好的質(zhì)?；煸谝黄穑尤氲润w積的異丙醇沉淀，再加入1/10的3MNaAC，在低溫離心機中4℃，14000rpm離心10min，用75%的無水乙醇清洗2遍，室溫下晾干，沉淀用試劑盒中的EB進行溶解。用紫外分光光度計檢測質(zhì)粒濃度，濃度在1μg/μL左右的純度，可以用于融入擬南芥原生質(zhì)體細胞，該濃度的質(zhì)?？梢蕴岣邅喖毎ㄎ坏某晒β省sERF025-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體：1、將上步檢驗好的擬南芥原生質(zhì)細胞100g離心3min，棄上清，盡量去除W5溶液，加入2mLMMG溶液，重懸原生質(zhì)體，使之最終濃度在2×105個/mL；2、取干凈的2mL離心管，加入20μL（約30μg）pCAMBIA1302-CsABC19質(zhì)粒DNA和200μL原生質(zhì)細胞，輕柔混勻，25℃靜止5min；3、加入220μL（等體積）的40%PEG4000溶液，輕柔混勻，25℃靜止5min；4、加入1mL預冷的W5溶液，輕柔混勻；5、重復步驟4，加入1mL預冷的W5溶液和1%BSA，輕柔混勻，于25℃光照培養(yǎng)16h；6、利用激光共聚焦顯微鏡（Leica，Germany）觀察融合蛋白表達情況，試驗重復3次。48小時之后，用GermanyLeicaTCSSP2型激光共聚焦顯微鏡，觀察CsERF025融合蛋白的亞細胞定位情況。結果顯示，GFP對照質(zhì)粒在整個細胞中都表達，CsERF025-EGFP融合蛋白在僅在細胞核表達，說明CsERF025基因編碼的蛋白屬于核定位的蛋白（圖4）。實施例3：植物轉(zhuǎn)化超表達載體以及反義表達載體構建將提取pCXSN的質(zhì)粒用XCM1酶切，酶切條件37℃酶切1h，將酶切產(chǎn)物跑電泳，膠回收得到純化產(chǎn)物后，按1:1的比例將膠回收的CsERF025和pCXSN的大片段用T4DNA連接酶16℃連接16h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細胞，鋪板，在37℃的條件下過夜培養(yǎng)，挑單菌落搖菌，進行PCR及XCMI酶切檢測目標條帶后，送樣測序。之后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中并保存，用于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化。20μL的酶切反應體系中各組分如表4：表4質(zhì)粒7μLXCM11μLBuffer1μLddH2O10μL總體系20μL10μL連接反應體系中各組分如表5：表5膠回收CsERF025aμL膠回收pCXSN的大片段bμLT4DNA連接酶1μLBuffer1μL總體系10μL實施例4：黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌介導的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下：1、根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)：取含有CsERF025基因植物過表達載體的農(nóng)桿菌菌液在含有Rif和Kan抗性的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，36-48h后長出清晰可見的單菌落；挑單菌落于5mL含有Rif和Kan抗性的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm過夜培養(yǎng)16h；接著以1:50比例轉(zhuǎn)入250mL含有Rif和Kan抗性YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm培養(yǎng)至OD600=0.5；取搖好的菌液，分裝，4℃，6000rpm，離心10min，在超凈工作臺中，棄掉上清，收集菌體；將菌體用滲透緩沖液（1/2MS培養(yǎng)基+5%蔗糖+終濃度0.02%-0.03%SilwetL-77）重懸，重懸菌液的OD600=0.2-0.3時做侵染。2、侵染：取預培養(yǎng)2-3d黃瓜的子葉節(jié)，放入已高壓滅菌的三角瓶中，適量加入已活化的菌液，28℃，200轉(zhuǎn)/分鐘，浸染子葉節(jié)，時間不宜過長，約15min。3、共培養(yǎng)：將與農(nóng)桿菌浸染過的子葉節(jié)用無菌濾紙吸干后，用鑷子插入附加30mg/L乙酰丁香酮的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，28℃，黑暗培養(yǎng)3-4d，培養(yǎng)基表面出現(xiàn)白色可見的菌落即可。4、除菌及篩選培養(yǎng)：取經(jīng)過共培養(yǎng)的子葉節(jié)于無菌三角瓶內(nèi)，在無菌操作臺上先用無菌水沖洗3-4次，用含有500mg/L頭孢噻肟鈉除菌劑的植物液體培養(yǎng)基，28℃，200r/min浸泡20min，用無菌水沖洗6-8次，再用已滅菌的濾紙吸干，將子葉節(jié)插入除菌篩選培養(yǎng)基，利用頭孢進行殺菌，利用卡納篩選抗性芽。溫度設置為25℃，光照強度為1500lx、光照時間設置為16小時。5、生根培養(yǎng):待不定芽長到2-3cm時，將不定芽剪下，此時注意切勿從根部剪下，以免抗性芽粘染農(nóng)桿菌，不易成活。將剪下的抗性芽插入生根培養(yǎng)基，進行生根培養(yǎng)，兩周左右長出不定根。6、黃瓜苗轉(zhuǎn)入土培:將已生根的植株從培養(yǎng)基中取出，洗去根部培養(yǎng)基，栽入裝有已滅菌的凈河沙的營養(yǎng)缽中，澆灌營養(yǎng)液，并覆蓋保鮮膜保濕，在培養(yǎng)箱中溫度24/18℃,光照16/8h培養(yǎng)一周左右長出新葉揭去保鮮膜，完成馴化，并栽植于滅菌的營養(yǎng)土中。黃瓜轉(zhuǎn)化苗所用培養(yǎng)基見表6，轉(zhuǎn)化過程如圖5所示。表67、陽性轉(zhuǎn)基因黃瓜初步確定將收獲的T0代種子徹底消毒后，播種于含有50mg/LKan的MS培養(yǎng)中，4℃黑暗春化2d后，置于22℃/18℃，光照16h、黑暗8h，濕度保持在70%左右的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，篩選抗性植株。生長31d后，葉片正常展平，且生根的植株可初步確定為陽性植株。實施例5：轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定1、黃瓜葉片DNA的提取取3-5mg新鮮擬南芥葉片，放入1.5mL離心管中，加入200μLDNA提取液，并加入小鋼珠，在核酸純化儀中震蕩45s，取出鋼珠，剩余液體14000rpm離心5min，取1μL用于PCR鑒定。Edwards液的配制：200mMTris--HCl（PH=7.5），250mMNacl，25mMEDTA，0.5%SDS；TEBuffer的配制：10mMTris--HCl（PH=7.5），1mMEDTA；DNA提取液：用10倍的TEBuffer稀釋Edwards液。2、陽性轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測除了在DNA水平驗證轉(zhuǎn)基因植株是否含有目的基因外，從RNA水平分析目的基因的表達情況，可以進一步驗證。提取黃瓜的RNA，并進行熒光定量PCR分析（方法與體系同前）。取抗性轉(zhuǎn)基因黃瓜的葉片，提取DNA，用通用引物（1250-F:CGGCAACAGGATTCAATCTTA,1250-R:CAAGCATTCTACTTCTATTGCAGC）進行PCR鑒定，有目的條帶的植株，視為陽性植株，收種，用于下一步試驗。結果表明，獲得含有目的基因的正義表達轉(zhuǎn)基因株系15株，反義表達轉(zhuǎn)基因株系18株（圖6A，圖6B，圖7）。進而對PCR條帶比較亮的轉(zhuǎn)基因株系，提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用基因特異性引物（ERF025-qS:TTCTCAACTTCCCCAACTCA，ERF025-qS:CGACAACAGCATTCCCTC），進行熒光定量PCR。結果表明，正義和反義表達轉(zhuǎn)基因株系中均檢測到目的基因的表達，說明該基因能夠在黃瓜中正常轉(zhuǎn)錄（圖8）。因此篩選表達量相對高的3株過表達株系（3、4、13）和反義表達株系（2、4、6）進行繁育F2代，并利用F2代單株進行試驗。實施例6：轉(zhuǎn)CsERF025基因植株黃瓜果實彎曲度鑒定調(diào)查了F2代正義表達轉(zhuǎn)基因株系和反義表達轉(zhuǎn)基因株系彎曲果實比率。結果表明，“長春密刺”過表達CsERF025基因，彎瓜率與對照相比分別增加了30.30%、23.26%和20.17%，然而，反義表達植株彎曲果實比率與對照相比減少了9.7%、16.82%和14.1%（圖9A），且正義表達株系增加彎曲果實角度（圖9B）。結果表明，CsERF025基因促進黃瓜果實的彎曲度，正義達的黃瓜果實彎曲度變大，同時彎曲果實的數(shù)量增加；反義表達的黃瓜果實彎曲度變小，同時彎曲果實的數(shù)量減少。<110>東北農(nóng)業(yè)大學<120>黃瓜CsERF025基因及其在促進黃瓜果實順直發(fā)育中的應用<160>2<210>1<211>513<212>DNA<400>1atgatcactacaaaggaatccgctgccggggtggcaaatgggtctccgagattcgtgagc60cacgtaagactaatcgaatatggctccgcacgtaagactaatcgaatatggctcggcacc120taccctacacccgaaatggctgctgctgcctacgacgtagccgcactcgcactcaagggt180tgcaatgccgttctcaacttccccaactcagttgccttctacccggttcctgcttccaca240tcccccaatgatatccgtattgctgctgctgctgccgccgcgtccaaaaaggttgatgat300caaggagaaaacagttaccataactctcactaccaatctccaccaaccaatgagtttgtc360gatgaagaagcgctgttcggaatgccaaatcttttacatgacatggctgagggaatgctg420ttgtcgcccccacgaatgaactcgtcgccgtctcgacatgattactactcgtggaattca480agtggagatggaaatctttggagctaccactag513<210>2<211>170<212>DNA<400>1mittkesaagvangsprfvshvrlieygsarktnriwlgtyptpemaaaaydvaalalkg60cnavlnfpnsvafypvpastspndiriaaaaaaaskkvddqgensyhnshyqspptnefv120deealfgmpnllhdmaegmllspprmnsspsrhdyyswnssgdgnlwsyh170當前第1頁1 2 3