本申請是申請人于2013年3月14日提交的題為“預測、診斷和治療特發(fā)性肺纖維化的方法”的中國專利申請201380027564.8的分案申請。對相關申請的交叉參考本申請要求2012年3月27日提交的美國臨時申請?zhí)?1/616,394和2012年9月28日提交的美國臨時申請?zhí)?1/707,411的優(yōu)先權，將兩個美國臨時申請都在此以其整體并入本文作為參考。序列表本申請包含已通過電子提交系統(tǒng)(efs-web)以ascii形式提交的序列表，并在此以其整體并入本文作為參考。2013年3月6日創(chuàng)建的該ascii拷貝命名為p4841r1_sequencelisting.txt，大小為22,866字節(jié)。提供用于在患者中評估特發(fā)性肺纖維化的預測的組合物、試劑盒和方法。此外，提供用于診斷特發(fā)性肺纖維化的亞型的組合物、試劑盒和方法。還提供用于治療特發(fā)性肺纖維化的方法。
背景技術：
：特發(fā)性肺纖維化(ipf)是表征為肺實質的進行性間質性纖維化的限制性肺疾病，在美國影響約100,000患者(raghu等,amjrespircritcaremed174:810-816(2006))。這種與ipf相關的間質性纖維化導致肺功能的進行性喪失，在大多數(shù)患者中由于引起呼吸衰竭而導致死亡。從診斷的時間起存活中位數(shù)為2-3年(raghu等,amjrespircritcaremed183:788-824(2011))。ipf的病因學及關鍵分子和病理生理學因素(driver)未知。顯示在ipf患者中延長存活的唯一治療是肺移植(thabut等,annalsofinternalmedicine151:767-774(2009))。但是，肺移植與很高的發(fā)病率相關，并非所有ipf患者都是合適的肺移植候選者，且適宜的供體肺相對稀缺。盡管進行了許多嘗試，迄今沒有藥物治療在ipf患者中的隨機化、安慰劑對照干預試驗中顯示實質性延長存活，但一些干預似乎在一些患者中降低了肺功能衰退的速率(raghu等,amjrespircritcaremed183:788-824(2011)；richeldi等,thenewenglandj.ofmed.365:1079-1087(2011)；rafii等,j.thorac.dis.5(1):48-73(2013))。雖然所有ipf患者的預測都是可怕的，但疾病軌跡存在很大的異質性(raghu等,amjrespircritcaremed183:788-824(2011))。一些患者顯示相對無痛的病程，在長達10年或更長的時間內以相對恒定的速率喪失肺功能，而其他患者經(jīng)歷更快速的肺功能衰退，在診斷的一年或兩年內死亡。此外，一些患者遭受疾病的急性加重，通常表征為肺功能突然急劇下降。通常，這些患者在急性事件后未完全恢復，且常在加重期間或加重后短時間內死亡。疾病軌跡的這種異質性表明，不同的ipf患者可以具有潛藏在其疾病之下的不同的病理生理學因素，其可能對分子靶向治療具有不同的敏感性。僅提出了用幾種臨床或生物學標志作為候選物來從單個時間點預測ipf患者的疾病軌跡(ley等,amjrespircritcaremed183:431-440(2011)；ley等,amjrespircritcaremed185:6-7(2012))。已最令人信服地將減少的存活與肺功能隨時間喪失的速率相聯(lián)系，與具有更穩(wěn)定的用力肺活量(fvc)的患者相比，在6個月的時期內喪失>10％的fvc的患者具有短得多的后續(xù)存活時間(collard等,amjrespircritcaremed168:538-542(2003))。將超過1100名患者招募入隨機臨床試驗的一項更大的研究發(fā)現(xiàn)，5-10％的24周fvc下降與隨后一年中增加的超過2倍的死亡率風險相關，而>10％的下降與隨后一年中增加的近5倍的死亡率風險相關(dubois等,amjrespircritcaremed184:1382-1389(2011))。但是，用這種評估來分層招募入臨床研究的患者的劣勢是六個月的試運轉期。已報到了在單個時間點測量的某些外周血生物標志可預測存活或疾病進展，包括mmp7、il-8、icam1、vcam1、s100a12(richards等,amjrespircritcaremed,doi:10.1164/rccm.201101-0058oc(2011))、kl-6(yokoyama等,respirology11:164-168(2006))、ccl18(prasse等,amjrespircritcaremed179:717-723(2009))、ykl-40(korthagen等,respiratorymedicine105:106-113(2011))和表面活性蛋白(kinder等,chest135:1557-1563(2009))。但是，這些生物標志研究中的許多是在無重復的小群組中進行的，且利用了次優(yōu)、不一致和/或未驗證的生物標志檢測技術。由于對可靶向的分子機制的理解有限、疾病軌跡的可變性及在未經(jīng)選擇的ipf患者群體中進行存活研究的時間和花費，設計適當有力的臨床研究來評估候選治療劑在ipf中延長存活的潛力極具挑戰(zhàn)。鑒定潛在的可靶向途徑的活性并提供對隨后的疾病進展的準確預測的生物標志將有助于適當?shù)胤謱痈深A試驗中的招募者，以更好地評估研究的藥物候選物的治療價值。因此，存在對更有效的方法的需要，所述方法用于確定哪些患者將比其他患者更快地進展或哪些患者與中位數(shù)相比將具有縮短的存活時間，及用于將這些測定結果并入更有效的臨床試驗設計和ipf患者的治療方案。因此，具有其他預測和診斷方法(包括基于分子的預測和診斷方法)將高度有利，該方法可以用來客觀地鑒定疾病在患者中的存在和/或對患者中的疾病分類，限定ipf的病理生理方面、臨床活性和預測，包括存活的預測。此外，具有與疾病的多種臨床指示劑(indicator)和/或病理生理指示劑和/或其他生物學指示劑相關的基于分子的診斷和預測標志將是有利的。因此，存在鑒定與ipf以及其他限制性肺病癥相關的新的分子生物標志的持續(xù)需要。本文所述的發(fā)明滿足上述需要，并提供其他益處。白細胞介素(il)-13是多效t輔助細胞亞類2(th2)細胞因子。與il4一樣，il13隸屬于i型細胞因子家族，該家族共有由4α-螺旋疏水束核心限定的三級結構。il13與il4具有約30％氨基酸序列同源性，且共有il4的許多特性(wynn,ann.rev.immunol.,21:425(2003))。il4和il13的功能相似性歸因于這樣的事實，il13可以在與il13受體α鏈-1(il13rα1)結合后結合il4受體α鏈(il4r-α)(hershey,j.allergyclin.immunol.,111:677(2003))。il4和il13激活il4rα，導致jak1依賴性stat6磷酸化。il4和il13與cd40/cd40l共刺激組合促進b細胞增殖，并誘導類別轉換至igg4和ige(punnonen等,proc.natl.acad.sci.usa,90:3730(1993)；oettgen等,j.allergyclin.immunol.,107:429(2001))。但是，與il4不一樣，il13不涉及幼稚t細胞分化為th2細胞(zurawski等,immunol.today,15:19(1994))。il13上調fcεri，從而有助于肥大細胞的ige引發(fā)(devries,allergyclin.immunol.102:165(1998)。在單核細胞/巨噬細胞中，il13上調cd23及mhci類和ii類抗原的表達，下調fcγ和cd14的表達，并抑制抗體依賴性細胞毒性(dewaalmalefyt等,j.immunol.,151:6370(1993)；chomarat等,int.rev.immunol.,17:1(1998))。il13(而不是il4)促進嗜酸性粒細胞存活、活化和募集(horie等,intern.med.,36:179(1997)；luttmann等,j.immunol.157:1678(1996)；pope等,j.allergyclin.immunol.,108:594(2001))。il13還表現(xiàn)對非造血細胞，諸如平滑肌細胞、上皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞的重要作用。il13增強平滑肌的增殖和膽堿能誘導的收縮(wills-karp,j.allergyclin.immunol.,107:9(2001)。在上皮細胞中，il13是趨化因子產生的有效誘導物(li等,j.immunol.,162:2477(1999))，改變黏膜纖毛分化(laoukilietal.,j.clin.invest.,108:1817(2001))，減小纖毛上皮細胞的纖毛擺動頻率(laoukili等,j.clin.invest.,108:1817(2001))，并導致杯形細胞組織轉化(zhu等,j.clin.invest.,103:779(1999)；grunig等,science,282:2261(1998))。在內皮細胞中，il13是對募集嗜酸性粒細胞重要的血管細胞黏附分子1(vcam-1)的有效誘導物(bochner等,j.immunol.,154:799(1995))。在人皮膚成纖維細胞中，il13在人皮膚成纖維細胞中誘導1型膠原合成(roux等,j.invest.dermatol.,103:444(1994))。之前已描述過il-13拮抗劑，包括抗-il-13抗體。見例如國際專利申請公開號wo2005/062967。已將這類抗體發(fā)展為人類治療劑。用一種抗-il-13抗體lebrikizumab進行的一項臨床研究的結果已描述于corren等,newengl.j.med.365:1088-1098(2011)中。本文引用的所有參考文獻(包括專利申請和公開)為了所有目的以其整體并入本文作為參考。發(fā)明概述本發(fā)明的組合物和方法至少部分基于特發(fā)性肺纖維化(ipf)的至少三種新且不同的分子表型(本文中也稱為分子亞型)。本文所述的ipf分子亞型根據(jù)亞型間的差別基因表達來定義。此外，本發(fā)明的組合物和方法至少部分基于可預測ipf患者的存活的血清或血液生物標志的鑒定。這類生物標志尤其用于鑒定和選擇按照本發(fā)明的方法進行治療性處理的ipf患者。術語“分子表型”和“分子亞型”在本文中可互換使用。因此，在一方面，提供預測或輔助預測特發(fā)性肺纖維化(ipf)的方法。在某些實施方案中，從該患者獲得生物樣品，并測量基因或基因組合的表達，或由該基因編碼的蛋白質或基因組合編碼的蛋白質組合的表達。在某些實施方案中，該基因或基因組合提高的表達水平或由該基因編碼的蛋白質或基因組合編碼的蛋白質組合提高的表達指示與存活中位數(shù)相比縮短的存活的預測。在某些實施方案中，該基因或基因組合降低的表達或由該基因編碼的蛋白質或基因組合編碼的蛋白質組合降低的表達指示與存活中位數(shù)相比增加的存活的預測。在一個實施方案中，該基因或基因組合選自表2、表3、表4或表5中的任一個。在一個實施方案中，該基因或基因組合選自mucl1、muc4、muc20、prr7、prr15、sprr1b、sprr2d、krt5、krt6b、krt13、krt14、krt15、krt17、serpinb3、serpinb4、serpinb5、serpinb13、clca2、trpv4、bbs5、mmp3和saa4。在一個實施方案中，該基因或基因組合選自cxcr3、cxcr5、cxcl13、ccr6、ccr7、cd19、ms4a1(cd20)、blk、blnk、fcrla、fcrl2、fcrl5、cd79a、cd79b、cd27、cd28、cd1a、cd1b、cd1c、cd1e、ighv1-69、iglj3、igj、ighv3-48、iglv3-21、igkv1-5、ighg1、igkc、iglv6-57、igk@、igha1、igkv2-24、igkv1d-8和ighm。在一個實施方案中，該基因或基因組合選自col1a1、col1a2、col5a2、col12a1、col14a1、col15a1、col16a1、col18a1、cthrc1、hgf、igfbp7、scgf(clec11a)；loxl1、loxl2；gli1、gli2、smo；sfrp2、dio2、cdh11、postn和tgfb3。在某些實施方案中，通過測定mrna水平來測量基因表達水平。在某些實施方案中，該測定包括pcr法和/或使用微列陣芯片。在一個實施方案中，該pcr法是qpcr。在一個實施方案中，該pcr法是多重pcr。在某些實施方案中，試劑盒包括至少一種選自核酸酶、連接酶和聚合酶的酶。在某些實施方案中，通過免疫測定法來測量該蛋白質表達水平。在某些實施方案中，提供免疫測定試劑盒，該免疫測定試劑盒包含一種或多種抗體，其與由上文鑒定的基因之一編碼的一種或多種蛋白質結合。在以上方法的另一實施方案中，該基因或基因組合選自chi3l1(ykl-40)、ccl11、ccl13、ccl17、ccl18、comp、cxcl13、mmp3、mmp7、saa4(組成型saa)、postn和andspp1(opn)。在另一實施方案中，該基因或基因組合選自ykl-40、ccl11、ccl13、ccl17、ccl18、mmp7、cxcl13、comp、saa和opn。在另一實施方案中，該基因或基因組合選自saa、mmp3、cxcl13、opn、comp和ykl-40。在另一實施方案中，該基因或基因組合選自postn、mmp3和cxcl13。在另一實施方案中，測量ykl-40的表達水平或ccl18的表達水平和/或cxcl13的表達水平。在另一實施方案中，測量mmp3的表達水平和/或saa的表達水平。在某些實施方案中，通過測定mrna水平來測量該基因表達水平。在某些實施方案中，該測定包括pcr法和/或使用微列陣芯片。在一個實施方案中，該pcr法是qpcr。在一個實施方案中，該pcr法是多重pcr。在某些實施方案中，試劑盒包括至少一種選自核酸酶、連接酶和聚合酶的酶。在某些實施方案中，通過免疫測定法來測量該蛋白質表達水平。在某些實施方案中，提供免疫測定試劑盒，該免疫測定試劑盒包含一種或多種抗體，其與由上文鑒定的基因之一編碼的一種或多種蛋白質結合。在上述方法的某些實施方案中，該患者正進行免疫調節(jié)治療。在另一實施方案中，該生物樣品選自肺組織、血清和血漿。在一方面，通過微列陣來測量上述方法的基因表達。在另一方面，通過實時定量聚合酶鏈反應(qpcr)來測量基因表達。在另一方面，通過多重pcr來測量基因表達。根據(jù)另一實施方案，通過觀察上述基因中的一個或多個的蛋白質表達水平來測量基因表達。根據(jù)另一實施方案，如果目的基因的相對mrna水平比健康對照或參照基因mrna水平高2倍，則認為與健康對照或參照個體相比，目的基因的表達提高。根據(jù)另一實施方案，與健康對照或參照基因表達水平相比，目的基因的相對mrna水平高3倍、10倍、15倍、20倍、25倍或30倍。在一方面，通過選自pcr法、微列陣法或免疫測定法的方法來測量該基因表達水平。在一個實施方案中，該微列陣法包括使用微列陣芯片，該微列陣芯片具有一種或多種可以在嚴格條件下與編碼上文提到的基因的核酸分子雜交，或具有一種或多種多肽(如肽或抗體)，其可以與由上文提到的基因編碼的一種或多種蛋白質結合。在一個實施方案中，該pcr法是qpcr。在一個實施方案中，該pcr法是多重pcr。根據(jù)一個實施方案，該免疫測定法包括使抗體與在患者樣品中的從上文提到的基因表達的蛋白質結合，并測定來自該患者樣品的蛋白質水平是否提高。在某些實施方案中，該免疫測定法是酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)。在另一方面，提供在患者中預測或輔助預測ipf的方法，其中從該患者獲得生物樣品，并測定總基線生物標志得分。在某些實施方案中，該總基線生物標志得分的測定包括測量cxcl13、opn和comp中至少一個的蛋白質表達水平，如果該表達水平分別低于cxcl13、opn和comp的中位數(shù)，則指定0的得分，如果該表達水平分別高于cxcl13、opn和comp的中位數(shù)，則指定1的得分，其中該總基線生物標志得分的測定進一步包括測量ykl-40的蛋白質表達水平，如果該表達水平低于ykl-40的中位數(shù)，則指定0的得分，如果該表達水平高于ykl-40的中位數(shù)，則指定1的得分，其中該總基線生物標志得分的測定進一步包括將每一單個得分相加來獲得總基線生物標志得分。在某些實施方案中，2或2以上的總基線生物標志得分指示與存活中位數(shù)相比縮短的存活的預測。在某些實施方案中，0或1的總基線生物標志得分指示與存活中位數(shù)相比增加的存活的預測。在某些實施方案中，通過免疫測定法來測量該蛋白質表達水平。在某些實施方案中，提供免疫測定試劑盒，該免疫測定試劑盒包含一種或多種抗體，其與由cxcl13、opn、comp和/或ykl-40編碼的一種或多種蛋白質結合。還在另一方面，如果按上文所述測定的患者的總基線生物標志得分為2或2以上，則在臨床研究中選擇用候選治療劑治療該患者。在某些實施方案中，該候選治療劑選自抗-il-13劑、抗-il-4劑、抗-il-13/抗-il-4劑的組合、吡非尼酮、抗-loxl2抗體(gs-6624)、n-乙酰半胱氨酸、抗-tgf-β抗體(gc1008)、抗-αvβ6整聯(lián)蛋白抗體(stx-100)、抗-ctgf抗體(fg-3019)、抗-ccl2抗體(cnto888)、生長抑素類似物(som230，奧曲肽)、antiotensinii抑制劑(氯沙坦)、一氧化碳、沙利度胺、四硫鉬酸鹽、多西環(huán)素、米諾環(huán)素和酪氨酸激酶抑制劑(bibf1120)。在一個實施方案中，該抗-il-13劑是lebrikizumab。在一個實施方案中，該抗-il-13/抗-il-4劑是雙特異性抗體。在一個實施方案中，該抗-il-13劑是包含三個重鏈cdr和三個輕鏈cdr的抗-il-13抗體，所述三個重鏈cdr是具有seqidno.:1的氨基酸序列的cdr-h1、具有seqidno.:2的氨基酸序列的cdr-h2和具有seqidno.:3的氨基酸序列的cdr-h3，所述三個輕鏈cdr是具有seqidno.:4的氨基酸序列的cdr-l1、具有seqidno.:5的氨基酸序列的cdr-l2和具有seqidno.:6的氨基酸序列的cdr-l3。在一個實施方案中，該抗-il-13抗體包含具有seqidno.:7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有seqidno.:9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，該抗-il-13抗體包含具有seqidno.:10的氨基酸序列的重鏈和具有seqidno.:14的氨基酸序列的輕鏈。在某些實施方案中，提供治療ipf患者的方法，如果該患者具有按照上述方法測定的2或2以上的基線得分，那么施用有效量的上文提供的ipf治療劑。在另一方面，提供在患者中預測或輔助預測ipf的方法，其中從該患者獲得生物樣品并測定總基線生物標志得分，其中該總基線生物標志得分的測定包括測量mmp3和comp中至少一個的蛋白質表達水平，如果該表達水平分別低于mmp3和comp的中位數(shù)，則指定0的得分，如果該表達水平分別高于mmp3和comp的中位數(shù)，則指定1的得分，其中該總基線生物標志得分的測定進一步包括測量ykl-40的蛋白質表達水平，如果該表達水平低于ykl-40的中位數(shù)，則指定0的得分，如果該表達水平高于ykl-40的中位數(shù)，則指定1的得分，且其中該總基線生物標志得分的測定進一步包括將每一單個得分相加來獲得總基線生物標志得分。在某些實施方案中，1或1以上的總基線生物標志得分指示與存活中位數(shù)相比縮短的存活的預測。在某些實施方案中，0的總基線生物標志得分指示與存活中位數(shù)相比增加的存活的預測。在某些實施方案中，通過免疫測定法來測量該蛋白質表達水平。在某些實施方案中，提供免疫測定試劑盒，該免疫測定試劑盒包含一種或多種抗體，其與由mmp3、comp和/或ykl-40編碼的一種或多種蛋白質結合。還在另一方面，如果按上文所述測定mmp3、comp和/或ykl-40的表達的患者的總基線生物標志得分為1或1以上，那么在臨床研究中選擇用候選治療劑治療該患者。在某些實施方案中，該候選治療劑選自抗-il-13劑、抗-il-4劑、抗-il-13/抗-il-4劑的組合、吡非尼酮、抗-loxl2抗體(gs-6624)、n-乙酰半胱氨酸、抗-tgf-β抗體(gc1008)、抗-αvβ6整聯(lián)蛋白抗體(stx-100)、抗-ctgf抗體(fg-3019)、抗-ccl2抗體(cnto888)、生長抑素類似物(som230，奧曲肽)、antiotensinii抑制劑(氯沙坦)、一氧化碳、沙利度胺、四硫鉬酸鹽、多西環(huán)素、米諾環(huán)素和酪氨酸激酶抑制劑(bibf1120)。在一個實施方案中，該抗-il-13劑是lebrikizumab。在一個實施方案中，該抗-il-13/抗-il-4劑是雙特異性抗體。在一個實施方案中，該抗-il-13劑是包含三個重鏈cdr和三個輕鏈cdr的抗-il-13抗體，所述三個重鏈cdr是具有seqidno.:1的氨基酸序列的cdr-h1、具有seqidno.:2的氨基酸序列的cdr-h2和具有seqidno.:3的氨基酸序列的cdr-h3，所述三個輕鏈cdr是具有seqidno.:4的氨基酸序列的cdr-l1、具有seqidno.:5的氨基酸序列的cdr-l2和具有seqidno.:6的氨基酸序列的cdr-l3。在一個實施方案中，該抗-il-13抗體包含具有seqidno.:7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有seqidno.:9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，該抗-il-13抗體包含具有seqidno.:10的氨基酸序列的重鏈和具有seqidno.:14的氨基酸序列的輕鏈。在某些實施方案中，提供治療ipf患者的方法，如果該患者具有按照上述方法測定的1或1以上的基線得分，那么施用有效量的上文提供的ipf治療劑。另一方面，提供在個體中診斷ipf的分子亞型的方法。在某些實施方案中，該方法包括測量從所述受試者獲得的生物樣品中基因或基因組合的表達，或由該基因編碼的蛋白質或基因組合編碼的蛋白質組合的表達。在某些實施方案中，該基因或基因組合選自mucl1、muc4、muc20、prr7、prr15、sprr1b、sprr2d、krt5、krt6b、krt13、krt14、krt15、krt17、serpinb3、serpinb4、serpinb5、serpinb13、clca2、trpv4、bbs5、mmp3和saa4，該基因或基因組合提高的表達或該蛋白質或蛋白質組合提高的表達指示ipf分子亞型。在某些實施方案中，該基因或基因組合選自cxcr3、cxcr5、cxcl13、ccr6、ccr7、cd19、ms4a1(cd20)、tnfrsf17(bcma)、blk、blnk、fcrla、fcrl2、fcrl5、cd79a、cd79b、cd27、cd28、cd1a、cd1b、cd1c、cd1e、ighv1-69、iglj3、igj、ighv3-48、iglv3-21、igkv1-5、ighg1、igkc、iglv6-57、igk@(免疫球蛋白κ基因座)、igha1、igkv2-24、igkv1d-8和ighm，該基因或基因組合提高的表達或該蛋白質或蛋白質組合提高的表達指示ipf分子亞型。在某些實施方案中，該基因或基因組合選自col1a1、col1a2、col5a2、col12a1、col14a1、col15a1、col16a1、col18a1、cthrc1、hgf、igfbp7、scgf(clec11a)、loxl1、loxl2；gli1、gli2、smo、sfrp2、dio2、cdh11、postn和tgfb3，該基因或基因組合提高的表達或該蛋白質或蛋白質組合提高的表達指示ipf分子亞型。在某些實施方案中，通過測定mrna水平來測量該基因表達水平。在某些實施方案中，該測定包括pcr法和/或使用微列陣芯片。在一個實施方案中，該pcr法是qpcr。在一個實施方案中，該pcr法是多重pcr。在某些實施方案中，試劑盒包括至少一種選自核酸酶、連接酶和聚合酶的酶。在某些實施方案中，通過免疫測定法來測量該蛋白質表達水平。在某些實施方案中，提供免疫測定試劑盒，該免疫測定試劑盒包含一種或多種抗體，其與由上文鑒定的基因之一編碼的一種或多種蛋白質結合。在另一方面，用于以上方法中任一種的生物樣品是肺組織、全血或血清。在某些實施方案中，該生物樣品是肺組織或全血，用pcr法或微列陣芯片測量該基因或基因組合的表達。在某些實施方案中，該生物樣品是血清，用免疫測定法測量該蛋白質或蛋白質組合的表達。還在另一方面，提供在患者中治療ipf的方法。在某些實施方案中，如果在從該患者獲得的生物樣品中檢測到基因或基因組合提高的表達，或由該基因編碼的蛋白質或基因組合編碼的蛋白質組合的提高的表達，那么該方法包括對該患者施用有效量的ipf治療劑來治療ipf。在一個實施方案中，該基因或基因組合選自mucl1、muc4、muc20、prr7、prr15、sprr1b、sprr2d、krt5、krt6b、krt13、krt14、krt15、krt17、serpinb3、serpinb4、serpinb5、serpinb13、clca2、trpv4、bbs5、mmp3和saa4。在一個實施方案中，該基因或基因組合選自cxcr3、cxcr5、cxcl13、ccr6、ccr7、cd19、ms4a1(cd20)、tnfrsf17(bcma)、blk、blnk、fcrla、fcrl2、fcrl5、cd79a、cd79b、cd27、cd28、cd1a、cd1b、cd1c、cd1e、ighv1-69、iglj3、igj、ighv3-48、iglv3-21、igkv1-5、ighg1、igkc、iglv6-57、igk@(免疫球蛋白κ基因座)、igha1、igkv2-24、igkv1d-8和ighm。在一個實施方案中，該基因或基因組合選自col1a1、col1a2、col5a2、col12a1、col14a1、col15a1、col16a1、col18a1、cthrc1、hgf、igfbp7、scgf(clec11a)；loxl1、loxl2；gli1、gli2、smo、sfrp2、dio2、cdh11、postn和tgfb3。在另一實施方案中，該基因或基因組合選自chi3l1(ykl-40)、ccl11、ccl13、ccl17、ccl18、comp、cxcl13、mmp3、mmp7、saa4(組成型saa)、postn和andspp1(opn)。在另一實施方案中，該基因或基因組合選自ykl-40、ccl11、ccl13、ccl17、ccl18、mmp7、cxcl13、comp、saa和opn。在另一實施方案中，該基因或基因組合選自saa、mmp3、cxcl13、opn、comp和ykl-40。在另一實施方案中，該基因或基因組合選自postn、mmp3和cxcl13。在另一實施方案中，測量ykl-40的表達水平或ccl18的表達水平和/或cxcl13的表達水平。在另一實施方案中，測量mmp3的表達水平和/或saa的表達水平。在某些實施方案中，通過測定mrna水平來測量該基因表達水平。在某些實施方案中，該測定包括pcr法和/或使用微列陣芯片。在一個實施方案中，該pcr法是qpcr。在一個實施方案中，該pcr法是多重pcr。在某些實施方案中，試劑盒包括至少一種選自核酸酶、連接酶和聚合酶的酶。在某些實施方案中，通過免疫測定法來測量該蛋白質表達水平。在某些實施方案中，提供免疫測定試劑盒，該免疫測定試劑盒包含一種或多種抗體,其與由上文鑒定的基因之一編碼的一種或多種蛋白質結合。在某些實施方案中，ipf治療劑選自抗-il-13劑、抗-il-4劑、抗-il-13/抗-il-4劑的組合、吡非尼酮、抗-loxl2抗體(gs-6624)、n-乙酰半胱氨酸、抗-tgf-β抗體(gc1008)、抗-αvβ6整聯(lián)蛋白抗體(stx-100)、抗-ctgf抗體(fg-3019)、抗-ccl2抗體(cnto888)、生長抑素類似物(som230，奧曲肽)、antiotensinii抑制劑(氯沙坦)、一氧化碳、沙利度胺、四硫鉬酸鹽、多西環(huán)素、米諾環(huán)素和酪氨酸激酶抑制劑(bibf1120)。在某些實施方案中，ipf治療劑是抗-il-13抗體。在一個實施方案中，該抗-il-13劑是包含三個重鏈cdr和三個輕鏈cdr的抗-il-13抗體，所述三個重鏈cdr是具有seqidno.:1的氨基酸序列的cdr-h1、具有seqidno.:2的氨基酸序列的cdr-h2和具有seqidno.:3的氨基酸序列的cdr-h3，所述三個輕鏈cdr是具有seqidno.:4的氨基酸序列的cdr-l1、具有seqidno.:5的氨基酸序列的cdr-l2和具有seqidno.:6的氨基酸序列的cdr-l3。在一個實施方案中，該抗-il-13抗體包含具有seqidno.:7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有seqidno.:9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，該抗-il-13抗體(lebrikizumab)包含具有seqidno.:10的氨基酸序列的重鏈和具有seqidno.:14的氨基酸序列的輕鏈。在某些實施方案中，按選自125mg、250mg和500mg的單調劑量(flatdose)每四周皮下施用lebrikizumab一次。在一個實施方案中，按250mg的單調劑量每四周皮下施用lebrikizumab一次。在另一方面，按以上方法測定預測為具有縮短的存活的ipf患者之后，提供治療該ipf患者的方法。在某些這類實施方案中，施用有效量的ipf治療劑。在一個實施方案中，ipf治療劑選自抗-il-13劑、抗-il-4劑、抗-il-13/抗-il-4劑的組合、吡非尼酮、抗-loxl2抗體(gs-6624)、n-乙酰半胱氨酸、抗-tgf-β抗體(gc1008)、抗-αvβ6整聯(lián)蛋白抗體(stx-100)、抗-ctgf抗體(fg-3019)、抗-ccl2抗體(cnto888)、生長抑素類似物(som230，奧曲肽)、antiotensinii抑制劑(氯沙坦)、一氧化碳、沙利度胺、四硫鉬酸鹽、多西環(huán)素、米諾環(huán)素和酪氨酸激酶抑制劑(bibf1120)。在一個實施方案中，該抗-il-13劑是包含三個重鏈cdr和三個輕鏈cdr的抗-il-13抗體，所述三個重鏈cdr是具有seqidno.:1的氨基酸序列的cdr-h1、具有seqidno.:2的氨基酸序列的cdr-h2和具有seqidno.:3的氨基酸序列的cdr-h3，所述三個輕鏈cdr是具有seqidno.:4的氨基酸序列的cdr-l1、具有seqidno.:5的氨基酸序列的cdr-l2和具有seqidno.:6的氨基酸序列的cdr-l3。在一個實施方案中，該抗-il-13抗體包含具有seqidno.:7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有seqidno.:9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，該抗-il-13抗體(lebrikizumab)包含具有seqidno.:10的氨基酸序列的重鏈和具有seqidno.:14的氨基酸序列的輕鏈。在一個實施方案中，按選自125mg、250mg和500mg的單調劑量(flatdose)每四周皮下施用抗-il-13抗體一次。在一個實施方案中，按250mg的單調劑量每四周皮下施用抗-il-13抗體一次。生長抑素類似物還在另一方面，與無治療相比，上述用抗-il-13抗體或lebrikizumab治療ipf患者的方法延長了發(fā)展至疾病進展的時間，其中疾病進展顯示為以下一項或多項的首次發(fā)生：(i)死亡；(ii)非選擇性住院；(iii)fvc從基線減少10％或更多。在一個實施方案中，疾病進展進一步顯示為第52周時dlco從基線減少≥15％。在一個實施方案中，上述抗-il-13抗體或lebrikizumab治療導致治療52周后dlco從基線減少小于15％。在一個實施方案中，與無治療相比，這種治療導致治療52周后患者在6分鐘步行測試中的行走距離從基線下降的更少。在一個實施方案中，行走距離從基線下降的減少量大于50米、或大于30米、或大于10米。在某些實施方案中，與無治療相比，該治療延長了首次出現(xiàn)急性ipf加重事件或首次出現(xiàn)ipf惡化事件的時間。在一方面，提供通過施用抗-il-13抗體或lebrikizumab以在ipf患者中延長發(fā)展至疾病進展的時間的方法。在某些實施方案中，疾病進展顯示為以下一項或多項的首次發(fā)生：(i)死亡；(ii)非選擇性住院；(iii)fvc從基線減少10％或更多。在一個實施方案中，疾病進展進一步顯示為第52周時dlco從基線減少≥15％。在一個實施方案中，上述抗-il-13抗體或lebrikizumab治療導致治療52周后dlco從基線減少小于15％。在一個實施方案中，與無治療相比，這種治療導致治療52周后患者在6分鐘步行測試中的行走距離從基線下降的更少。在一個實施方案中，行走距離從基線下降的減少量大于50米、或大于30米、或大于10米。在某些實施方案中，與無治療相比，該治療延長了發(fā)展至首次急性ipf加重事件或首次ipf惡化事件的時間。還在另一方面，提供在ipf患者中監(jiān)測疾病進展的方法。在某些實施方案中，該方法包括在第一時間點及一個或多個其他時間點從該患者獲得生物樣品，并測量該生物樣品中基因或基因組合的表達，或由該基因編碼的蛋白質或基因組合編碼的蛋白質組合的表達，其中該基因或基因組合選自表2、表3、表4或表5中的任一個，其中表達水平從該第一時間點至該一個或多個其他時間點的變化指示疾病進展。在一個實施方案中，該基因或基因組合或該蛋白質或蛋白質組合選自mucl1、muc4、muc20、prr7、prr15、sprr1b、sprr2d、krt5、krt6b、krt13、krt14、krt15、krt17、serpinb3、serpinb4、serpinb5、serpinb13、clca2、trpv4、bbs5、mmp3和saa4。在一個實施方案中，該基因或基因組合選自cxcr3、cxcr5、cxcl13、ccr6、ccr7、cd19、ms4a1(cd20)、blk、blnk、fcrla、fcrl2、fcrl5、cd79a、cd79b、cd27、cd28、cd1a、cd1b、cd1c、cd1e、ighv1-69、iglj3、igj、ighv3-48、iglv3-21、igkv1-5、ighg1、igkc、iglv6-57、igk@、igha1、igkv2-24、igkv1d-8和ighm。在一個實施方案中，該基因或基因組合或該蛋白質或蛋白質組合選自col1a1、col1a2、col5a2、col12a1、col14a1、col15a1、col16a1、col18a1、cthrc1、hgf、igfbp7、scgf(clec11a)、loxl1、loxl2、gli1、gli2、smo、sfrp2、dio2、cdh11、postn和tgfb3。在一個實施方案中，該基因或基因組合或該蛋白質或蛋白質組合選自chi3l1(ykl-40)、ccl11、ccl13、ccl17、ccl18、comp、cxcl13、mmp3、mmp7、saa4(組成型saa)、postn和andspp1(opn)。在某些實施方案中，生物樣品選自肺組織、血清和血漿。在某些實施方案中，通過測定mrna水平來測量該基因表達水平。在某些實施方案中，該測定包括pcr法和/或使用微列陣芯片。在一個實施方案中，該pcr法是qpcr。在一個實施方案中，該pcr法是多重pcr。在某些實施方案中，試劑盒包括至少一種選自核酸酶、連接酶和聚合酶的酶。在某些實施方案中，通過免疫測定法來測量該蛋白質表達水平。在某些實施方案中，提供免疫測定試劑盒，該免疫測定試劑盒包含一種或多種抗體，其與由上文鑒定的基因之一編碼的一種或多種蛋白質結合。在另一方面，上述監(jiān)測疾病進展的方法進一步包括在臨床研究中用候選治療劑治療該患者。在某些實施方案中，該治療劑選自抗-il-13劑、抗-il-4劑、抗-il-13/抗-il-4劑的組合、吡非尼酮、抗-loxl2抗體(gs-6624)、n-乙酰半胱氨酸、抗-tgf-β抗體(gc1008)、抗-αvβ6整聯(lián)蛋白抗體(stx-100)、抗-ctgf抗體(fg-3019)、抗-ccl2抗體(cnto888)、生長抑素類似物(som230，奧曲肽)、antiotensinii抑制劑(氯沙坦)、一氧化碳、沙利度胺、四硫鉬酸鹽、多西環(huán)素、米諾環(huán)素和酪氨酸激酶抑制劑(bibf1120)。在一個實施方案中，該抗-il-13劑是包含三個重鏈cdr和三個輕鏈cdr的抗-il-13抗體，所述三個重鏈cdr是具有seqidno.:1的氨基酸序列的cdr-h1、具有seqidno.:2的氨基酸序列的cdr-h2和具有seqidno.:3的氨基酸序列的cdr-h3，所述三個輕鏈cdr是具有seqidno.:4的氨基酸序列的cdr-l1、具有seqidno.:5的氨基酸序列的cdr-l2和具有seqidno.:6的氨基酸序列的cdr-l3。在一個實施方案中，該抗-il-13抗體包含具有seqidno.:7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有seqidno.:9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，該抗-il-13抗體包含具有seqidno.:10的氨基酸序列的重鏈和具有seqidno.:14的氨基酸序列的輕鏈。附圖簡述圖1顯示實施例1中所述的ipf患者中的基因表達異質性。(a)ipf和對照之間2490個de微列陣探針的無監(jiān)督雙向分層聚簇分析(unsupervised2-wayhierarchicalclustering)顯示主要由ipf的診斷定義的三個主要聚簇(cluster)(組1聚簇、組2聚簇和組3聚簇)；(b)組1聚簇的重新聚簇鑒定出異質性基因表達特征，其中大多數(shù)ipf患者(和少數(shù)對照)表達高水平的細支氣管上皮基因特征(“細支氣管特征”)；(c)組2聚簇的重新聚簇鑒定出異質性基因表達特征，其中大多數(shù)ipf患者(對照中沒有一個)表達高水平的淋巴小結基因特征(“淋巴特征”)；(d)組3聚簇的重新聚簇鑒定出異質性基因表達特征，其中ipf患者表達中等水平和高水平的成纖維細胞分化為肌成纖維細胞的基因特征，而對照個體表達低水平的該基因特征(“成纖維細胞特征”，本文中也稱為“肌成纖維細胞特征”)；(e)顯示細支氣管、淋巴和肌成纖維細胞基因表達特征未隨彼此共變的圖。圖2顯示從ipf肺外植塊取下的活檢組織的鄰近冰凍切片上的免疫組織化學(ihc)，如實施例1中所述。(a)蘇木精和伊紅(h&e)染色；(b)三色染色；(c)抗-角蛋白14染色；(d)過碘酸希夫(pas)染色；(e)h&e染色顯示具有染色深的細胞核的細胞聚集體(箭頭)；(f)三色染色顯示膠原沉積在聚集體周圍而不存在于聚集體內(箭頭)；(g)抗-cd20染色顯示聚集體具有高濃度的cd20陽性b細胞；(h)(g)中用(*)標記的區(qū)域的更高放大倍數(shù)；(i)細支氣管化囊腫的抗-角蛋白14染色；(j)集合淋巴結的抗-cd20染色。圖3顯示通過qpcr測量的候選生物標志基因在獲自ipf患者和獲自對照的肺組織中的基因表達，如實施例1中所述。(a)骨膜蛋白(periostin)基因表達；(b)ccl13基因表達；(c)ccl18基因表達；(d)骨橋蛋白基因表達；(e)comp基因表達；(f)ykl-40基因表達；(g)mmp7基因表達。圖4顯示如實施例1中所述的在中位數(shù)水平(69％)預測的按fvc百分比分層的ipf存活。圖5顯示如實施例1中所述的用于ipf存活的單個和組合的預測生物標志的cox模型。(a)按血清cxcl13水平分層的ipf存活的cox模型；(b)按血清ykl-40水平分層的ipf存活的cox模型；(c)按血清comp水平分層的ipf存活的cox模型；(d)按血清opn水平分層的ipf存活的cox模型。圖6顯示實施例1中所述的六種生物標志(saa、mmp3、cxcl13、opn、comp和ykl-40)可能的組合的受者作用特征(roc)分析。(a)所示六種生物標志的每種可能組合的roc分析來預測采集樣品后1、2和3年內的死亡率；(b)兩年時roc分析的曲線下面積及六種生物標志(saa、mmp3、cxcl13、opn、comp和ykl-40)的所有可能組合的期限顯著性(termsignificance)。圖7顯示如實施例1中所述，按ykl-40加opn加comp加cxcl13的組合的基線生物標志得分分層的ipf存活的組合cox模型。圖8顯示如實施例1中所述，表達高于生物標志mmp3、comp和ykl-40中的零個、一個、兩個或全部三個的中位數(shù)水平的ipf患者的kaplan-meier存活圖。圖9顯示如實施例2中所述，來自對照患者(左側)和來自ipf患者(右側)的肺組織中il-13ra2表達的定量pcr結果。圖10顯示如實施例2中所述，il-4或il-13誘導imr90原代肺成纖維細胞中的il13rα2表達。圖11顯示如實施例2中所述，tnfα對il13rα2表達(a)及在存在或缺乏il-13的情況下對ccl26和骨膜蛋白表達(b)的影響。圖12顯示用tnfα預處理，然后進行圖中所示和實施例2中所述的多種il-13和/或il-4細胞因子和封閉性抗-il-13mab1和/或mab2抗體處理的imr90細胞中ccl26和骨膜蛋白(postn)的基因表達水平。圖13顯示如實施例2中所述，來自用il-13(a)或用il-13和il-4(b)處理，然后進一步用抗-il-13mab2或抗-il-13mab2處理的imr90細胞的微列陣數(shù)據(jù)。圖14顯示實施例2中所述的ipf群組中的gli1表達。圖15顯示原代肺成纖維細胞(培養(yǎng)在基質膠上)中響應實施例2中所述的多種加入的因子的gli1基因表達。圖16顯示原代肺成纖維細胞(培養(yǎng)在基質膠上)中響應圖中所示和實施例2中所述的多種加入的因子的tgfβ1基因表達(a)和gli1基因表達(b)。發(fā)明詳述某些定義除非另有定義，本文中所用的所有技術術語、注釋和其他科學術語具有本發(fā)明所屬領域的技術人員通常理解的含義。在一些情況下，為了清楚和/或為了即時參考而在本文中定義具有通常理解的含義的術語，本文中這類定義的納入不應解釋為代表與本領域的通常理解的實質性差異。本文中描述或參考的技術和方法通常為本領域技術人員熟知，且通常用常規(guī)方法利用，例如sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual第2版(1989)coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.中所述的廣泛利用的分子克隆方法。適當時，除非另有說明，涉及使用市售試劑盒和試劑的方法通常按照廠家定義的方案和/或參數(shù)進行?！凹氈夤芑蛱卣鳌?、“細支氣管特征”和“細支氣管基因表達特征”在本文中可互換使用，指表2中所示的基因的組合或次組合(subcombination)，其基因表達模式與某些ipf患者相關。該基因包括mucl1、muc4、muc20、prr7、prr15、sprr1b、sprr2d、krt5、krt6b、krt13、krt14、krt15、krt17、serpinb3、serpinb4、serpinb5、serpinb13、clca2、trpv4、bbs5、mmp3、saa4(編碼組成型saa)。細支氣管基因特征的多肽是本文所述的“靶向的多肽”。“淋巴基因特征”、“淋巴特征”和“淋巴基因表達特征”、淋巴小結基因特征”、“淋巴小結特征”和“淋巴小結基因表達特征”在本文中可互換使用，指表3中所示的基因的組合或次組合，其基因表達模式與某些ipf患者相關。該基因包括cxcr3、cxcr5、cxcl13、ccr6、ccr7、cd19、ms4a1(cd20)、tnfrsf17(bcma)、blk、blnk、fcrla、fcrl2、fcrl5、cd79a、cd79b、cd27、cd28、cd1a、cd1b、cd1c、cd1e、ighv1-69、iglj3、igj、ighv3-48、iglv3-21、igkv1-5、ighg1、igkc、iglv6-57、igk@(免疫球蛋白κ基因座)、igha1、igkv2-24、igkv1d-8和ighm。淋巴小結基因特征的多肽是本文所述的“靶向的多肽”?！凹〕衫w維細胞基因特征”、“肌成纖維細胞特征”和“肌成纖維細胞基因表達特征”、“成纖維細胞基因特征”、“成纖維細胞特征”和“成纖維細胞基因表達特征”在本文中可互換使用，指表4中所示的基因的組合或次組合，其基因表達模式與某些ipf患者相關。該基因包括col1a1、col1a2、col5a2、col12a1、col14a1、col15a1、col16a1、col18a1、cthrc1、hgf、igfbp7、scgf(clec11a)、loxl1、loxl2；gli1、gli2、smo、sfrp2、dio2、cdh11、postn和tgfb3。肌成纖維細胞基因特征的多肽是本文所述的“靶向的多肽”。在本文中使用時，術語“靶向的多肽”指“天然序列”多肽和變體(其在本文中進一步定義)?！疤烊恍蛄小倍嚯陌ň哂信c對應的源自自然界的多肽相同的氨基酸序列的多肽。因此，術語“天然序列多肽”包括天然存在的截短、增長和移碼形式的多肽，包括但不限于選擇性剪接形式、亞型和多態(tài)性“天然存在的變體”意指與參照多肽具有至少約60％氨基酸序列同一性且保留該天然存在的參照多肽的至少一種生物學活性的多肽。天然存在的變體可以包括與參照多肽具有至少約65％氨基酸序列同一性、至少約70％氨基酸序列同一性、至少約75％氨基酸序列同一性、至少約80％氨基酸序列同一性、至少約80％氨基酸序列同一性、至少約85％氨基酸序列同一性、至少約90％氨基酸序列同一性、至少約95％氨基酸序列同一性、至少約98％氨基酸序列同一性或至少約99％氨基酸序列同一性的變異多肽。本文中可互換使用的術語“多核苷酸”或“核酸”指任意長度的核苷酸聚合物，且包括dna和rna。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或可以通過dna或rna聚合酶摻入到聚合物的任意底物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其類似物。如果存在，對核苷酸結構的修飾可以在聚合物裝配之前或之后進行。核苷酸的序列可以由非核苷酸成分中斷。多核苷酸可以在聚合后進一步修飾，如通過與標記成分綴合。其他類型的修飾包括例如“加帽”，用核苷酸類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸，核苷酸間修飾，例如具有不帶電荷的連接(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、亞磷酰胺(phosphoamidate)、氨基甲酸酯(cabamate)等)和具有帶電荷的連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，包含懸垂部分(pendantmoiety)(例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-l-賴氨酸等))的那些修飾，具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)的那些修飾，包含螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的那些修飾，包含烷化劑(alkylator)的那些修飾，具有修飾的連接的那些修飾(例如α異頭核酸等)，以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖中的任意羥基可以例如通過膦酸酯基、磷酸基取代，通過標準保護基團保護，或活化以制備與其他核苷酸的其他連接，或可以綴合至固體或半固體支持體。5’和3’端oh可以磷酸化或用1至20個碳原子的胺或有機封端基團部分取代。其他羥基也可以衍生至標準保護基團。多核苷酸還可以包含本領域公知的核糖或脫氧核糖的類似物形式，包括例如2'-o-甲基-、2'-o-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖，碳環(huán)糖類似物，α-異頭糖，差向異構糖(epimericsugar)如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，無環(huán)類似物(acyclicanalog)和無堿基核苷類似物如甲基核苷?？梢杂脗溥x的連接基團替換一個或多個磷酸二酯鍵。這些備選的連接基團包括但不限于其中用p(o)s(“硫代”)、p(s)s(“二硫代”)、(o)nr2(“酰胺化”)、p(o)r、p(o)or'、co或ch2(“formacetal”)取代磷酸的實施方案，其中每個r或r'是單獨的h或可選地包含醚(-o-)鍵的取代或未取代的烷基(1-20c)、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或araldyl。多核苷酸中的所有鍵無需相同。前面的描述適用于本文提到的所有多核苷酸，包括rna和dna。本文所用的“寡核苷酸”指短的單鏈多核苷酸，其長度為至少約7個核苷酸，且小于約250個核苷酸。寡核苷酸可以是合成的。術語“寡核苷酸”和“多核苷酸”并非相互排斥。上文針對多核苷酸的描述同等地和完全地適用于寡核苷酸。術語“引物”指單鏈多核苷酸，其能夠與核酸雜交，且通常通過提供自由3’-oh基團來允許聚合互補核酸。術語“陣列”或“微列陣”指可雜交的陣列元件(優(yōu)選多核苷酸探針(例如寡核苷酸))在基質上的有序排列?；|可以是固體基質，如載璃片，或半固體基質，如硝酸纖維素膜。術語“擴增”指產生參照核酸序列或其互補序列的一個或多個拷貝的方法。擴增可以是線性的或指數(shù)的(例如pcr)?！翱截悺辈⒎潜厝灰庵赶鄬τ谀０逍蛄型昝赖男蛄谢パa性或同一性。例如，拷貝可以包含核苷酸類似物(如脫氧肌苷)、刻意序列改變(如通過引物引入的序列改變，所述引物包含可與模板雜交但并非完全互補的序列)和/或擴增過程中出現(xiàn)的序列錯誤。術語“檢測”包括任意檢測手段，包括直接檢測和間接檢測?？膳c“分子表型”互換使用的術語“分子亞型”指ipf的亞型或表型，其表征為一個或多個特定基因的表達或一種或多種特定蛋白質，或基因組合的特定表達模式或蛋白質組合。術語“多重pcr”指為了在單個反應中擴增兩種或多種dna序列的目的而用一套以上引物對獲自單一來源(例如患者)的核酸進行的單個pcr反應。本文所用的術語“生物標志”指例如患者的病理學狀態(tài)的指示物，其可以在該患者的生物樣品中檢測到。生物標志包括但不限于dna、rna、蛋白質、糖類或基于糖脂的生物標志。本文用術語“診斷”來指分子或病理學狀態(tài)、疾病或病癥的鑒定或分類。例如，“診斷”可以指ipf或uip的具體類型的鑒定?！霸\斷”還可以指例如通過組織病理學或放射照像標準或通過分子特征(例如，表征為具體基因或具體基因組合的表達或該基因編碼的蛋白質的亞型)分類ipf的具體亞型。本文用術語“輔助診斷”來指就ipf的癥狀或病癥的具體類型的存在或性質輔助作出臨床決定的方法。例如，輔助診斷ipf的方法可以包括測量某些基因在來自個體的生物樣品中的表達。本文用術語“預測”來指隨時間存活以及一種或多種可歸因于ipf的疾病癥狀隨時間惡化的概率的預測?！皩φ帐茉囌摺敝冈\斷未患有ipf且未遭受與ipf相關的任意病征或癥狀的健康受試者。本文所用的術語“樣品”指獲自或源自目的受試者的組合物，其包含待要例如根據(jù)物理、生化、化學和/或生理學特征進行表征和/或鑒定的細胞實體和/或其他分子實體。例如，短語“疾病樣品”及其變化指獲自目的受試者的任意樣品，預期或已知其包含待表征的細胞實體和/或分子實體。“組織”或“細胞樣品”意指獲自受試者或患者的組織的相似細胞的收集。該組織或細胞樣品的來源可以是固體組織，如來自新鮮、冷凍和/或保存的器官或組織樣品或活檢組織或吸出物；血液或任意血液組分；體液，如腦脊髓液、羊水、腹膜液水或間隙液；來自該受試者妊娠或發(fā)育中的任意時間的細胞。該組織樣品還可以是原代或培養(yǎng)的細胞或細胞系。可選地，該組織或細胞樣品獲自疾病組織/器官。該組織樣品還可以包含并非在自然界中與該組織天然相互混合的化合物，如防腐劑、抗凝劑、緩沖劑、固定劑、營養(yǎng)物、抗生素等。本文所用的“參照樣品”、“參照細胞”、“參照組織”、“對照樣品”、“對照細胞”或“對照組織”指樣品、細胞或組織，其獲自已知來源或認為未受用本發(fā)明的方法或組合物鑒定的疾病或病癥影響。在一個實施方案中，參照樣品、參照細胞、參照組織、對照樣品、對照細胞或對照組織獲自同一受試者或患者的身體的健康部分，在所述受試者或患者中正在用本發(fā)明的組合物或方法鑒定疾病或病癥。在一個實施方案中，參照樣品、參照細胞、參照組織、對照樣品、對照細胞或對照組織獲自個體的身體的健康部分，該個體不是正在用本發(fā)明的組合物或方法鑒定疾病或病癥的受試者或患者。對于本文的目的，組織樣品的“切片”意指組織樣品的單個部分，例如從組織樣品切下的組織或細胞的薄片。當理解本發(fā)明包括這樣的方法，藉由該方法在形態(tài)學和分子兩個水平分析組織樣品的同一切片，或者就蛋白質和核酸方面分析組織樣品的同一切片，那么可以取下組織樣品的多個切片，并按照本發(fā)明進行分析。“相關”或“相關的”意指以任意方式將第一分析或方案的表現(xiàn)和/或結果與第二分析或方案的表現(xiàn)和/或結果相比較。例如，在進行第二方案時可以使用第一分析或方案的結果，和/或可以用第一分析或方案的結果來確定是否應進行第二分析或方案。就基因表達分析或方案的實施方案而言，可以用基因表達分析或方案的結果來確定是否應進行特定治療方案。術語“基因特征”可與“基因表達特征”互換使用，指其表達指示ipf的特定亞型的基因或基因組合，所述ipf的特定亞型表征為某種分子、病理學、組織學、放射照相和/或臨床特征。在某些實施方案中，與對照受試者中包含基因特征的一個或多個基因的表達相比，這些基因的表達提高。術語“蛋白質特征”可與“蛋白質表達特征”互換使用，指其表達指示ipf的特定亞型的蛋白質或蛋白質組合，所述ipf的特定亞型表征為某種分子、病理學、組織學、放射照相和/或臨床特征。在某些實施方案中，與對照受試者中包含蛋白質特征的一種或多種蛋白質的的表達相比，這些蛋白質的表達提高。本文所用的“ipf治療劑”、“對治療ipf有效的治療劑”及其語法變形指這樣的試劑，在以有效量提供時，已知、臨床上顯示或臨床醫(yī)師預期其在患有ipf的受試者中提供治療益處。“候選治療劑”指在以前未獲上市批準的條件(例如，具體劑量、給藥方案、適應癥)下在臨床試驗中正在進行測試或將要進行測試的試劑。“抗-il-13/il4途徑抑制劑”指阻斷il-13和/或il-4信號傳遞的物質?？?il13、抗-il4或抗-il13/il4抑制劑的實例包括但不限于抗-il13結合劑、抗-il4結合劑、抗-il4受體α結合劑、抗-il13受體α1結合劑和抗-il13受體α2結合劑。該抑制劑明確包括可以結合il-13、il-4、il-13rα1、il-13rα2或il-4rα的單結構域抗體。應理解，包括可以結合多于1個靶標的分子?！翱?il4結合劑”指特異性結合人il-4的物質。這類結合劑可以包括小分子、適配體或多肽。這種多肽可以包括但不限于選自免疫黏附素、抗體、肽體和肽的多肽。根據(jù)一個實施方案，該結合劑以1um-1pm之間的親和力結合人il-4序列。抗-il-4結合劑的具體實例可以包括可溶性il4受體α(例如，與人fc區(qū)融合的il4受體胞外域)、抗-il4抗體和可溶性il13受體α1(例如，與人fc區(qū)融合的il13受體α1胞外域)?！翱?il4受體α結合劑”指特異性結合人il-4受體α的物質。這類結合劑可以包括小分子、適配體或多肽。這種多肽可以包括但不限于選自免疫黏附素、抗體、肽體和肽的多肽。根據(jù)一個實施方案，該結合劑以1um-1pm之間的親和力結合人il-4受體α序列?？?il-4受體α結合劑的具體實例可以包括抗-il4受體α抗體?！翱?il13結合劑”指特異性結合人il-13的物質。這類結合劑可以包括小分子、適配體或多肽。這種多肽可以包括但不限于選自免疫黏附素、抗體、肽體和肽的多肽。根據(jù)一個實施方案，該結合劑以1um-1pm之間的親和力結合人il-13序列?？?il13結合劑的具體實例可以包括抗-il13抗體、與人fc融合的可溶性il13受體α2、與人fc融合的可溶性il4受體α、與人fc融合的可溶性il13受體α。示例性抗-il13抗體描述于國際專利號2005/062967中?？?il13抗體的其他實例描述于wo2008/083695(例如ima-638和ima-026)、us2008/0267959、us2008/0044420和us2008/0248048中。示例性“抗-il13抗體”指如lebrikizumab，其意指結合人il13的人源化igg4抗體。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含三個重鏈cdr：cdr-h1(seqidno.:1)、cdr-h2(seqidno.:2)和cdr-h3(seqidno.:3)。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含三個輕鏈cdr：cdr-l1(seqidno.:4)、cdr-l2(seqidno.:5)和cdr-l3(seqidno.:6)。在一個實施方案，該抗-il13抗體包含三個重鏈cdr和三個輕鏈cdr：cdr-h1(seqidno.:1)、cdr-h2(seqidno.:2)、cdr-h3(seqidno.:3)、cdr-l1(seqidno.:4)、cdr-l2(seqidno.:5)和cdr-l3(seqidno.:6)。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含具有選自seqidno.7和8的氨基酸序列的可變重鏈區(qū)vh。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含具有seqidno.:9的氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)vl。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含具有選自seqidno.7和8的氨基酸序列的可變重鏈區(qū)vh及具有seqidno.:9的氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)vl。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含具有seqidno.:10或seqidno.:11或seqidno.:12或seqidno.:13的氨基酸序列的重鏈。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含具有seqidno.:14的氨基酸序列的輕鏈。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含具有選自seqidno.:10、seqidno.:11、seqidno.:12和seqidno.:13的氨基酸序列的重鏈及具有seqidno.:14的氨基酸序列的輕鏈。“抗-il13受體α1結合劑”指特異性結合人il13受體α1的物質。這類結合劑可以包括小分子、適配體或多肽。這種多肽可以包括但不限于選自免疫黏附素、抗體、肽體和肽的多肽。根據(jù)一個實施方案，該結合劑以1um-1pm之間的親和力結合人il-13受體α1序列?？?il13受體α1結合劑的具體實例可以包括抗-il13受體α1抗體?！翱?il13受體α2結合劑”指特異性結合人il13受體α2的物質。這類結合劑可以包括小分子、適配體或多肽。這種多肽可以包括但不限于選自免疫黏附素、抗體、肽體和肽的多肽。根據(jù)一個實施方案，該結合劑以1um-1pm之間的親和力結合人il-13受體α2序列。抗-il13受體α2結合劑的具體實例可以包括抗-il13受體α2抗體。術語“抗體”以最廣泛的含義使用，且明確涵蓋例如單克隆抗體、多克隆抗體、具有多表位特異性的抗體、單鏈抗體、多特異性抗體和抗體片段。這類抗體可以是嵌合抗體、人源化抗體、人抗體和合成抗體。下文更詳細地描述這類抗體及產生它們的方法。術語“可變的”指可變域的某些區(qū)段的序列在抗體間廣泛不同的事實。v區(qū)介導抗原結合，并限定特定抗體對其特定抗原的特異性。但是，可變性并非在可變域的110個氨基酸的跨度內均勻分布。相反，v區(qū)由15-30個氨基酸的稱為構架區(qū)(fr)的相對不變的序列組成，構架區(qū)由長度各為9-12個氨基酸的稱為“高變區(qū)”的具有極端可變性的較短區(qū)域分開。天然重鏈和輕鏈的可變域各包含四個fr，其主要采用β-折疊構型，通過三個高變區(qū)連接，該高變區(qū)形成連接該β-折疊結構的環(huán)，且在一些情況下形成該β-折疊結構的部分。每條鏈中的高變區(qū)通過fr近距離保持在一起，并與來自另一條鏈的高變區(qū)一起形成抗體的抗原結合位點(見kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))。恒定域不直接涉及抗體與抗原的結合，但顯示多種效應子功能，如抗體在抗體依賴性細胞毒作用(adcc)中的參與。在本文中使用時，術語“高變區(qū)”(或“hvr”)指抗體負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來自“互補決定區(qū)”或“cdr”(例如，vl中的約殘基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)，vh中的約殘基31-35b(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)(kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)))的氨基酸殘基和/或來自高變環(huán)(例如，vl中的殘基26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)及vh中的26-32(h1)、52a-55(h2)和96-101(h3)(chothia和leskj.mol.biol.196:901-917(1987)))的那些殘基。高變區(qū)可以包含如下“擴展的高變區(qū)”：vl中的24-36(l1)、46-56(l2)和89-97(l3)，vh中的26-35b(h1)、47-65(h2)和93-102(h3)。對于這些定義中的每一個，按照kabat等,上文編號可變域殘基?！皹嫾堋被颉癴r”殘基是除本文定義的高變區(qū)殘基外的那些可變域殘基。例如，輕鏈構架區(qū)1(lc-fr1)、構架區(qū)2(lc-fr2)、構架區(qū)3(lc-fr3)和構架4(lc-fr4)區(qū)可以分別包含抗體的編號1-23、35-49、57-88和98-107的殘基(kabat編號系統(tǒng))。在另一實例中，人重鏈構架區(qū)1(hc-fr1)、人重鏈構架區(qū)2(hc-fr2)、人重鏈構架區(qū)3(hc-fr3)和人重鏈構架區(qū)4(hc-fr4)可以分別包含抗體的殘基1-25、36-48、66-92和103-113(kabat編號系統(tǒng))。本文提到的“共有序列”或共有v結構域序列是源自已知的人免疫球蛋白可變區(qū)序列的氨基酸序列比較而得到的人工序列。本文所用的術語“單克隆抗體”指來自基本是同質性抗體群體的抗體，即除了在產生該單克隆抗體的過程中出現(xiàn)的可能的變體(這類變體通常小量存在)外，該群體包含的單個抗體相同和/或結合一個或多個相同的表位。這種單克隆抗體通常包括這樣的抗體，其含有結合靶標的多肽序列，其中該結合靶標的多肽序列是通過以下方法獲得的，該方法包括從多個多肽序列選擇單個結合靶標的多肽序列。例如，該選擇方法可以是從多個克隆(如雜交瘤克隆庫、噬菌體克隆庫或重組dna克隆庫)選擇獨特的克隆。應理解，可以進一步改變所選擇的結合靶標的序列，例如以改善對靶標的親和力、人源化結合靶標的序列、改善其在細胞培養(yǎng)物中的產生、降低其在體內的免疫原性、產生多特異性抗體等，包含改變的結合靶標的序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與通常包含針對不同決定簇(表位)的抗體的多克隆抗體不同，單克隆抗體制劑的每個單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。除其特異性外，單克隆抗體制劑還因它們通常未受其他免疫球蛋白污染而是有利的。修飾詞“單克隆的”表示抗體獲自基本同質的抗體群體的性狀，不視為需要通過任意特定的方法來產生該抗體。例如，待按照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過多種技術來制備，包括雜交瘤法(例如，kohler等,nature,256:495(1975)；harlow等,antibodies:alaboratorymanual,(coldspringharborlaboratorypress,第2版1988)；hammerling等,在monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas563-681,(elsevier,n.y.,1981)中)、重組dna法(見例如美國專利號4,816,567)、噬菌體展示技術(見例如clackson等,nature,352:624-628(1991)；marks等,j.mol.biol.,222:581-597(1991)；sidhu等,j.mol.biol.338(2):299-310(2004)；lee等,j.mol.biol.340(5):1073-1093(2004)；fellouse,proc.nat.acad.sci.usa101(34):12467-12472(2004)；和lee等j.immunol.methods284(1-2):119-132(2004))及用于從具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物產生人抗體或人樣抗體的技術(見例如wo98/24893、wo/9634096、wo/9633735和wo/9110741；jakobovits等,proc.natl.acad.sci.usa,90:2551(1993)；jakobovits等,nature,362:255-258(1993)；bruggemann等,yearinimmuno.,7:33(1993)；美國專利號5,545,806、5,569,825、5,591,669(全都屬于genpharm)；5,545,807；wo97/17852；美國專利號5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；和marks等,bio/technology,10:779-783(1992)；lonberg等,nature,368:856-859(1994)；morrison,nature,368:812-813(1994)；fishwild等,naturebiotechnology,14:845-851(1996)；neuberger,naturebiotechnology,14:826(1996)；及l(fā)onberg和huszar,intern.rev.immunol.,13:65-93(1995).本文的單克隆抗體明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)以及這類抗體的片段，只要它們顯示希望的生物學活性，在該抗體中部分重鏈和/或輕鏈與以下抗體中對應的序列相同或同源，該抗體源自特定物種或隸屬于特定抗體種類或亞類，而一條或多條鏈的其余部分與以下抗體中對應的序列相同或同源，該抗體源自另一物種或隸屬于另一抗體種類或亞類(美國專利號4,816,567；morrison等,proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855(1984))。制備嵌合抗體的方法為本領域已知。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗體的其他抗原結合片段)。在一些實施方案中，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中用來自非人物種(如小鼠、大鼠或兔)的具有希望的特異性、親和力和能力的互補決定區(qū)(cdr)(供體抗體)的殘基替換來自受體的cdr的殘基。在一些情況下，用對應的非人殘基替換人免疫球蛋白的fv構架區(qū)(fr)殘基。此外，人源化抗體可以包含不見于受體抗體中也不見于引入的cdr或構架序列中的殘基。通常進行這些修飾來進一步改良和最大化抗體性能。通常，人源化抗體將包含至少一個可變域的基本上全部，其中全部或基本上全部高變環(huán)源自非人免疫球蛋白，而全部或基本上全部fr區(qū)源自人免疫球蛋白序列，但fr區(qū)可以包含一個或多個氨基酸取代，以例如改善結合親和力。在一個優(yōu)選實施方案中，人源化抗體還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)或人共有恒定序列。進一步的細節(jié)見jones等,nature321:522-525(1986)；riechmann等,nature332:323-329(1988)；及presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。人源化抗體包括抗體，其中抗體的抗原結合區(qū)源自通過例如用目的抗原免疫短尾猴產生的抗體。制備人源化抗體的方法為本領域已知。人抗體也可以用本領域已知的多種技術產生，包括噬菌體展示文庫。hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381(1991)；mark等,j.mol.biol.,222:581(1991)。也可用cole等和boerner等的技術來制備人單克隆抗體。cole等,monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,77頁(1985)；boerner等,j.immunol.,147(1):86-95(1991)。還見lonberg和huszar,int.rev.immunol.13:65-93(1995)；pct公開wo98/24893；wo92/01047；wo96/34096；wo96/33735；歐洲專利號0598877；美國專利號5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；及5,939,598?！翱贵w片段”包含全長抗體的部分，通常是其抗原結合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的實例包括fab、fab'、f(ab')2和fv；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。“fv”是包含完整的抗原識別和結合位點的最小的抗體片段。此片段由一個重鏈可變區(qū)結構域和一個輕鏈可變區(qū)結構域緊密非共價結合成的二聚體組成。從這兩個結構域的折疊發(fā)射出六個高變環(huán)(來自h鏈和l鏈的各3個環(huán))，其貢獻用于抗原結合的氨基酸殘基并賦予抗體抗原結合特異性。但是，甚至單個可變域(或僅包含對抗原特異的三個cdr的半個fv)也具有識別和結合抗原的能力，但親和力低于整個結合位點。本發(fā)明的抗體的“功能片段”是仍以與它們所源自的完整全長分子基本相同的親和力結合多肽且在至少一種測定(例如，抑制如小鼠模型中的纖維化或抑制在體外與該抗體片段結合的抗原的生物學活性)中具有活性的那些片段?？贵w“效應子功能”指可歸因于抗體的fc區(qū)(天然序列fc區(qū)或氨基酸序列變體fc區(qū))的那些生物學活性，且隨抗體同種型而變?？贵w效應子功能的實例包括：c1q結合和依賴補體的細胞毒性、fc受體結合、依賴抗體的細胞毒性(adcc)、吞噬作用、細胞表面受體(例如b細胞受體)的下調和b細胞激活?！疤烊恍蛄衒c區(qū)”包含與見于自然界中的fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。就本文鑒定的多肽和抗體序列而言的“百分比(％)氨基酸序列同一性”或“同源性”定義為在將任意保守取代視為序列同一性的部分進行比對后，候選序列中與所比較的多肽中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比?？梢砸员绢I域現(xiàn)有技術中的多種方式來實現(xiàn)用于測定氨基酸序列同一性百分比的比對，例如，使用公開可獲得的計算機軟件，如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)軟件。本領域技術人員可以確定用于測量比對的適當參數(shù)，包括在所比較的全長序列中實現(xiàn)最大比對所需的任意算法。但是，對于本文的目的，用序列比較計算機程序align-2來產生％氨基酸序列同一性值。align-2序列比較計算機程序由genentech,inc.編寫，源代碼已隨用戶文檔提交u.s.copyrightoffice,washingtond.c.,20559，它以登記號txu510087登記于u.s.copyrightoffice。align-2程序從genentech,inc.,southsanfrancisco,california公開可得。align-2程序應編譯用在unix操作系統(tǒng)上，優(yōu)選數(shù)字unixv4.0d。所有序列比較參數(shù)由align-2程序設定且保持不變。術語“包含fc區(qū)的多肽”指多肽，如抗體或免疫黏附素(見下文定義)，其包含fc區(qū)。fc區(qū)的c端賴氨酸(eu編號系統(tǒng)的殘基447)可以例如在純化多肽期間或通過重組改造編碼該多肽的核酸來去除。因此，包含根據(jù)本發(fā)明的具有fc區(qū)的多肽(包括抗體)的組合物可以包含去除了所有k447殘基的多肽群體、未去除k447殘基的多肽群體或具有k447殘基和不具有k447殘基的多肽的混合物的多肽群體。在本說明書和權利要求中，在提到可變域(大約是輕鏈的殘基1-107和重鏈的殘基1-113)中的殘基時，通常使用kabat編號系統(tǒng)(例如，kabat等,sequencesofimmunologicalinterest.第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。在提到免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時，通常使用“eu編號系統(tǒng)”或“eu指數(shù)”(例如，在此明確并入本文作為參考的kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)中報道的eu指數(shù))。除非本文另有說明，提到抗體可變域中的殘基編號意指kabat編號系統(tǒng)的殘基編號。除非本文另有說明，提到抗體恒定域中的殘基編號意指eu編號系統(tǒng)的殘基編號(例如，見美國臨時申請?zhí)?0/640,323，eu編號的數(shù)字)。本領域普通技術人員可以容易地確定雜交條件的“嚴格性”，其通常是取決于探針長度、洗滌溫度和鹽濃度的經(jīng)驗計算。一般而言，較長的探針需要較高的溫度進行適當?shù)耐嘶?，而較短的探針需要較低的溫度。在互補鏈存在于低于它們的解鏈溫度的環(huán)境中時，雜交通常取決于變性dna重退火的能力。探針與可雜交序列間所希望的的同源性的程度越高，可以使用的相對溫度越高。結果，導致較高的相對溫度將趨向于使得反應條件更嚴格，而較低的相對溫度將趨向于使得反應條件更不嚴格。雜交反應的嚴格性的其他詳情和解釋見ausubel等,currentprotocolsinmolecularbiology,wileyintersciencepublishers,(1995)。可以通過以下來鑒定本文定義的“嚴格條件”或“高嚴格性條件”：(1)利用低離子強度和高溫進行洗滌，例如0.015m氯化鈉/0.0015m檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉于50℃；(2)雜交期間利用變性劑，如甲酰胺，例如42℃含0.1％牛血清白蛋白/0.1％ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮的50％(v/v)甲酰胺和含750mm氯化鈉、75mm檸檬酸鈉的ph6.5的50mm磷酸鈉緩沖液；或(3)在42℃下在包含50％甲酰胺、5×ssc(0.75mnacl、0.075m檸檬酸鈉)、50mm磷酸鈉(ph6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5×denhardt's溶液、超聲處理的鮭精dna(50μg/ml)、0.1％sds和10％硫酸葡聚糖的溶液中過夜雜交，在42℃下在0.2×ssc(氯化鈉/檸檬酸鈉)中洗滌10分鐘，然后是55℃下用含edta的0.1×ssc進行10分鐘高嚴格性洗滌。可以按照sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual,newyork:coldspringharborpress,1989所述鑒定“中等嚴格的條件”，且其包括使用嚴格性低于上文所述的那些洗滌溶液和雜交條件(例如，溫度、離子強度和％sds)的洗滌溶液和雜交條件。中等嚴格的條件的實例是在37℃下在以下的溶液中過夜溫育，該溶液包含20％甲酰胺、5×ssc(150mmnacl、15mm檸檬酸三鈉)、50mm磷酸鈉(ph7.6)、5×denhardt's溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml變性的剪切鮭精dna，然后在約37-50℃下在1×ssc中洗滌濾膜。熟練的技術人員將理解如何根據(jù)需要調節(jié)溫度、離子強度等，以適應諸如探針長度等的因素。如本文所使用，待治療的受試者是哺乳動物(例如，人、非人靈長類、大鼠、小鼠、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓等)。該受試者可以是臨床患者、臨床試驗志愿者、實驗動物等。該受試者可以疑似患有特發(fā)性肺纖維化或處于患上特發(fā)性肺纖維化的風險，或者診斷為患有特發(fā)性肺纖維化。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的待治療的受試者是人?！爸委煛被颉皽p輕”指其中目的是預防或減慢(減少)所靶向的病理性癥狀或病癥或緩解該病癥的一些癥狀的措施。需要治療的那些受試者可以包括已經(jīng)患有該病癥以及易于患上該病癥或待要預防該病癥的那些受試者。如果在接受本發(fā)明的治療劑之后，患者隨時間的推移(例如，超過3個月[12周]，或6個月[24周]，或9個月[36周]，或12個月[1年，52周])在以下的一項或多項中顯示可觀察到和/或可測量到的從基線的減少或改變和/或可測量到的從基線變化的速率，則成功“治療”了受試者或哺乳動物的特發(fā)性肺纖維化：用力肺活量(fvc)；肺一氧化碳擴散容量(dlco)；患者報告結果工具，如ipf中評估生活質量的工具(ataq-ipf)或euroqol5-dimensionquestionnaire(eq-5d)；6分鐘步行距離(6mwd)；靜息氧流速；肺高分辨率計算層析x射線照相術(hrct)上的放射照相發(fā)現(xiàn)，包括定量肺纖維化(qlf)得分；血清生物標志，包括但不限于骨膜蛋白、ccl18、ykl40、comp、opn、ccl13。本文所用的“ipf加重”意指符合以下標準的事件：之前30天內未能解釋的惡化或出現(xiàn)呼吸困難；疊加在與常見的間質肺炎(uip)一致的網(wǎng)狀或蜂窩狀背景模式上的新的雙側毛玻璃樣異常和/或固結的放射學證據(jù)；缺乏備選的原因，如左心衰竭、肺栓塞、肺部感染(根據(jù)氣管內吸出物或支氣管肺泡灌洗(如果可得)，或研究人員的判斷)，或其他導致急性肺損傷的事件(例如膿毒、誤吸、創(chuàng)傷、再灌注肺水腫)。本文所用的“ipf惡化”或“ipf疾病惡化”意指符合以下(i)、(ii)和(iii)的事件：(i)之前30天內未能解釋的惡化或出現(xiàn)呼吸困難；(ii)以下任意兩項：(a)疊加在與uip一致的網(wǎng)狀或蜂窩狀背景模式上的新的雙側毛玻璃樣異常和/或固結的放射學證據(jù)；(b)符合以下標準中的至少1項的肺功能惡化：(i)fvc(l)，至少10％；(ii)dlco(mlco/分鐘-1/mmhg-1)，至少15％；(iii)氧飽和(spo2)，至少4％；和(iii)缺乏備選的原因?！坝行Я俊敝冈诒匦璧膭┝亢蜁r期下達到希望的治療或預防結果有效的量。術語“治療有效量”指在受試者中有效“減輕”或“治療”疾病或病癥的本發(fā)明的多肽的量。治療劑的治療有效量可以根據(jù)因素諸如疾病狀態(tài)、年齡、性別、受試者的體重和抗體在個體中引出希望的應答的能力而改變。治療有效量還是這樣的量，其中治療有益作用超過了治療劑的任意毒性或有害作用。“預防有效量”指在必需的劑量和時期下有效地達到希望的預防結果的量。通常但并非必需，由于在患病之前或在疾病的較早階段將預防劑量用于受試者，所以預防有效量將小于治療有效量?！伴L期”施用指以與急性方式相反的持續(xù)方式施用一種或多種藥物，以在延長的時期中維持起始治療作用(活性)。“間歇”施用是并非無中斷地連續(xù)進行而是在性質上是周期性的治療?！坝昧魵饬?fev1)”指測量在用力呼氣的第一秒中排出的空氣體積的標準測試。通過肺活量計測量fev1，肺活量計由煙嘴口(mouthpiece)和連接至記錄結果并將它們顯示在圖表上的機器的一次性管道組成。為了進行肺活量測定，讓人深吸氣，緊緊圍繞管道閉上口，然后通過管道呼氣，同時進行測量。記錄并分析呼出的空氣體積及每次呼吸花費的時長。肺活量測定結果表示為百分比。正常肺活量測定結果的實例包括一秒后fev1為肺活量的75％。異常肺活量測定結果的實例包括小于正常預測值的80％的讀數(shù)。異常結果通常指示存在某種程度的阻塞性肺疾病，如哮喘、肺氣腫或慢性支氣管炎，或限制性肺疾病，如肺纖維化。例如，可以用fev1值(預測值的百分比)來分類可伴隨哮喘和其他阻塞性肺疾病(如肺氣腫或慢性支氣管炎)出現(xiàn)的阻塞：fev1為預測值的65％至79％＝輕度阻塞，fev1為預測值的40％至59％＝中度阻塞，fev1為預測值的不到40％＝嚴重阻塞。此外，阻塞性和限制性肺疾病在至少以下方面不同。在阻塞性疾病中，fev1/fvc比例可以低于正常，而fvc可以是正常的，而在限制性疾病中，fev1和fvc可以都低于正常，但fev1/fvc比例可以是正常的。在這類情況下，fev1僅是因為fvc降低而降低。本文所用的“fvc”指“用力肺活量”，其指測量充分吸氣和最大呼氣至殘氣量之間的肺空氣體積變化(與fev1中的在1秒內排出的空氣體積相反)的標準測試。它是功能性肺容量的測量。在患有限制性肺疾病(如間質性肺病(包括ipf)、過敏性肺炎、肉樣瘤病和系統(tǒng)性硬化癥)的患者中，fvc通常由于肺實質的瘢痕形成而降低?？梢杂脕龛b定(例如通過微列陣分析)本文所述的基因(和由基因編碼的蛋白質)的核酸探針的實例包括但不限于表2、3和4中所述的探針。“提高的表達水平”或“提高的水平”指患者(例如疑似患有或診斷為患有ipf的患者)中mrna或蛋白質的表達相對于對照(如未患ipf的一個或多個個體)增加。一般技術除非另有說明，本發(fā)明的實施將利用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規(guī)技術，這些技術為本領域的現(xiàn)有技術。這類技術充分闡述于文獻中，如"molecularcloning:alaboratorymanual",第二版(sambrook等,1989)；"oligonucleotidesynthesis"(m.j.gait編輯,1984)；"animalcellculture"(r.i.freshney,ed.,1987)；"methodsinenzymology"(academicpress,inc.)；"currentprotocolsinmolecularbiology"(f.m.ausubel等編輯,1987,及定期更新)；"pcr:thepolymerasechainreaction",(mullis等編輯,1994)。用于本發(fā)明的引物、寡核苷酸和多核苷酸可以用本領域已知的標準技術產生。本文提供與ipf和ipf的某些亞型相關的基因表達特征。這些特征構成ipf和/或ipf的亞型的生物標志，和/或有利于或促進ipf的發(fā)展、持續(xù)和/或進展，以及可預測ipf患者的存活。因此，本文公開的發(fā)明用于多種情況，例如用于與ipf預測、診斷和治療相關的方法和組合物?；虮磉_水平的檢測本文所述的方法中任一種的核酸可以是轉錄自基因組dna的rna或產生自rna的cdna。核酸可以源自脊椎動物，例如哺乳動物。如果核酸直接獲自特定來源或如果核酸是見于該來源中的核酸的拷貝，則稱它“源自”該來源。核酸包括核酸的拷貝，例如源自擴增的拷貝。在某些情況下希望擴增，例如以獲得用于檢測變異的希望的量的物質。然后可以使用變異檢測方法(如下文所述的那些)來檢測擴增子，以測定某些基因的表達。微列陣是通常在高嚴格性條件下用成千上萬個核酸探針的陣列系列來例如與cdna或crna樣品雜交的多重技術。通常通過檢測縈光團、銀或化學發(fā)光標記的靶標來檢測和定量探針-靶標雜交，以測定靶標中核酸序列的相對豐度。在典型的微列陣中，通過探針與化學基質之間的共價鍵(經(jīng)環(huán)氧-硅烷、氨基-硅烷、賴氨酸、聚丙烯酰胺或其他)將探針結合至固體表面。固體表面是例如玻璃、硅片或微珠。多種微列陣是商業(yè)上可獲得的，該微列陣包括例如由affymetrix,inc.和illumina,inc.制造的那些微列陣。蛋白質表達水平的檢測可以在全血、血漿或血清的樣品中檢測蛋白質的表達水平。用于檢測這類生物樣品中的蛋白質表達水平的多種方法為本領域已知，該方法包括多種免疫測定法。之前已描述了許多的免疫測定技術，見例如美國專利號4,016,043、4,424,279和4,018,653。該方法包括非競爭性類型的單位點和雙位點或“夾心”測定，以及傳統(tǒng)的競爭性結合測定。這些測定還包括經(jīng)標記的抗體與靶生物標志的直接結合。夾心測定是最有用和最常用的測定。存在夾心測定技術的許多變形，且全都為本發(fā)明所涵蓋。簡言之，在典型的向前測定(forwardassay)中，將未標記的抗體固定在固體基質上，并使待測試的樣品與結合分子接觸。適宜的溫育期(足以允許形成抗體-抗原復合體的時期)后，然后加入對抗原特異的第二抗體，并溫育足以形成另一抗體-抗原-標記抗體的復合體的時間，所述第二抗體用能夠產生可檢測信號的報道分子標記。洗去任何未反應的物質，通過觀察由報道分子產生的信號來測定抗原的存在。結合可以通過簡單地觀察可見信號而是定性的，或可以通過與含有已知量的生物標志的對照樣品比較而是定量的。向前測定的變形包括同時測定，其中將樣品和標記抗體同時加至結合抗體。這些技術為本領域技術人員公知，且包括顯而易見的任意小變化。在典型的向前夾心測定中，使具有針對生物標志的特異性的第一抗體共價或被動結合于固體表面。固體表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相支持體可以是管、小球、微量培養(yǎng)板的盤的形式，或適合用于進行免疫測定的任意其他表面。結合方法為本領域公知，且通常包括交聯(lián)共價結合或物理吸附，在測試樣品的準備中洗滌聚合物-抗體復合體。然后將待測試樣品的整分試樣加至固相復合體，并在適宜條件(例如，從室溫至40℃，如25℃和32℃(含)之間)下溫育足夠的時間(例如，2-40分鐘或過夜(如果更方便))，以允許存在于抗體中的任意亞基的結合。溫育期后，洗滌并干燥抗體亞基固相，并與特異地針對生物標志的部分的第二抗體一起溫育。第二抗體與報道分子連接，用該報道分子來顯示第二抗體與分子標志的結合。備選方法涉及固定樣品中的靶生物標志，然后將該固定的生物標志暴露于特異性抗體，該抗體可以用報道分子標記或不標記。取決于靶標的量和報道分子信號的強度，可以通過用抗體直接標記來檢測結合的靶標。備選地，將對第一抗體特異的第二標記抗體暴露于靶標-第一抗體復合體，以形成靶標-第一抗體-第二抗體三元復合體。通過報道分子發(fā)出的信號來檢測復合體。本說明書中所用的“報道分子”意指通過其化學性質提供可分析鑒定的信號的分子，該信號允許檢測抗原結合的抗體。這類測定中最常用的報道分子是酶、縈光團或含放射性核素的分子(即放射性同位素)和化學發(fā)光分子。在酶免疫測定的情況下，通常利用戊二醛或過碘酸鹽將酶綴合至第二抗體。但是，可容易地認識到，存在技術人員可容易地獲得的多種不同的綴合技術。常用的酶包括辣根過氧化物酶、葡糖氧化酶、半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等。通常選擇底物(根據(jù)具體酶而使用)，以用于在通過對應的酶水解時產生可檢測的顏色變化。適宜的酶的實例包括堿性磷酸酶和過氧化物酶。還可能利用產生縈光產物的縈光底物而不是上述生色底物。在所有情況下，向第一抗體-分子標志復合體加入酶標記的抗體，使其結合，然后洗去過量的試劑。然后向抗體-抗原-抗體的復合體加入含有適當?shù)孜锏娜芤?。底物將與連接至第二抗體的酶反應，產生定性視覺信號，其通?？梢酝ㄟ^分光光度計進一步定量，以產生存在于樣品中的生物標志的量的指征。備選地，可以將縈光化合物(如縈光素和羅丹明)化學偶聯(lián)至抗體而不改變其結合能力。在通過用特定波長的光照射來激活時，縈光染料標記的抗體吸收光能，在分子中誘導激發(fā)性狀態(tài)，然后發(fā)射出可用光學顯微鏡視覺上檢測的特征性顏色的光。如在eia中，使縈光標記的抗體與第一抗體-分子標志復合體結合。洗去未結合的試劑后，然后將剩余的三元復合體暴露于適當波長的光，所觀察到的縈光指示目的分子標志的存在。免疫縈光和eia技術在本領域中都非常完善。但是，也可以利用其他報道分子，如放射性同位素、化學發(fā)光或生物發(fā)光分子。生物樣品可以用本領域技術人員已知的某些方法獲得。生物樣品可以獲自脊椎動物，尤其是哺乳動物。在某些情況下，生物樣品是肺組織、全血、血漿、血清或外周血單核細胞(pbmc)。通過篩查這類身體樣品，可以實現(xiàn)ipf的簡單的早期預測(例如存活)或診斷(例如分子亞型)。此外，可以通過靶核酸(或所編碼的多肽)表達水平的變化測試這類身體樣品以更容易地監(jiān)測治療的進展。在確定受試者或組織或細胞樣品包含本文公開的基因表達特征后，考慮可以對該受試者施用有效量的適當?shù)膇pf治療劑來在該受試者中治療ipf。熟練的醫(yī)師可以在哺乳動物中進行本文所述的多種病理性病癥的臨床診斷。允許例如在哺乳動物中診斷或檢測ipf的臨床診斷技術為本領域可得。可以按照已知的方法施用ipf治療劑，如作為大丸藥或通過在一段時間內連續(xù)輸注靜脈內施用，通過肌內、腹膜內、腦脊內、皮下、關節(jié)內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑?？蛇x地，可以用多種市售裝置通過微泵輸注進行施用。某些治療劑之前已將某些治療劑描述為用于治療ipf的候選物或藥物。這些描述于已發(fā)表的文獻中，并綜述于例如rafii等,j.thorac.dis(2013)5(1):48-73中。這類藥物包括具有抗氧化、免疫抑制和/或抗炎活性的藥物，如n-乙酰半胱氨酸；具有抗纖維化、抗炎和/或抗氧化活性的藥物，如吡非尼酮，其是已批準用于ipf的臨床治療的口服施用的吡啶；抑制轉化生長因子-β(tgf-β)的藥物，如靶向所有tgf-β同種型的抗-tgf-β抗體(例如gc1008)，或抗αvβ6整聯(lián)蛋白的抗體(例如stx-100)；抑制結締組織生長因子(ctgf)的藥物，如抗-ctgf抗體(例如fg-3019)；抑制生長抑素受體的藥物，如生長抑素類似物(例如som230，抑生長肽)；抑制il-13、il-4和ccl2的藥物，如抗-il13抗體(例如qax576、tralokinumab、lebrikizumab[下文進一步描述])、抗-il4抗體、抗-il13/抗-il4藥物的組合(例如雙特異性抗-il13/抗-il4抗體，如sar156597)、抗-ccl2抗體(例如cnto888)；具有抗血管生成、免疫調節(jié)和/或抗炎活性的藥物，如沙利度胺或米諾環(huán)素；抑制賴氨酰氧化酶-樣2(loxl2)的藥物，如抗-loxl2抗體(例如gs-6624[simtuzumab])；抑制血管發(fā)生的藥物，如酪氨酸激酶抑制劑、bibf1120、四硫鉬酸鹽；抑制胞外基質沉積和/或破壞膠原沉積的藥物，如多西環(huán)素；靶向腎素-血管緊張素系統(tǒng)的藥物，如氯沙坦；及其他具有抗增殖和/或抗纖維化活性的試劑，如一氧化碳。本文提供用于治療特發(fā)性肺纖維化的某種治療劑。在一個實施方案中，治療劑是抗-il13抗體，也稱為lebrikizumab。lebrikizumab是igg4抗體。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含三個重鏈cdr：cdr-h1(seqidno.:1)、cdr-h2(seqidno.:2)和cdr-h3(seqidno.:3)。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含三個輕鏈cdr：cdr-l1(seqidno.:4)、cdr-l2(seqidno.:5)和cdr-l3(seqidno.:6)。在一個實施方案，該抗-il13抗體包含三個重鏈cdr和三個輕鏈cdr：cdr-h1(seqidno.:1)、cdr-h2(seqidno.:2)、cdr-h3(seqidno.:3)、cdr-l1(seqidno.:4)、cdr-l2(seqidno.:5)和cdr-l3(seqidno.:6)。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含具有選自seqidno.7和8的氨基酸序列的可變重鏈區(qū)vh。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含具有seqidno.:9的氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)vl。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含具有選自seqidno.7和8的氨基酸序列的可變重鏈區(qū)vh及具有seqidno.:9的氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)vl。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含具有seqidno.:10或seqidno.:11或seqidno.:12或seqidno.:13的氨基酸序列的重鏈。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含具有seqidno.:14的氨基酸序列的輕鏈。在一個實施方案中，該抗-il13抗體包含具有選自seqidno.:10、seqidno.:11、seqidno.:12和seqidno.:13的氨基酸序列的重鏈及具有seqidno.:14的氨基酸序列的輕鏈?？?il13抗體進一步描述于國際專利號2005/062967中。在另一方面，抗-il-13抗體包含與seqidno.:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重鏈可變域(vh)序列。在某些實施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列相對于參照序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列的抗-il-13抗體保留結合人il-13的能力。在某些實施方案中，在seqidno.:8中取代、改變、插入和/或缺失了總計1至10個氨基酸。在某些實施方案中，取代、插入或缺失存在于cdr之外的區(qū)域(即在fr中)?？蛇x地，該抗-il13抗體包含seqidno.:8中的vh序列，包括該序列的翻譯后修飾。在另一方面，提供抗-il-13抗體，其中該抗體包含與seqidno.:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的輕鏈可變域(vl)。在某些實施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列相對于參照序列包含取代(例如保守取代)、些實施方案中，取代、插入或缺失存在于cdr之外的區(qū)域(即在fr中)。可選地，該抗-il13抗體包含seqidno.:9中的vl序列，包括該序列的翻譯后修飾。在另一實施方案中，該抗-il-13抗體包含與seqidno.:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的vl區(qū)和與seqidno.:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的vh區(qū)。試劑盒還提供本文所述或所提出的應用中的試劑盒或制成品。這類試劑盒可以包含為緊密限制地容納一個或多個容器(如小瓶、管等)而被區(qū)室化的載體裝置，每個容器包含將要在方法中使用的分開的組件之一。例如，容器之一可以包含被可檢測標記或可以被可檢測標記的探針。這種探針可以是對包含基因表達特征的一個或多個基因的多核苷酸特異的多核苷酸。當試劑盒利用核酸雜交來檢測靶核酸時，試劑盒還可以具有這樣的容器，其包含用于擴增靶核酸序列的一種或多種核酸和/或包含報道基因，如生物素結合蛋白，如親和素或鏈霉親和素，結合于報道分子，如酶、縈光或放射性同位素標記。試劑盒通常將包含上述容器和一個或多個其他容器，該其他容器包含商業(yè)和用戶角度希望的物質，包括緩沖液、稀釋液、濾器、針頭、注射器和含有使用說明的包裝說明書。容器上可以存在標記來指示該組合物用于特定的治療或非治療性應用，且還可以包含體內或體外使用的說明，如上文所述的那些。試劑盒中的其他可選成分包括一種或多種緩沖液(例如封閉緩沖液、洗滌液、底物緩沖液等)、其他試劑(如通過酶標記發(fā)生化學改變的底物(例如色原))、表位回收液(epitoperetrievalsolution)、對照樣品(陽性和/或陰性對照)、對照切片等。銷售方法本發(fā)明還涵蓋用于銷售ipf治療劑或其可藥用組合物的插入或缺失，但包含該序列的抗-il-13抗體保留結合il-13的能力。在某些實施方案中，在seqidno.:9中取代、插入和/或缺失了總計1至10個氨基酸。在某方法，其包括向目標受眾推銷、講解和/或詳述該試劑或其藥物組合物在治療已ipf患者或患者群體中的用途，其中已經(jīng)從所述ipf患者或患者群體獲得樣品并顯示本文公開的基因或蛋白質或基因和蛋白質的組合的表達水平。銷售通常是通過非個人媒介的付費溝通，其中標明贊助人并控制信息。為了本文目的的銷售包括宣傳、公共關系、產品放置、贊助、承銷(underwriting)和促銷。此術語還包括出現(xiàn)在任意印刷信息交流媒體中的贊助信息公告，其設計用于吸引廣大受眾來說服、告知、促進、激發(fā)或以其他方式改變?yōu)閷Σ少?、支持或認可本發(fā)明的有利模式的行為。本文的診斷方法的銷售可以通過任意方法達到。用來傳遞這些信息的銷售媒介的實例包括電視、廣播、電影、雜志、報紙、互聯(lián)網(wǎng)和廣告牌，包括廣告，其是出現(xiàn)在廣播媒體中的信息。所使用的銷售類型將取決于許多因素，例如要影響的目標受眾的性質，例如醫(yī)院、保險公司、診所、醫(yī)生、護士和患者，以及成本考慮及管理藥物和診斷劑的銷售的相關管轄法律和法規(guī)。銷售可以根據(jù)通過服務互動和/或其他數(shù)據(jù)(如用戶人口統(tǒng)計數(shù)據(jù)和地理位置)定義的用戶特征來個體化或個性化。本文引用的所有出版物(包括專利和專利申請)在此以其整體并入本文作為參考。在本說明書和權利要求中，詞語“包含”或諸如“包括”或“含有”的變形將理解為暗示包含所述整體或整體組但不排除任意其他整體或整體組。認為前面的書面說明足以使本領域技術人員能夠實施本發(fā)明。提供以下實施例只是為了說明的目的，并非旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。事實上，對本領域技術人員而言，除本文顯示和描述的那些外，基于前面的描述本發(fā)明的多種改變是顯而易見的，且落在所附權利要求的范圍之內。本文引用的所有參考文獻(包括專利申請和出版物)為了所有目的以其整體并入本文作為參考。實施例實施例1：用于ipf中的存活預測的系統(tǒng)性生物標志的鑒定為了鑒定可以用來預測ipf存活的分子生物標志，我們首先用微列陣和qpcr法在來自40名ipf患者和8名未使用過的供體對照(“群組1”)的肺組織中進行了基因表達分析。然后我們從基因表達結果鑒定出候選預測血清生物標志。在80名ipf患者的單獨群組(“群組2”)中評估了候選預測血清生物標志的血清水平和肺功能，該群組是在universityofcalifornia,sanfrancisco的間質性肺疾病診所就診時收集。樣品采集后跟蹤生命狀態(tài)2-8年。方法人肺組織在universityofcalifornia,sanfranciscolungcenter在活組織檢查或肺移植時從ipf患者收集組織。非ipf對照收集自供體肺。其他細節(jié)在結果部分中提供。組織培養(yǎng)將imr-90細胞(atcc,manassas,va；目錄號ccl-186)培養(yǎng)在補充了10％fbs(sigma,st.louis,mo；目錄號f2442)和青霉素/鏈霉素(invitrogen,carlsbad,ca；目錄號15140)的dmem培養(yǎng)基中。將細胞接種在生長因子減少的matrigeltm(gfrmatrigeltm；bdbiosciences,bedford,ma；目錄號354230)床上。在冰上過夜融化matrigeltm，通過使matrigeltm在37℃硬化30分鐘來在12孔板中產生450ul/孔的床體積。然后將細胞(1e5-2e5)接種至matrigeltm床上。除非另有說明，用10ng/ml(il-13和tnfα)和3ng/ml(il-4)進行il-13刺激。rna制備在預冷(液氮中)的bessman組織粉碎機(tissuepulverizer)(spectrumlaboratories,ranchodominguez,ca；目錄號189475)中粉碎速凍的肺活檢組織樣品。將加至經(jīng)粉碎的物質，并吹吸幾次。在冰上溫育裂解物10-15分鐘。將裂解物保存在-80℃，直至進一步處理。按照廠家的方案從裂解物分離rna。然后按照廠家的方案用qiagenrneasy柱對分離的rna進行另一純化步驟。通過加入1ml(12孔板中的每個孔)并吹吸混合物幾次來收集組織培養(yǎng)細胞。用qiagenrneasy方案中所示的鋼珠/tissuelyser(qiagen)法(20s-1,4分鐘)勻漿裂解物。勻漿后，按照廠家的方案分離rna。然后按照廠家的方案用qiagenrneasy柱對分離的rna進行另一純化步驟。通過分光光度法(nanodrop,thermoscientific)測定rna濃度，并通過bioanalyzer(agilent)分析所有微列陣樣品。rt-qpcr按照廠家的方案用highcapacitycdnareversetranscriptionkit(abi,目錄號4368814)用隨機引物對100-300ng總rna進行反轉錄。用taqman測定進行實時qpcr。所有反應均在abi7900ht儀器或fluidigm平臺(48.48或96.96形式)上進行。il-13報道基因測定將l-luc-beas-2b(由genentech構建的細胞系；源自beas-2b,atcc,manassas,va；目錄號crl-9609)培養(yǎng)在用以下所示試劑包埋的gfrmatrigeltm中：12ng/mlil-13(r&dsystems,目錄號213-il)和抗-il-13封閉抗體(genentech)。唯一的改變?yōu)閮H測量螢火蟲螢光素酶，按照廠家的方案用dual-gloluciferaseassaysystem(promega,目錄號e2920)測量螢火蟲螢光素酶活性。微列陣分析用quickamp標記試劑盒(agilenttechnologies,目錄號5190-0444)擴增和標記rna以從1ug總rna產生標記的crna。用cy5標記實驗樣品；universalhumanreferencerna(stratagene,lajolla,ca)用于參照通道，且用cy3標記。cy5和cy3標記的crna競爭性雜交至兩色全人基因組4×44k基因表達微列陣平臺(agilenttechnologies,目錄號g4112f)。按照廠家的方案(agilent)洗滌雜交的微列陣，用agilentmicroarrayscanner采集所有特征強度。用featureextractionsoftwareversion7.5(agilent)、方案ge2-v5_95(agilent)分析所掃描的幻燈片的tiff圖像。標示的異常值不包括在任意后續(xù)分析中。所有數(shù)據(jù)都報告為染料歸一化的cy5/cy3比的log2值。將所有樣品的log2比值對相應的模擬處理樣品(或非ipf的對照)的平均log2比值歸一化。在比較不同的表達概況分析數(shù)據(jù)集時，首先如原研究中那樣，過濾、歸一化和集中公眾可得的數(shù)據(jù)集。kaminski數(shù)據(jù)集(gse10667)(konishi等,am.j.respir.crit.caremed.180(2):167-75(2009))是在全人基因組agilent微列陣平臺上運行的，因此，用平臺特異性探針標識符來連接數(shù)據(jù)集。用javatreeview產生熱圖(heatmap)。通過在r(limma)中建立并入了診斷、組織來源和性別(從y連鎖基因的表達分析推斷)這三個因素的線性模型來鑒定差異表達的基因。血液生物標志測定按照廠家的說明用市售測定法評估了血清中以下標志的水平：comp(abnova,taipei,taiwan,目錄號ka0021)；mmp7(r&dsystems,minneapolis,mn,目錄號dmp700)；cxcl13(r&dsystems,minneapolis,mn,目錄號dcx130)；ccl13(r&dsystems,minneapolis,mn,目錄號dy327)；ykl-40(r&dsystems,minneapolis,mn,目錄號dy2599)；mmp3(mesoscalediscovery,gaithersburg,md,目錄號k15034c)；saa(mesoscalediscovery,gaithersburg,md,目錄號k151eoc-1)；ccl11(嗜酸性粒細胞活化趨化因子(eotaxin))和ccl17(tarc)(mesoscalediscovery,gaithersburg,md,目錄號15031c)。按照廠家的說明用市售測定法(r&dsystems,目錄號dost00)評估了血漿中opn的水平。用之前所述的專利技術分析了血清骨膜蛋白(見例如國際專利申請?zhí)杙ct/us2011/065410)。使用市售測定法按照廠家的方案進行血清ccl18的測定，在該方案中進行了改變以減少基質干擾(r&dsystems,目錄號dy394)：用小鼠抗-人ccl18單克隆抗體在4℃過夜包被96孔板，然后用含1xpbsph7.4、0.5％bsa、0.05％tween20、0.25％chaps、5mmedta、0.35mnacl和15ppmproclin的緩沖液封閉。一式兩份地加入用含5％fbs的測定稀釋液1:1000稀釋的血清樣品，并在室溫(20℃)溫育平板2小時。洗滌后，將測定稀釋液中的生物素化山羊抗-人ccl18單克隆抗體加至平板，并在室溫(20℃)溫育1小時，所述測定稀釋液含5％山羊血清。洗滌后用鏈霉親和素-過氧化物酶和底物tmb顯色。此測定的檢出限為～7.8pg/ml。結果研究群組的特征對于獲自群組1的樣品，將來自40名ipf患者和8名對照的活檢組織用于微列陣和qpcr研究。ipf樣品中的11份獲自胸腔鏡活檢，29份樣品獲自在肺移植時取下的外植塊。所有對照組織都移植自未使用的供體肺。供體肺通常取自無患間質性肺疾病證據(jù)的受試者，該受試者死于非肺部原因(例如外傷)，但因為諸如死亡時間過長或由于血型、血管或hla錯配而不能獲得適宜的接受者的原因而不能用于移植。確認來自所有ipf活檢樣品的鄰近組織都具有常見型間質肺炎(uip)模式。之前已描述了由31份ipf樣品和15份對照樣品組成的可供公開下載的重復數(shù)據(jù)集(konishi等,am.j.respir.crit.caremed.180(2):167-75(2009))。對于獲自群組2的樣品，從在universityofcalifornia,sanfrancisco的間質性肺疾病診所就診的80名ipf患者中的每一名采集血清和血漿。此群組的臨床和人口學特征描述于以下表1中。用來自健康對照的血清(n＝29)或血漿(n＝10)來確定生物標志水平的正常范圍。表1.群組2的臨床和人口統(tǒng)計特征變量中位數(shù)(iqr)除非另有說明性別(男性:女性)62:16初次就診年齡，中位數(shù)(范圍)70(50-87)后續(xù)肺移植(是:否)7:63曾是吸煙者(是:否)58:16目前是吸煙者(是:否)1:73全身性類固醇±硫唑嘌呤(是:否)21:59預測的fvc％69(57-81)預測的tlc％70(59-78)預測的dlco％48(36-60)呼吸困難得分110(5.5-16)放射照相得分212(7.7-20.4)fvc＝用力肺活量；tlc＝肺總量；dlco＝擴散量(用一氧化碳測量)；iqr＝四分位數(shù)間距，第25-75百分位；1＝在watters等,ann.rev.resp.dis.133:97(1986)的1-20的量表上的呼吸困難得分；2＝根據(jù)best等,radiology246:935(2008)中所述的方法的纖維化的肺的百分比的放射照相得分估計。ipf中的差異表達基因的鑒定我們用全人基因組微列陣(agilenttechnologies,目錄號g4112f)進行了的rna的基因組范圍轉錄組(transcriptome)分析，所述rna從群組1(40名ipf患者和8名未使用的供體對照受試者)的肺組織分離。將有限的可用元數(shù)據(jù)(性別、組織來源(活檢組織或在肺移植時收集的組織))包含在用來鑒定ipf患者和對照之間的差異表達(de)基因的線性模型中。我們將2940個微列陣探針鑒定為與對照組織相比在ipf組織中差異表達(q<0.05,倍數(shù)變化>1.5)(部分列表顯示在表2中)。為了降低此處觀察到的總體ipf表達譜受到由樣品收集方法或其他混雜因素引起的系統(tǒng)偏差影響的概率，我們將表達譜與相似但獨立產生的ipf數(shù)據(jù)集(konishi等,am.j.respir.crit.caremed.180(2):167-75(2009))相比較。此數(shù)據(jù)集(gse10667)描述了來自31名ipf患者的肺活檢組織和15份對照肺組織的表達譜，所述肺組織從在肺腫瘤切除后的周圍非惡性區(qū)域收集。我們針對每個基因計算了描述相比于對照樣品ipf樣品的表達水平偏差的t統(tǒng)計。在對二者作圖時，我們發(fā)現(xiàn)了高度的相似性(數(shù)據(jù)未顯示)。由于兩個數(shù)據(jù)集是獨立地產生，所以相似的t統(tǒng)計支持每項研究的有效性，并降低了由研究特異的因素或技術誤差引起的轉錄組范圍效應的概率。ipf中的細支氣管、淋巴和成纖維細胞/肌成纖維細胞基因表達特征ipf和對照(如上文所討論)之間2490個de微列陣探針的無監(jiān)督雙向分層聚簇顯示圖1a中所示的主要由診斷(例如ipf或對照)限定的三個主要聚簇；組1聚簇、組2聚簇和組3聚簇。我們重新聚簇了組1(圖1b中所示的熱圖)、組2(圖1c中所示的熱圖)和組3(圖1d中所示的熱圖)。在圖1b-d中所示的熱圖中，我們觀察到幾組似乎在ipf患者內異源的共調節(jié)基因。這些共調節(jié)基因的組中的三個分別富集支氣管上皮(見表2；也稱為組1聚簇)、淋巴聚集體(也稱為濾泡)(見表3，也稱為組2聚簇)和肌成纖維細胞(見表4，也稱為組3聚簇)中表達的基因。組1聚簇或細支氣管組包含黏蛋白(mucl1、muc4、muc20)；富含脯氨酸的分泌因子(prr7、prr15、sprr1b、sprr2d)；角蛋白(krt5、krt6b、krt13、krt14、krt15、krt17)；絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpinb3、serpinb4、serpinb5、serpinb13)；離子通道和相關因子(clca2、trpv4)；纖毛成分(bbs5)；以及mmp3和saa4。這些基因是分化的支氣管上皮而不是正常肺實質中預期的肺泡上皮的特征，且這類基因的表達與之前的ipf中肺泡腔的異?！凹氈夤苄纬伞钡膱蟮酪恢拢淇赡艽砼c嚴重瘢痕形成相關的蜂窩狀囊腔(cysticspace)的上皮形成(chilosi等,labinvest.82(10):1335-45(2002))。細支氣管特征與報道為在來自伴隨性肺纖維化和肺動脈高壓患者的肺組織中上調的基因特征(包括tp63、clca2、fgf14、ptprz1、sox2、dsc3、cp、mmp1、muc4、serpinb3、serpinb13和多種角蛋白(mura等,chest141:661-673(2012)))驚人地相似。因此，與瘢痕形成、蜂窩樣和細支氣管形成相關的降低的組織順應性和受損的氣體交換可能有助于增加肺血管阻力和隨后的肺動脈高壓。我們還注意到，此聚簇內的某些基因下調，這些基因包括notch4、鈣黏著蛋白、wnt7a和dkk2。表2.與細支氣管基因表達特征相關的差異表達基因(>1.5倍上調，q<0.05)的部分列表探針id＝agilent全人基因組微列陣上的探針的標識號；基因符號＝ncbientrez基因符號；基因名稱＝ncbientrez基因名稱；entrezid＝ncbientrez基因id；logfc＝ipf樣品中的表達水平以2為底的對數(shù)的平均值減去健康對照樣品中的表達水平以2為底的對數(shù)的平均值；p-值＝用t檢驗計算每個探針的ipf和對照之間的差異表達；調整的p-值＝用bonferroni的方法對多個測試調整。在ipf中顯示異質性的高度共調節(jié)的基因的第二聚簇(組2聚簇；圖1a)包括與淋巴小結(也稱為聚集體)相關的基因。以下組的基因在ipf患者中的組2聚簇中上調：b細胞特異性基因(cd19、cd20[ms4a1]、bcma[tnfrsf17]、blk和blnk)；多個免疫球蛋白基因及cd79a和cd79b；t細胞和apc基因(cd27、cd28、cd1)；fc受體基因(fcrla、fcrl2、fcrl5)；趨化因子及其受體(cxcl13、cxcr3、cxcr5、ccr6、ccr7)。這種基因表達模式與之前的報道一致，該報道顯示ipf活檢組織中的活性纖維化的區(qū)域中的淋巴細胞數(shù)增加(nuovo等,mod.pathol.(2011)1-18)。我們選擇了這組高度共調節(jié)的基因，并重新聚簇數(shù)據(jù)集，其被限制為這些“淋巴基因”的表達模式(圖1c)。此分析產生表征為淋巴基因的低、中或高同步表達的三個主要亞組。低表達組包含所有對照和少數(shù)幾個ipf患者，而中和高表達組包含其余ipf受試者。表3.與淋巴小結基因表達特征相關的差異表達基因(>1.5倍上調，q<0.05)的部分列表探針id＝agilent全人基因組微列陣上的探針的標識號；基因符號＝ncbientrez基因符號；基因名稱＝ncbientrez基因名稱；entrezid＝ncbientrez基因id；logfc＝ipf樣品中的表達水平以2為底的對數(shù)的平均值減去健康對照樣品中的表達水平以2為底的對數(shù)的平均值；p-值＝用t檢驗計算每個探針的ipf和對照之間的差異表達；調整的p-值＝用bonferroni的方法對多個測試調整。在ipf中顯示異質性的高度共調節(jié)的基因的第三聚簇包括與成纖維細胞分化為肌成纖維細胞和創(chuàng)傷愈合相關的基因。此聚簇包括多個基因，其編碼膠原(col1a1、col1a2、col5a2、col12a1、col14a1、col15a1、col16a1、col18a1、cthrc1)、生長因子(hgf、igfbp7、scgf)、賴氨酰氧化酶(loxl1、loxl2)、hedgehog信號傳遞的介質(gli1、gli2、smo)、wnt信號傳遞的介質(sfrp2、dio2)、cdh11、骨膜蛋白和tgfb3。這種模式與之前的報道一致，該報道顯示與ipf中的肌成纖維細胞和/或成纖維細胞病灶(foci)相關的許多介質的表達增加(elliott等,j.cellscience125:121-132(2012)；barry-hamilton等,naturemed.16:1009-1017(2010)；schneider等,faseb26:503-512(2012)；okamoto等,theeuropeanrespiratoryjournal:officialjournaloftheeuropeansocietyforclinicalrespiratoryphysiology37:1119-1127(2011)；guy等,hepatologydoi:10.1002/hep.25559(2011)；lam等,curr.op.inrheum.23:562-567(2011)；lomas等,intn’lj.clin.andexp.pathol.5:58-71(2102))。我們選擇了這組高度共調節(jié)的基因，并重新聚簇數(shù)據(jù)集，其被限制于這些“肌成纖維細胞”基因的表達模式(圖1d)。此分析產生表征為肌成纖維細胞相關基因的低、中或高同步表達的三個主要亞組。低表達組包含所有對照和少數(shù)幾個ipf患者，而中和高表達組包含其余ipf受試者。表4.與肌成纖維細胞基因表達特征相關的差異表達基因(>1.5倍上調，q<0.05)的部分列表探針id＝agilent全人基因組微列陣上的探針的標識號；基因符號＝ncbientrez基因符號；基因名稱＝ncbientrez基因名稱；entrezid＝ncbientrez基因id；logfc＝ipf樣品中的表達水平以2為底的對數(shù)的平均值減去健康對照樣品中的表達水平以2為底的對數(shù)的平均值；p-值＝用t檢驗計算每個探針的ipf和對照之間的差異表達；調整的p-值＝用bonferroni的方法對多個測試調整。為了測定細支氣管、淋巴和肌成纖維細胞特征是否在單個受試者中彼此相關，我們通過使用各聚簇中的所有基因的歸一化的平均表達來取得了各特征的表達指數(shù)。這允許我們在個體患者的基礎上比較各特征的強度。雖然大多數(shù)ipf受試者具有比對照高的細支氣管、淋巴或肌成纖維細胞特征得分，但各得分中存在廣泛的變化，在患有ipf的單個受試者內，兩種特征未顯示任何顯著的相關模式(圖1e)。此結果表明，三種特征可以反映在ipf患者中異質表達的正交過程和/或反映在ipf組織中異質過程的差異取樣。為了測定所選擇的包含在三種特征的每一種中的基因是否在ipf肺組織的空間上不同的區(qū)域表達，我們在取自ipf肺外植塊(n＝5)的活檢組織的冷凍切片上進行了免疫組織化學(ihc)。我們發(fā)現(xiàn)，表征為蜂窩狀囊的細支氣管形成區(qū)域以具有豐富的細胞質的柱狀上皮細胞為襯里(圖2a)，靠近但不同于膠原沉積的區(qū)域(圖2b)。這些上皮細胞為角蛋白14(由包含在細支氣管特征中的基因編碼的蛋白質)染色陽性(圖2c)，且表達通過pas染色檢測到的黏蛋白(圖2d)。在空間上不同的區(qū)域，我們觀察到具有h&e深染色細胞核的細胞聚集體(圖2e)，靠近但不同于高膠原沉積的區(qū)域(圖2f)。這些聚集體為cd20(由包含在淋巴特征中的基因編碼的b細胞表面標志)染色陽性(圖2g-h)。細支氣管形成區(qū)在空間上不同于淋巴聚集體(圖2i和j)，且細支氣管形成區(qū)和淋巴聚集體通常出現(xiàn)在高膠原沉積的區(qū)域附近，但在空間上不同于高膠原沉積的區(qū)域(圖2b和f)；多個膠原基因包含在成纖維細胞特征中。編碼候選血清生物標志的差異表達基因的鑒定為了縮減評價為編碼候選血清生物標志的候選基因的列表以及以其他方式鑒定評價為生物標志的候選血液蛋白質，我們應用了在ucsf群組1數(shù)據(jù)集和gse10667數(shù)據(jù)集(konishi等,am.j.respir.crit.caremed.180(2):167-75(2009))中都是在ipf中上調>2倍的更嚴格的截斷。此分析產生了在兩個數(shù)據(jù)集中共同上調的291個基因(見表5)。這些共同基因中的一些編碼可能在外周血中檢測的胞外和/或分泌性蛋白質，因此可以是用于進一步評價為可能的血清生物標志或其他生物標志的良好的候選者。基于這些結果和之前公開的數(shù)據(jù)及易于獲得的用于血清生物標志檢測的測定，我們選擇了以下基因作為ipf中的候選預測血液生物標志：ykl-40、comp、opn、mmp7、骨膜蛋白、cxcl13、ccl11(嗜酸性粒細胞活化趨化因子)、ccl13、ccl17(tarc)、ccl18、mmp3和血清淀粉樣蛋白a(saa)(尤其是組成型saa)、saa4。(見例如korthagen等,resp.med.105:106-113(2011),pardo等,plosmed.2(9):891-903(2005),richards等,amjrespircritcaremed,doi:10.1164/rccm.201101-0058oc(2011),yokoyama等,respirology11:164-168(2006),kinder等,chest135:1557-1563(2009))。此外，之前已將ccl18報道為ipf中存活的預測生物標志(prasse等,amj.respir.crit.caremed.179:717-723(2009))，但它在我們的微列陣實驗中未檢測為顯著de。按照與它們預測的生物學相關的多種分類選擇了血液生物標志。ccl11、ccl13、ccl17和ccl18是與2型炎癥相關的趨化因子。我們之前已顯示ccl13和ccl17在哮喘中響應il13阻斷而受藥效調節(jié)(correnthenewenglandjournalofmedicine365:1088-1098(2011))。骨膜蛋白與il13生物學相關(correnthenewenglandjournalofmedicine365:1088-1098(2011)；woodruff等,procnatlacadsciusa104:15858-15863(2007)；woodruff等,amjrespircritcaremed180:388-395(2009)；jia等,thejournalofallergyandclinicalimmunology130(3):647-654.e10(2012))，且是上述成纖維細胞基因特征中的代表性基因。cxcl13是在集合淋巴結中高表達的b細胞化學引誘物，且是上述淋巴基因特征中的代表性基因。mmp3和saa4是上述細支氣管基因特征中的代表性基因。ykl-40是與髓樣細胞激活相關的幾丁質酶-樣蛋白質，其系統(tǒng)水平(systemiclevel)在多種疾病狀態(tài)中提高。之前公開的研究已顯示，ykl-40在ipf中高表達，ykl-40的血清水平是存活的預測(korthagen等,respiratorymedicine105:106-113(2011))。comp由tgfβ誘導，且在硬皮病中的肌成纖維細胞中高表達(farina等,matrixbiology:journaloftheinternationalsocietyformatrixbiology25:213-222(2006)；farina等,annalsoftherheumaticdiseases68:435-441(2009))。opn和mmp7在ipf組織中高表達；已顯示opn的血液水平與ipf中的肺功能負相關(kadota等,respiratorymedicine99:111-117(2005))，且已顯示mmp7的血液水平是ipf中存活的預測(richards等,amjrespircritcaremed185(1):67-76(2012))。為了驗證這些候選生物標志基因在ipf肺中的差異表達，我們對用于微列陣實驗的同一rna樣品進行了定量rt-pcr(qpcr)(見方法)。表6顯示微列陣基因表達，圖3a-g顯示qpcr數(shù)據(jù)。如表6和圖3a-g中所示，我們觀察到，相對于對照，所選擇的每個候選生物標志基因在ipf患者中的表達顯著提高。表5.兩個獨立的ipf數(shù)據(jù)集中的差異表達基因(上調>2.0倍，q<0.05)的部分列表基因符號＝ncbientrez基因符號；logfc＝ipf樣品中的表達水平以2為底的對數(shù)的平均值減去健康對照樣品中的表達水平以2為底的對數(shù)的平均值；調整的p-值＝用bonferroni的方法對多個測試調整。表6.通過微列陣測定的候選生物標志基因在ipf活檢組織中的基因表達為了確定所選擇的標志在ipf中相對于對照提高的基因表達水平是否對應于外周血中由那些基因編碼的蛋白質的提高的水平，我們在群組2ipf樣品(n＝80)中及來自健康對照的樣品中評價了它們在血漿(opn)或血清(全部其他)中的水平。對于血漿對照，n＝10；對于血清對照，n＝29。按上文所述進行血液生物標志中的每一種的測定。所有ipf患者與所有對照相比，ykl-40、comp、opn、mmp7、ccl11、ccl13、ccl17、ccl18、saa和cxcl13的外周血水平在ipf中顯著提高(表7)。使用針對ipf和對照的wilcoxon秩和檢驗，我們獲得了以下p-值：ykl-40、comp、mmp7、ccl13、ccl18和cxcl13，p<10-4；opn，p＝0.04。相對于對照，一些ipf患者具有提高的血清骨膜蛋白或mmp3水平，但總體上這種差異未達到統(tǒng)計顯著性。之前的報道表明，在ipf肺和外周血中可檢測到提高的骨膜蛋白水平(okamoto等,theeuropeanrespiratoryjournal:officialjournaloftheeuropeansocietyforclinicalrespiratoryphysiology37:1119-1127(2011))。之前已顯示免疫調節(jié)療法(具體而言，糖皮質激素)可以降低骨膜蛋白的基因表達水平(woodruff等,proc.natl.acad.sci.104(40):15858-63(2007)；woodruff等,amj.respir.crit.caremed.180(5):388-95(2009))，并預期骨膜蛋白的外周血水平在這種療法的存在下將相似地降低。因此，ipf患者中血清骨膜蛋白水平的變化及與對照相比缺乏顯著差異可以解釋為事實上采集樣品時21/80ipf患者正處于免疫調節(jié)治療(it，全身糖皮質激素或硫唑嘌呤)。因此，我們檢查了該生物標志中任一種(包括骨膜蛋白)的外周血水平在處于it的ipf患者和不處于it的ipf患者之間是否不同。與不處于it的ipf患者相比，處于it的ipf患者顯示comp和骨膜蛋白的較低水平的趨勢。相反，與不處于it的ipf患者相比，處于it的ipf患者具有顯著提高的cxcl13、mmp3和saa水平(表7)。根據(jù)it狀態(tài)，任意其他生物標志的水平不存在顯著的差異或差異趨勢。表7.ipf患者及對照中血清生物標志水平的范圍和分布1＝對于除骨橋蛋白和mmp3外的所有生物標志，n＝29對照和n＝80ipf患者，值為血清水平；對于骨橋蛋白，n＝10對照和n＝80ipf患者，值為血漿水平；對于mmp3，n＝29對照和n＝78ipf患者；iqr＝四分位數(shù)間距，第25-75百分數(shù)。2＝ipf中顯著高于對照，wilcoxon秩和檢驗p<0.05。3＝在處于免疫調節(jié)治療(it)狀態(tài)的ipf患者中趨于顯著不同，秩和檢驗p<0.1。然后我們評價了單個生物標志與人口統(tǒng)計和臨床變量之間的相關性。在所測試的8個生物標志中，只有opn在之前的吸煙狀態(tài)中顯示顯著差異，其中血漿opn水平在前吸煙者中低于從未吸煙者(p＝0.01，數(shù)據(jù)未顯示)。在臨床變量的比較中，我們觀察到預測的肺總量(tlc)％和預測的用力肺活量(fvc)之間以及每個肺活量測定變量和擴散量(dlco％預測)之間表面上顯著的正相關。我們還觀察到呼吸困難得分(watters等,am.rev.respir.dis.133(1):97-103(1986))、fvc％預測和dlco％預測之間的負組間相關(表8)。在血液生物標志中，我們通常觀察到mmp7、骨膜蛋白和comp之間及opn、ykl-40、saa、mmp3、ccl11和cxcl13之間的弱組間相關；ccl13和ccl17之間的強組間相關。所觀察到的通常低的相關系數(shù)表明，總體上，生物標志的水平在群體中大致相互正交(表8)。我們還觀察到單個生物標志和臨床/人口統(tǒng)計變量之間相對少的顯著相關；在這些顯著相關中，cxcl13與預測的dlco％負相關，與呼吸困難得分正相關；ccl11與放射照像得分正相關；saa與預測的tlc％負相關，與放射照像得分和呼吸困難得分正相關；mmp3與預測的fvc％負相關，與呼吸困難得分正相關；opn和comp與年齡弱相關(表8)。表8.生物標志和臨床/人口統(tǒng)計特征的相關性rs＝spearman等級相關；p-值指spearman相關。建立血液生物標志的預測值之前的研究已顯示肺功能、擴散量、吸煙狀態(tài)和年齡的單時間點值(singletimepointvalue)對ipf患者中隨后的存活的的預測值的弱至無影響。與那些發(fā)現(xiàn)一致，除預測的fvc％外，我們未觀察到針對那些單個變量的任何顯著的存活差異，其中與顯示<69％的預測的fvc％的患者相比，顯示大于群體的中位數(shù)的預測的fvc％(>69％)的患者具有存活優(yōu)勢(hr＝0.37，p＝0.02，圖4)。為了評價多種血液生物標志的后續(xù)存活預測值，我們用cox比例風險模型來單個地評估了該血液生物標志(骨膜蛋白、ccl13、ccl18、骨橋蛋白、comp、ykl-40、mmp3、mmp7、saa和cxcl13)中每一個的預測值。在那些生物標志中，我們發(fā)現(xiàn)，基線處的cxcl13、ykl-40、comp、opn、mmp3和saa水平顯著地區(qū)分ipf患者隨后的無移植存活(圖5a-d和表9)。與之前公開的報道(richards等,amjrespircritcaremed,doi:10.1164/rccm.201101-0058oc(2011)；prasse等,amjrespircritcaremed179:717-723(2009))相反，我們未在此群組中觀察到mmp7或ccl18水平的任何預測值，我們也未在此群組中觀察到所測試的任意其他生物標志(包括ccl13和骨膜蛋白)的統(tǒng)計上顯著的預測值。表9.ipf患者中單個生物標志的預測值生物標志exp(系數(shù))p-值骨膜蛋白1.0170.2ccl111.0020.05ccl131.0000.7ccl171.0000.4ccl180.9940.3mmp31.0185.0x10-8saa1.0003.0x10-4cxcl131.0037.3x10-6comp1.0000.030opn1.0260.004ykl-401.0060.010mmp71.0530.1由于單個預測標志cxcl13、ykl-40、opn、comp、mmp3和saa的水平在ipf患者內未高度組間相關，我們檢查了這些標志的組合是否可以進一步增強預測值的準確性。我們評估了上文所示的六種生物標志的每種可能的組合的合成值來用受者作用特征(roc)分析預測樣品采集后1、2和3年內的死亡率。我們發(fā)現(xiàn)，一般而言，與三種或多種生物標志的組合相比，單個生物標志或生物標志對表現(xiàn)得較差(圖6a)。為了確定組合的生物標志的最佳的最小數(shù)目，我們評估了2年時的roc分析的曲線下面積和六種生物標志的所有可能的組合的期限顯著性，并發(fā)現(xiàn)許多3種生物標志的組合與4種或多種生物標志的組合的表現(xiàn)相當(圖6b)。為了達到類別間ipf患者數(shù)目的相對可比的分布，我們設計了簡單的評分系統(tǒng)，每種生物標志高于整個群組中位數(shù)(medianlevel)的基線生物標志水平由此獲得1的得分。因此，具有全部4種生物標志都低于中位數(shù)的生物標志水平的患者指定0的得分，一種生物標志高于中位數(shù)而另外3種生物標志低于中位數(shù)的患者指定1的得分，等等。我們推導了各生物標志的以下值。cxcl13的中位數(shù)為80pg/ml；ykl-40的中位數(shù)為105ng/ml；comp的中位數(shù)為901ng/ml；opn的中位數(shù)為69ng/ml(見表7)。此評分系統(tǒng)用cox比例風險模型顯著地按存活區(qū)分患者組(p<10-6，圖7)。用在roc分析中表現(xiàn)最好的三種生物標志的組合(mmp3、comp和ykl40)來達到類別間ipf患者數(shù)目的相對可比較的分布，我們應用了上述評分系統(tǒng)，其中全部3種生物標志都低于中位數(shù)的患者指定0的得分，1種生物標志高于中位數(shù)而另外2種生物標志低于中位數(shù)的患者指定1的得分，任意2種生物標志高于中位數(shù)但第三種生物標志低于中位數(shù)的患者指定2的得分，全部3種生物標志都高于中位數(shù)的患者指定3的得分。此評分系統(tǒng)用cox比例風險模型顯著地按存活區(qū)分患者組(p<10-9，圖8；對kaplan-meier存活數(shù)據(jù)進行作圖)。在得分為0的15名患者中，只有1名在隨訪期內記錄到死亡，而得分為3的所有患者在樣品采集的500天內死亡。因此，我們已顯示，測量某些生物標志(cxcl13、ykl-40、comp、opn、mmp3和saa)的血液水平并確定各生物標志的值落在中位數(shù)之上或之下可以用來在診斷時評估ipf患者的存活預測。此外，用本文所述的評分系統(tǒng)來評估生物標志cxcl13、ykl-40、comp和opn中的零個、一個、兩個、三個或全部四個或生物標志mmp3、comp和ykl-40中的零個、一個、兩個或全部三個的血液生物標志水平處于ipf患者中位數(shù)之上或之下，可以提高存活預測的準確性。這種系統(tǒng)用于鑒定進行積極治療干預(aggressivetherapeuticintervention)或進行肺移植的患者，以及為治療劑的臨床試驗而分層進行的患者。ipf中的風險預測對作出諸如肺移植的治療和患者管理決策很重要，且用于分層研究性治療劑的臨床試驗中的招募者。由于肺的直接取樣在ipf患者中通常不現(xiàn)實或不可行，疾病活動和進展的非侵入性評估具有重要價值。通過隨時間推移重復測量的測量方法在監(jiān)測單個患者的疾病進展中具有一些效用，所述測量方法為高分辨率計算層析x射線照相術(hrct)、肺活量測定法及肺功能的其他測量(如擴散量和運動耐量)，但肺功能的單點評估在群體基礎上具有相對少的信息(ley等,amj.respir.crit.caremed.183:431-440(2011))。本文所述的基于血液的生物標志在以下幾個水平上具有能夠進行ipf藥物研發(fā)和ipf的臨床管理的潛能：疾病活動的預測、預后、藥效和替代測量。預測生物標志在治療之前提供特定分子途徑的活性的證據(jù)，鑒定出最有可能從靶向療法受益的患者亞群。如果只有不能以其他方式預期地鑒定的患者亞組顯示益處，那么給定途徑可能在ipf患者群體內異質性表達，并且鑒定靶向該途徑的試劑的臨床益處的能力可能受損。鑒定最有可能從靶向治療劑受益的ipf患者的預測生物標志可以幫助分層臨床試驗中的招募者以更嚴格地測試治療假說。預測生物標志分層未來疾病進展或死亡的風險。鑒于ipf中的高死亡率，可以預期成功的治療干預相對于安慰劑顯著延長壽命。但是，鑒于疾病軌跡的可變性，在不治療大量患者許多年的情況下在早期臨床試驗中評估存活益處富有挑戰(zhàn)。用鑒定最有可能在1-2年的時期內遭受顯著疾病進展或死亡的ipf患者的預測生物標志分層臨床試驗中的招募者以評估在試驗中最有可能進展的患者中是否存在短期存活益處。此外，給定的治療干預可能使具有相對好的預測的患者受益，但在疾病已進展通過某個不可逆點的患者中無效。例如，bibf1120的最近的2期研究的亞組分析顯示，在基線具有高于70％預測fvc的患者中觀察到了大部分安慰劑對肺功能的調節(jié)益處，而具有小于70％預測fvc的患者未顯示太多益處(richeldi等,abstract,ers2011annualcongress)。藥效生物標志應反映涉及疾病過程的特定分子途徑的近似活性，且應在對具體治療干預的響應中變化。治療后藥效標志的變化顯示分子干預是否以及以什么程度影響其靶標；因此，這些標志可以幫助能夠在劑量范圍研究中進行適當?shù)膭┝窟x擇。在具有不易確定的短期臨床結果測量方法的疾病(如ipf)中，缺乏任何臨床益處的情況下的顯著的藥效作用可以幫助區(qū)分試驗失敗的原因：不適當?shù)陌袠诉x擇和不適當?shù)膭┝?。替代生物標?如藥效標志)應響應治療而變化，但可以遠離所靶向的途徑，并與疾病的下游表現(xiàn)和臨床結果更密切地關聯(lián)。替代生物標志在短期內的變化可以指示持續(xù)治療如對存活結果的可能的長期有效性。給定的生物標志可以代表預測、預后、藥效和替代種類中的任一個、幾個或全部。il-13是纖維化的介質，已暗示為ipf中潛在的治療靶標(wynn,ta,j.exp.med.208:1339-1350(2011))。如上文所討論，我們發(fā)現(xiàn)，il-13及可能受il-13調節(jié)的基因(如il13rα2、ccl11、ccl13、ccl17、ccl18和骨膜蛋白)在來自ipf患者的肺活檢組織中高水平表達。在一項ii期研究中，治療性il-13阻斷證明在哮喘中的臨床益處，且該益處在患者亞組中增強，通過血清骨膜蛋白水平測定在所述患者亞組的氣道中具有的提高的il-13表達(corren等,newengl.j.med.365:1088-1098(2011))。在上文討論的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，在整個ipf患者群組中，血清骨膜蛋白水平并未顯著高于在健康對照中測量的那些血清骨膜蛋白水平(表7)。但是，骨膜蛋白水平在ipf患者亞組中明顯提高(表7)，且血清骨膜蛋白水平在ipf中的分布類似于在嚴重哮喘中觀察到的分布(jia等,thejournalofallergyandclinicalimmunology130(3):647-654.e10(2012))。骨膜蛋白在本文所述的成纖維細胞/肌成纖維細胞特征中表達，且已通過ihc定位至ipf中的成纖維細胞病灶(okamoto等,theeuropeanrespiratoryjournal:officialjournaloftheeuropeansocietyforclinicalrespiratoryphysiology37:1119-1127(2011))。如果il-13阻斷在ipf患者中具有臨床效應，則它可以僅在具有提高的治療前血清骨膜蛋白水平的患者亞組中是明顯的。類似地，我們發(fā)現(xiàn)，ccl13和ccl17水平在哮喘患者中提高，且響應治療性il-13阻斷而顯著減少(corren等,newengl.j.med.365:1088-1098(2011))。由于ccl13和ccl17水平在ipf患者中提高，ccl13和ccl17也可以作為ipf中的il-13途徑活性的藥效標志。ccl11是響應il-13而上調的基質細胞的產物(matsukura等,am.j.ofrespir.cellandmol.biol.24:755-761(2001))。ccl18是選擇性激活的巨噬細胞的產物(prasse等,arthritisandrheum.56:1685-1693(2007))，該巨噬細胞本身可以是il-13的來源(kim等,naturemed.14:633-640(2008))。因此，ccl11和ccl18也可以在ipf中的il-13阻斷的治療研究中作為預測和/或藥效生物標志。opn、ykl-40、comp、cxcl13、mmp3和saa的血清水平各顯著地預測ipf中的后續(xù)疾病進展。但是，它們的水平在所檢查的患者群體內不是顯著地組間相關。每種標志可以由不同的細胞來源產生，并反映ipf病灶內的不同致病過程的活性。opn在ipf中以提高的水平表達(pardo等,plosmed2:e251(2005))，且已將其表達定位至纖維細胞病灶和uip病灶中的增生性肺泡上皮(kelly等,amjrespircritcaremed174:557-565(2006))。認為opn在細胞黏附、遷移、炎癥和組織重塑中發(fā)揮作用(o'regan,a.,cytokine&growthfactorreviews14:479-488(2003))，opn缺失的小鼠免受博來霉素誘發(fā)的肺纖維化(berman等,americanjournalofphysiologylungcellularandmolecularphysiology286:l1311-1318(2004))。其他研究人員已報道了血漿opn水平在ipf患者中提高，在ipf內，opn水平與氧飽和負相關(kadota等,respiratorymedicine99:111-117(2005))。ykl-40是主要由骨髓衍生細胞如活化的巨噬細胞產生的幾丁質酶-樣蛋白質(rehli等,thejournalofbiologicalchemistry278:44058-44067(2003))。它的系統(tǒng)水平在與組織重塑相關的炎性病癥和贅生性病癥(neoplasticcondition)中提高(lee等,annualreviewofphysiology73:479-501(2011))，我們的發(fā)現(xiàn)與之前的報道一致，該報道顯示基線血清ykl-40水平是ipf患者中隨后的死亡率的預測(korthagen等,respiratorymedicine105:106-113(2011))。comp是主要由軟骨、韌帶、腱和骨中的成纖維細胞表達的胞外基質蛋白。在系統(tǒng)性硬化癥患者中，發(fā)現(xiàn)病灶皮膚肌成纖維細胞表達提高水平的comp，且其表達可由tgfβ誘導(farina等,matrixbiology:journaloftheinternationalsocietyformatrixbiology25:213-222(2006)；farina等,annalsoftherheumaticdiseases68:435-441(2009))。cxcl13是由小結樹突細胞產生的趨化因子。它通過與其關聯(lián)受體(cognatereceptor)cxcr5結合以將b細胞招募至二級和三級淋巴結構，都為淋巴小結形成所需(ansel等,nature406:309-314(2000))。最近，已報道集合淋巴結與ipf活檢組織中的uip病灶相關(nuovo等,mod.pathol.(2011)1-18)，并已在腎纖維化中報道了具有高cxcl13表達水平的b細胞浸潤物(heller等,theamericanjournalofpathology170:457-468(2007))。已將血清cxcl13描述為關節(jié)磨損(jointerosion)的嚴重度(meeuwisse等,arthritisandrheumatism63:1265-1273(2011))和類風濕性關節(jié)炎中利妥昔單抗(rituximab)治療后的b細胞再繁殖(rosengren等,rheumatology(oxford)50:603-610(2011))的生物標志。cxcl13表達與本文所述的淋巴特征聚簇。mmp3和saa4在本文所述的細支氣管特征中表達。已描述了來自ipf患者的bal液中提高的mmp3蛋白水平(richter等,thorax64:156-161(2009))，但之前未描述過將mmp3的系統(tǒng)水平作為ipf的生物標志。saa是在許多炎性病癥中增加的急性期反應物，但未描述為ipf的生物標志。總結起來，這六種生物標志(opn、ykl-40、comp、cxcl13、mmp3和saa)中的每一種在ipf患者中的系統(tǒng)水平可以反映不同致病過程的可變的相對貢獻。鑒于ipf病理學的地理異質性和斑片(patchy)性質，相比于來自單個小活檢組織的基因表達水平，這些生物標志的外周血水平可以提供更全面的ipf中累積疾病負荷(cumulativediseaseburden)的圖景。雖然與健康對照相比六種生物標志(opn、ykl-40、comp、cxcl13、mmp3和saa)中的大多數(shù)通常在ipf患者中增加，但這些生物標志中的每一種在ipf群體內的相對水平廣泛變動，且可以不同地影響疾病進展。因此，本文所述的多種生物標志的組合值可以提供比單個標志更多的益處。就臨床疾病進展評估這些標志隨時間的動態(tài)將是有益的。實施例2-ipf中的信號傳導途徑的表征已將il-13、tgfβ和上皮-間質通訊(包括hedgehog(hh)途徑)的介質與特發(fā)性肺纖維化(ipf)的病理發(fā)生相聯(lián)系。例如，已顯示小鼠肺中的轉基因il-13過表達足以誘發(fā)嚴重的肺纖維化(zhu等,j.clin.invest.103(6):779-88(1999))，il-13缺失的小鼠部分免受博來霉素誘發(fā)的纖維化以及血吸蟲誘發(fā)的肝纖維化。il-13與包含il-13rα1和il-4rα的異聚體(heteromeric)受體復合體結合，然后jak家族激酶磷酸化stat6，stat6是介導il-13和il-4下游信號傳遞的轉錄因子。第二il13受體il13rα2已顯示為非信號傳遞誘餌受體，可以與il13rα1/il4rα復合體競爭il13結合，從而減少stat6激活。il13rα2可以由依賴stat6以及不依賴stat6的信號誘導，且在纖維化組織以提高的水平表達。一些報道(fichtner-feigl等,nat.med.12(1):99-106(2006)；mandal等,inflammboweldis.16(5):753-64(2010))已表明，il13rα2可以轉導不依賴stat6的可以促成纖維化的信號，但這些研究依賴細胞系中的異位il13rα2過表達，且il13rα2信號傳遞的機制仍不清楚。il13rα2缺失的動物顯示增加的組織纖維化，而il13rα1缺失的動物顯示減少的組織纖維化(wilson等,j.clin.invest.117(10):2941-51(2007)；mentink-kane等,gastroenterology141(6):2200-2209(2011))。雖然在敲除動物中進行的這些研究就il13及其受體在引發(fā)纖維化中的作用而言信息豐富，但它們在已建立的纖維化的背景中(如在人纖維化疾病中)難以解釋。雖然一堆證據(jù)表明il13rα2形成不能在配體-受體結合時傳遞信號的誘餌受體，但似乎矛盾的一堆證據(jù)指向il13rα2在纖維發(fā)生中的積極作用。因此，對內源il13和il13rα2在人ipf中的作用仍知之甚少。為了增強我們對ipf中的分子途徑的理解，我們在ipf中及非ipf對照組織中表征了基因組范圍的轉錄譜。這些實驗導致在原代肺成纖維細胞中鑒定和表征了il13下游的信號傳導途徑。材料和方法人肺組織樣品按上文實施例1中所述獲得人肺組織樣品。組織培養(yǎng)將imr-90細胞(atcc,manassas,va；目錄號ccl-186)培養(yǎng)在補充了10％fbs(sigma,st.louis,mo；目錄號f2442)和青霉素/鏈霉素(invitrogen,carlsbad,ca；目錄號15140)的dmem培養(yǎng)基中。將細胞接種在生長因子減少的matrigel(gfrmatrigel)[bdbiosciences,bedford,ma；目錄號354230]床上。在冰上過夜融化matrigel，通過使基質膠在37℃硬化30分鐘以在12孔板中產生450ul/孔的床體積。然后將細胞(1e5-2e5)接種至matrigel床上。除非另有說明，用10ng/ml(il-13和tnfα)和3ng/ml(il-4)進行il-13刺激。rna制備在預冷(液氮中)的bessman組織粉碎機(spectrumlaboratories,ranchodominguez,ca；目錄號189475)中粉碎速凍的肺活檢組織樣品。將trizol加至經(jīng)粉碎的物質，并吹吸幾次。在冰上溫育裂解物10-15分鐘。將裂解物保存在-80℃，直至進一步處理。按照廠家的方案從trizol裂解物分離rna。然后按照廠家的方案用qiagenrneasy柱對trizol分離的rna進行另一純化步驟。通過加入1ml(12孔板中的每個孔)trizol并吹吸混合物幾次來收集組織培養(yǎng)細胞。用qiagenrneasy方案中所示的鋼珠/tissuelyser(qiagen)法(20s-1,4分鐘)勻漿trizol裂解物。勻漿后，按照trizol廠家的方案分離rna。然后按照廠家的方案用qiagenrneasy柱對trizol分離的rna進行另一純化步驟。通過nanodrop測定rna濃度，并通過bioanalyzer(agilent)分析所有微列陣樣品。rt-qpcr按照廠家的方案用highcapacitycdnareversetranscriptionkit(abi,目錄號4368814)用隨機引物對100-300ng總rna進行反轉錄。用taqman測定進行實時qpcr。所有反應均在abi7900ht儀器或fluidigm平臺(48.48或96.96形式)上進行。il-13報道基因測定將l-luc-beas-2b細胞(atcc目錄號crl-9609)培養(yǎng)在用以下試劑包埋的gfrmatrigel中：12ng/mlil-13(r&dsystems,目錄號213-il)和抗-il-13封閉抗體(genentech)。唯一的改變?yōu)閮H測量螢火蟲螢光素酶，按照廠家的方案用dual-gloluciferaseassaysystem(promega,目錄號e2920)測量螢火蟲螢光素酶活性。微列陣分析用quickamp標記試劑盒(agilent)擴增和標記rna以從1ug總rna產生標記的crna。用cy5標記實驗樣品；universalhumanreferencerna(stratagene,lajolla,ca)用于參照通道，且用cy3標記。cy5和cy3標記的crna競爭性雜交至兩色全人基因組4×44k基因表達微列陣平臺。按照廠家的方案(agilent)洗滌雜交的微列陣，用agilentmicroarrayscanner采集所有特征強度。用featureextractionsoftware(agilent)、方案ge2-v5_95(agilent)分析所掃描的幻燈片的tiff圖像。標示的異常值不包括在任意后續(xù)分析中。所有數(shù)據(jù)都報告為染料歸一化的cy5/cy3比的log2值。將所有樣品的log2比值對相應的模擬處理樣品(或非ipf的對照)的平均log2比值歸一化。在比較不同的表達概況分析數(shù)據(jù)集時，首先如原研究中那樣，過濾、歸一化和集中公眾可得的數(shù)據(jù)集。kaminski數(shù)據(jù)集(gse10667)是在全人基因組agilent微列陣平臺上運行的，因此，用平臺特異性探針標識符來連接數(shù)據(jù)集。用javatreeview產生熱圖(heatmap)。通過在r-code(limma)中建立并入了診斷、組織來源和性別(從y連鎖基因的表達分析推斷)這三個因素的線性模型來鑒定差異表達的基因。結果il13rα2是ipf肺組織中表達差異最大的基因我們進行了來自40名ipf患者和8名非ipf對照受試者的活檢肺組織的基因組范圍轉錄組分析。我們從這些臨床樣品分離了rna，并用全人基因組agilent微列陣(geo檢索id)分析了轉錄物。將有限的可用元數(shù)據(jù)[性別、組織來源(活檢組織或在肺移植時收集的組織)、診斷]包含在用來鑒定差異表達基因的線性模型中。我們將1508個基因鑒定為與對照組織相比在ipf組織中差異表達(q<0.05,倍數(shù)變化>|2|)。部分列表顯示在表10中。在ipf中顯著上調的基因有基質金屬蛋白酶(mmp1、3、7、10、11、12、13、16)、膠原(col15a、10a1、8a2、1a1、24a1、6a3、7a1、1a2、5a2、3a1、17a1、14a1)和il-13途徑基因(il-13、il13rα2、postn和ccl13)。事實上，ipf中最顯著提高的基因是il13rα2，其顯示44倍的變化(q＝3.4x10-14)。我們通過進行定量rt-pcr驗證了此觀察結果(圖9)。表10.ipf中與il-13信號傳遞相關的差異表達基因(上調>1.5倍，q<0.05)的部分列表探針id＝agilent全人基因組微列陣上的探針的標識號；基因符號＝ncbientrez基因符號；基因名稱＝ncbientrez基因名稱；entrezid＝ncbientrez基因id；logfc＝ipf樣品中的表達水平以2為底的對數(shù)的平均值減去健康對照樣品中的表達水平以2為底的對數(shù)的平均值；p-值＝來自limma分析的線性模型中診斷項的效應顯著性的標稱p-值；調整的p-值＝在基因將是統(tǒng)計上顯著的最大p-值下估計的錯誤發(fā)現(xiàn)率。il-13在培養(yǎng)的原代肺成纖維細胞中誘導il13rα2表達如上文所討論，與對照、非ipf樣品相比，ipf樣品中最高度差異表達的基因是il13rα2，顯示在ipf中比在對照中高平均44倍的表達。我們嘗試發(fā)展易處理和相關的肺組織培養(yǎng)系統(tǒng)以更好地理解il13rα2的作用。將原代肺成纖維細胞(imr90)培養(yǎng)在生長因子減少(gfr)的基質膠上以模擬比塑料更接近生理狀態(tài)的生長基質。(除非另有說明，此實施例中的所有培養(yǎng)實驗都用培養(yǎng)在gfr基質膠上的細胞進行)。il-13或il-4刺激imr90細胞導致il13rα2的實質性(～8-10)誘導(圖10)。因此，這提供了實驗系統(tǒng)來用封閉抗體和小分子抑制劑研究內源誘導的而不是異位過表達的il13rα2的功能。il13rα2誘導減弱了原代肺成纖維細胞中來自il13rα1/il4rα的信號il13rα2具有短的胞質尾，該胞質尾缺乏典型的信號傳遞結構域。一些證據(jù)支持以下模型：il13rα2的胞外結構域(其可結合il-13)作為il13rα1/il4rα受體復合體的誘餌發(fā)揮作用并減弱依賴stat6的il-13信號。在研發(fā)該組織培養(yǎng)系統(tǒng)期間，我們觀察到，tnfα刺激誘導il13rα2在imr90細胞中的表達(圖11a)。雖然已顯示tnfα增強依賴il-13的il13rα2誘導，但未顯示tnfα單獨處理在其他系統(tǒng)中上調il13rα2。此培養(yǎng)系統(tǒng)的一個主要不同是將細胞培養(yǎng)在基質膠上。為了測試il-13存在于gfr基質膠中的可能性，我們進行了靈敏的il-13測定，其顯示培養(yǎng)在生長因子減少的基質膠上的細胞中檢測不到il-13(數(shù)據(jù)未顯示)。tnfα刺激的imr90細胞顯示提高的il13rα2表達提供了研究提高的il13rα2表達對il-13刺激的下游事件的影響的可能性。我們通過測量表達不受tnfα處理影響的已知stat6應答性基因(ccl26和骨膜蛋白)的轉錄物水平來監(jiān)測了對il-13和il-4的劑量反應性(圖11b)。如通過ccl26和骨膜蛋白基因誘導評估，已用tnfα預刺激(其導致增加的il13rα2表達)的細胞顯示對il-13但不是il-4(數(shù)據(jù)未顯示)降低的的敏感性(圖11b)，這可以通過提高il-13的劑量來克服。需要濃度高近10倍的il-13以在已用tnfα預刺激并顯示提高的il13rα2表達的細胞中達到相同水平的il-13的ccl26或骨膜蛋白基因誘導，而tnfα預處理未改變對il-4刺激(數(shù)據(jù)未顯示)的敏感性?？偨Y起來，這些數(shù)據(jù)顯示，tnfα介導的il13rα2誘導特異性減弱il-13結合il13rα1/il4rα受體復合體和通過il13rα1/il4rα受體復合體傳遞信號的能力，與il13rα2作為誘餌受體的作用一致。不同的抗-il13抗體選擇性阻斷與il13rα1/il4rα或il13rα2的結合雖然以上數(shù)據(jù)與il13rα2就il13rα1/il4rα信號傳遞而言是誘餌受體的模型一致，但仍存在旁路下游信號源自il13rα2的可能性。通過使用破壞來自特異性il13/il4受體復合體的信號傳遞的特異性封閉抗體，我們采用無偏見的基因表達概況分析法來鑒定潛在的il13rα2信號。一種抗體(抗-il-13mab1)阻斷il-13將il4rα招募至il13rα1的能力，但不影響il-13與il13rα2的結合；第二抗體(抗-il-13mab2)阻斷il-13與il13rα1和il13rα2結合的能力。雖然兩種抗體都阻止依賴il13rα1/il4rα的stat6激活而不影響通過il13rα1/il4rα受體復合體進行的il-4信號傳遞，但只有抗-il-13mab2還可以阻斷il-13與il13rα2的結合。為了在原代成纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中評價這些抗體中的每一種的活性，在存在或缺乏mab1或mab2封閉性抗-il-13抗體的情況下用il-13和/或il-4處理細胞。如下文所述，我們測量了stat6的il-13/il-4信號傳遞下游的標志ccl26和骨膜蛋白的轉錄物水平。我們首先表征了僅由il-13或il-4在原代肺成纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導的基因表達。用10ng/mlil-13或3ng/mlil-4刺激細胞48小時，然后提取rna，并進行基因組范圍的表達概況分析。相對于模擬處理的細胞，各細胞因子誘導的譜顯示近乎相同的基因表達變化(數(shù)據(jù)未顯示)。我們未在il-4和il-13刺激條件之間鑒定到統(tǒng)計上顯著的差異，明顯地表明兩種細胞因子都激活相同的il13rα1/il4rα受體復合體信號傳導途徑下游。我們隨后在有和無封閉性抗-il-13抗體mab1和/或mab2以及細胞因子處理的多種條件下測量了imr90原代肺成纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(用tnfα預刺激)中ccl26和骨膜蛋白(postn)的轉錄物水平。在圖14中，多種處理條件連同各條件的基因表達結果一起顯示在圖中。由于il13rα2在響應之前的信號時內源性上調表明它的作用是調節(jié)后續(xù)il-13信號傳遞，對于圖12中所示的實驗結果，我們在第二刺激之前通過用tnfα預處理細胞誘導了il13rα2表達。用il-4或足夠高水平的il-13刺激克服了il13rα2的負調節(jié)作用后，顯著誘導了ccl26和骨膜蛋白轉錄物(即ccl26～>100x；骨膜蛋白～>10x)。在用il-13和抗-il-13mab1或抗-il-13mab2、或mab的組合處理細胞時，ccl26和骨膜蛋白的誘導幾乎完全消失(圖12)。但是，抗-il-13mab1和抗-il-13mab2都不阻斷il-4介導的ccl26或骨膜蛋白誘導(圖12)，這與各mab選擇il-13而非il-4一致。通過測量ccl26和骨膜蛋白表達水平，未能檢測到阻斷il13rα1(用抗-il-13mab1)和阻斷il13rα1和il13rα2(用抗-il-13mab2)之間可辨別的差異。我們隨后試圖評估il13rα2對總體基因表達譜的貢獻。我們在設置這些實驗時的一個考慮是il13rα2信號傳遞有可能需要同時從il4rα/il13rα1受體復合體發(fā)出共信號(co-signal)。由于imr90細胞缺乏共同的γ鏈(il2rγ，數(shù)據(jù)未顯示)，il-4介導的信號傳遞僅通過il4rα/il13rα1受體復合體的激活發(fā)生。因此，用細胞因子il-4處理imr90細胞將以類似于用il-13處理的方式激活通過il4rα/il13rα1的信號傳遞，因此，il-4處理這些細胞是il-13通過il4rα/il13rα1進行信號傳遞的替代。圖13a顯示來自用il-13或il-13和il-4處理且在每種情況下使用mab1或mab2處理的細胞的微列陣數(shù)據(jù)的分析。如可以看到，此分析揭示，在用il-13以及mab1或mab2處理細胞之間及用il-13和il-4以及mab1或mab2處理細胞之間(在所有情況下都用tnfα預處理細胞)都沒有顯著差異表達的基因(調整的p-值<0.01)。在il-13刺激的細胞中，在缺乏il-4的情況下，mab1和mab2的抑制幾乎相同(圖13a)；而在il-4存在的情況下，mab1和mab2都未導致有意義的基因表達變化(圖13b)。總結起來，這些數(shù)據(jù)表明，配體-受體il13-il13rα2結合未誘導信號傳遞事件，其導致基因表達變化。ipf中及il13/il4刺激的原代肺成纖維細胞中提高的gli1表達ipf群組中最顯著表達的基因之一是gli1(圖14)，gli1是發(fā)育途徑中的重要轉錄因子。已顯示hedgehog(hh)和tgfβ信號傳遞誘導gli1表達。gli1和il13rα2表達水平在ipf樣品內顯著相關(rs＝0.69，q-值<0.01)。在細胞培養(yǎng)物微列陣實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，il13刺激上調gli1表達(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，我們假設，與il13rα2一樣，gli1也可以由il13信號傳遞直接或間接調節(jié)。為了驗證此觀察結果，我們用il13刺激原代肺成纖維細胞(培養(yǎng)在基質膠上)，并通過rt-qpcr測量gli1表達。il13刺激誘導了gli1表達(～4x)(數(shù)據(jù)未顯示)。hh或tgfβ信號傳遞的阻斷未抑制il13誘導的gli1表達由于hh途徑活性可以誘導gli1表達，我們假設il13刺激導致hh途徑的依賴hh的自分泌/旁分泌刺激。為了測試這種可能性，我們使用了小分子hh途徑抑制劑(本文中稱為m1)，其通過補綴結合(patchedbinding)來阻斷hh配體誘導平滑去抑制(smoothenedderepression)的能力(yauch等,nature455:406-410(2008)，其指cur-691或hhantag691)。m1預處理阻斷了shh介導的gli1誘導，但不影響il13依賴的gli1誘導(圖15)。已顯示tgfβ刺激細胞誘導gli1表達，il13可以在一些實驗系統(tǒng)中誘導tgfβ活性。為了評價il13依賴的gli1誘導是否通過依賴tgfβ的自分泌/旁分泌機制發(fā)生，用兩種tgfβ途徑抑制劑(抗體1d11[edwards等,j.ofboneandmineralres.25:2419-2426,2010]和tgfbiirb-fc[r&dsystems,目錄號1003-rt-050)預處理細胞。雖然兩種tgfβ途徑抑制劑都阻斷tgfβ介導的gli1(已知的tgfβ應答性基因)誘導(圖16a)，但都不影響il13依賴的gli1誘導(圖16b)。這些數(shù)據(jù)表明之前未描述過的il13和gli1誘導之間的關系，其不由之前表征過的hh和tgfβ信號傳導途徑介導。肺組織的基因表達分析揭示在與非ipf對照相比時ipf患者中明顯改變的轉錄組。與纖維化性質(fibroticdiathesis)一致，我們發(fā)現(xiàn)，涉及重塑胞外基質的許多基因在ipf中以提高的水平表達。此外，本研究和之前公開的來自相似大小研究的表達微列陣數(shù)據(jù)之間顯著的轉錄組范圍相似度支持我們的結論，在本研究中觀察到的基因表達模式廣泛指示在人ipf中存在合理的具有活性的過程，而不是由誤診或技術或分析假象引起的假信號。在臨床前模型中，il13已顯示為潛在的纖維化驅動者。在ipf活檢組織中，我們觀察到了il13途徑活性的轉錄證據(jù)，之前描述的具有提高的表達的il13靶基因包括骨膜蛋白、ccl13、ccl18和il13rα2；此外，il13本身在ipf中以提高的水平表達。ipf中最強烈和持續(xù)地上調的基因是il13rα2。之前的研究就il13rα2的作用獲得了不同的結論，即1)il13rα2可以轉導支持增加的纖維化的信號或2)il13rα2是il13的誘餌受體且無信號傳遞能力。鑒于這些形成鮮明對比的可能性，提供了以下挑戰(zhàn)：確定我們的活檢組織微列陣數(shù)據(jù)中的il13相關基因表達模式是否表明il13rα2的高表達反映ipf中il13活性的凈正作用或凈負作用及il13rα2可能的功能。為了在易處理的系統(tǒng)中闡明il13rα2的作用，我們發(fā)展了使用培養(yǎng)在生長因子減少的基質膠上的imr90細胞(人原代肺成纖維細胞系)的體外系統(tǒng)。在用il13刺激時，這些細胞顯示增加的il13rα2表達。我們觀察到tnfα也可在此系統(tǒng)中強烈誘導il13rα2。由于未知tnfα是否通過stat6傳遞信號，我們探究此特征是內源地而不是異位地調節(jié)il13rα2水平，并測定il13rα2表達對il13信號傳遞的影響。在用tnfα預刺激細胞時，如通過兩個il13靶基因(骨膜蛋白和ccl26)評估，它們顯示對il13刺激的降低的敏感性；相對于未用tnfα預刺激的細胞，用tnfα預刺激的細胞需要約10倍的il13濃度來達到相當?shù)墓悄さ鞍缀蚦cl26誘導。但是，tnfα預刺激未顯示影響il13rα1/il4rα復合體固有的信號傳遞能力，因為細胞無論是否進行tnfα預處理都保持對il4的相似的敏感性。這些觀察結果支持il13rα2作為il13-il13rα1/il4rα相互作用的誘餌受體發(fā)揮作用的模型；但是，這些數(shù)據(jù)未排除il13rα2可以產生其自己的獨特的胞內信號的可能性。為了更透徹地研究這種可能性，我們利用了允許選擇性阻斷il13與兩種受體復合體的相互作用的試劑。mab2是破壞il13與il13rα1和il13rα2結合的能力的封閉抗體。但是，mab1阻斷il13與il4rα結合并通過il4rα傳遞信號的能力，但不阻斷與il13rα2的結合。我們推斷，通過比較在這些封閉抗體的任一種的存在下用il13處理的細胞的表達譜，我們可以鑒定il13rα2特異性下游轉錄事件(如果存在)。我們未能在用任一種抗體阻斷細胞的條件之間鑒定出單個統(tǒng)計上顯著的差異，這顯著地表明，在此細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，il13單獨與il13rα2結合未產生影響基因表達的胞內信號級聯(lián)放大。由于在體內il13-il13rα2結合可能與il13rα1/il4rα同il13結合同時發(fā)生，我們試圖確定il13rα2信號是否依賴于il13rα1/il4rα復合體的同時結合。但是，尚未鑒定出選擇性阻斷il13-il13rα2相互作用而不影響il13-il13rα1/il4rα信號傳遞的試劑。由于il13和il4都與il13rα1/il4rα信號傳遞復合體結合并通過il13rα1/il4rα信號傳遞復合體傳遞信號，且產生相同的表達譜，我們推斷，我們可以如上述mab1對mab2阻斷實驗通過引入il4來模擬活性il13rα1/il4rα信號。在此背景中，我們仍未能鑒定出任何il13rα2依賴的信號傳遞事件?？偨Y起來，這些數(shù)據(jù)強烈支持il13rα2在肺成纖維細胞中是誘餌受體的模型。我們還已顯示，已知在肺發(fā)育、emt、腫瘤發(fā)生和組織修復中重要的gli1在ipf患者中相對于對照受試者上調。我們還觀察到，il13導致培養(yǎng)的成纖維細胞中的gli1表達增加。這些結果表明，gli1可以支持成纖維細胞的持續(xù)生長和存活，所述成纖維細胞可以阻斷創(chuàng)傷愈合消散的終末期，并支持持續(xù)纖維化。實施例3.ii期臨床研究研究原理ipf表征為不同程度的間質纖維化。ipf患者中的纖維化過程涉及幾種胞外基質蛋白，包括i、iii和iv型膠原、纖連蛋白及生腱蛋白-c與間充質細胞的異常增殖、肺結構的扭曲和上皮下成纖維細胞病灶的產生。il-13和il-4是組織纖維化的強誘導物。在非臨床模型中，il-13在小鼠肺中的轉基因過表達足以誘導膠原基因表達和嚴重的上皮下纖維化(lee等2001,jexpmed194:809-22；zhu等1999,jclininvest103:779-88)。相反，靶向破壞il-13的小鼠和用對il-13特異的封閉抗體處理的小鼠在博來霉素和異硫氰酸縈光素誘發(fā)的肺纖維化模型中顯示減少的胞外基質沉積(belperio等2002,amjrespircellmolbiol27:419-27；kolodsick等2004,jimmunol172:4068-76；liu等2004,jimmunol173:3425-31)。多項研究已得出ipf患者中il-13的表達和活性提高的結論。發(fā)現(xiàn)與正常對照相比，來自ipf患者的肺活檢組織樣品中il-13及il-13受體(il-13r)il-13rα1和il-13rα2的表達在信使rna和蛋白質水平都增加(jakubzick等2004,amjpathol164:1989-2001)。還發(fā)現(xiàn)與正常對照相比，來自ipf患者的支氣管肺泡灌洗液中的il-13提高。重要地，這些樣品中il-13的水平與肺功能的關鍵測量、預測用力肺活量(fvc)的百分比及肺對一氧化碳的擴散量(dlco)負相關(park等2009,jkoreanmedsci24:614-20)，表明il-13在ipf患者中的致病功能。除il-13本身外，還顯示已知將在il-13信號傳遞的下游表達的血清生物標志在ipf患者中提高。骨膜蛋白(在哮喘患者中存在的il-13可誘導蛋白，其血清水平與lebrikizumab的治療益處相關(corren等2011,nengljmed365(12):1088-98))在ipf患者的血清中也提高，且已在6個月的時期內顯示骨膜蛋白的水平與肺功能參數(shù)(fvc和dlco)負相關(okamoto等2011,eurrespirj37:1119-27)。根據(jù)在骨膜蛋白缺失的小鼠中觀察到的減少的博來霉素誘發(fā)的肺纖維化提出了骨膜蛋白是ipf中的致病因子(uchida等2012,amjrespircellmolbiol46:677-86)，表明il-13可以通過其他機制促成此疾病。il-13信號傳遞還在體外誘導從巨噬細胞強烈地產生趨化因子(c-c基序)配體18，分離自ipf患者而不是正常對照的肺泡巨噬細胞組成性表達ccl-18蛋白(prasse等2006,amjrespircritcaremed173:781-92)。與骨膜蛋白一樣，ccl-18在ipf患者的血清中增加，已報道ccl-18水平與疾病進展和預測相關，具有較高的基線ccl-18水平的患者經(jīng)歷較大的fvc下降和較高的死亡率(prasse等2007,arthritisrheum56:1685-93；prasse等2009,amjrespoircritcaremed179:717-23)?？偨Y起以，這些數(shù)據(jù)強烈表明，il-13表達在ipf患者中提高，從該細胞因子至多種纖維化相關細胞類型的信號在驅動發(fā)病中發(fā)揮關鍵作用?？?il13抗體(lebrikizumab)氨基酸序列下表顯示lebrikizumab的cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3區(qū)的氨基酸序列，以及vh、vl、重鏈序列和輕鏈序列。如下表11中所示，vh和重鏈可以包括n端谷氨酰胺，重鏈還可以包括c端賴氨酸。如本領域公知，n端谷氨酰胺殘基可以形成焦谷氨酸，c端賴氨酸殘基可以在制備過程中剪掉。表11.抗-il13抗體(lebrikizumab)氨基酸序列劑量、給藥方案和原理這是lebrikizumab在ipf患者中的隨機化、多中心、雙盲、安慰劑對照、平行組研究。將在全球范圍內約100個地點招募約250名患者(每個治療組125名患者)進入研究?？傊委煶掷m(xù)時間將基于所有受試者接受至少13個劑量(q4wk)的隱蔽治療和在最長2.5年的時期內觀察到至少75個主要端點事件。提供書面知情同意書的患者將開始篩查期(≤4周)以確定進入標準。篩查期結束時，按1:1的比例將合格的患者隨機化至皮下注射(sc)lebrikizumab250mg或安慰劑的雙盲治療，所述lebrikizumab250mg或安慰劑從預裝注射器施用。將集中進行區(qū)組隨機化，并按肺功能(fvc＜50％、50％至75％、＞75％預測)及按區(qū)域(北美、歐洲、其他)分層。將通過每4周sc注射來施用研究藥物，第一次注射發(fā)生在隨機化就診時(第1天)。將在手臂、大腿或腹部進行sc注射，所有患者將每次給藥就診時接受總計兩次注射?；颊邔⒃谧疃探o藥期(第0至48周)內接受最少13個劑量的隱蔽治療?；颊邔⒃谘娱L的治療期內繼續(xù)每4周接受隱蔽研究治療，直至發(fā)生了至少75個主要端點事件，且招募的最后一名患者已得到接受至少13個劑量的隱蔽治療的機會。一旦發(fā)生了這些事件，所有進行中的患者都將在其研究藥物最后一個劑量后約4周返回診所，以在治療結束(eot)的就診時及18周安全隨訪期內的兩次后續(xù)就診時完成隨訪評估。取決于招募和事件頻率，預期治療的總持續(xù)時間在1至約2.5年的范圍內。對于各患者，治療期將不延長超過2.5年，預期最長研究持續(xù)時間為2.8年。將鼓勵選擇提前停用研究藥物的患者留在研究中，并完成所有剩余的評估。如果這不可行，則患者應進入并完成安全隨訪期，除非知情同意書已撤回。劑量和給藥方案原理如下。lebrikizumab是抑制il-13信號傳遞的人源化igg4單克隆抗體。非臨床和臨床數(shù)據(jù)都表明，il-13信號傳遞在ipf的發(fā)病中發(fā)揮重要作用(見上文)。lebrikizumab的作用機制是阻斷il-13和它的受體之間的相互作用，從而阻斷il-13的胞內信號傳遞。由于細胞因子的快速代謝，假定最優(yōu)il-13阻斷需要在肺中維持lebrikizumab的持久濃度。假設肺中的il-13水平是在文獻中報道的范圍內(200-2000pg/ml；hart2001,immunologyandcellbiology79:149-53)，血清:肺分配比為1:500，預期10μg/ml的血清濃度將維持肺中足夠高的藥物水平以中和il-13。此目標濃度也與在ii期研究中觀察到的12周波谷濃度(平均值±sd：28.8±11.9μg/ml)的下端一致，其中l(wèi)ebrikizumab顯示降低患者中嚴重哮喘加重的速率的有效性，該患者盡管有吸入糖皮質激素治療也未使其哮喘得到控制。類似于哮喘患者，ipf患者具有與il-13相關的提高水平的生物標志，暗示在哮喘中產生臨床益處的lebrikizumab濃度也可以在ipf中產生生物學活性。對于ipf患者中的ii期研究，選擇每4周(q4wk)250mg的劑量以將穩(wěn)態(tài)血清波谷濃度維持在此目標濃度或此目標濃度以上。假設lebrikizumab在ipf患者中的藥物動力學類似于在哮喘患者中的藥物動力學，預期此劑量/方案將維持～30μg/ml的平均穩(wěn)態(tài)波谷濃度。比目標高三倍的濃度容許ipf患者中減少的肺分配(由更厚的間質引起)及存在自身抗體時lebrikizumab可能更快的清除(papiris等2012,curropinpulmmed18:433-40)。之前的lebrikizumab在哮喘中的臨床研究的安全性數(shù)據(jù)庫也支持250mg劑量q4wk的選擇。lebrikizumab和安慰劑將在預裝注射器中提供。每個注射器僅用于單劑量sc施用，且不含防腐劑?；钚匝芯克幬锏拿總€預裝注射器包含1mllebrikizumab濃度為125mg/ml的無菌液體。制劑還包含組氨酸乙酸鹽(20mm)、蔗糖(60mg/ml)、聚山梨醇20(約0.03％)和無菌注射用水usp，ph5.4-6.0。安慰劑的每個預裝注射器包含1ml無菌液體安慰劑制劑，其由含組氨酸乙酸鹽(20mm)、蔗糖(75mg/ml)和聚山梨醇20(約0.03％)的無菌注射用水組成，ph5.4-6.0。研究藥物和安慰劑的預裝注射器應在2℃-8℃冷藏，并防止過度的光和熱。注射器不應冷凍、搖動或在室溫保存。納入和排除標準此研究中將招募約250名年齡為35-80歲的ipf患者。納入標準包括以下：前5年內基于2011ats/ers準則篩選，在基線時診斷患有或可能患有ipf；篩查時fvc>40％預測且≤90％預測；篩查時dlco>25％預測且≤90％預測；對于接受口服糖皮質激素治療的患者：第1天之前穩(wěn)定劑量≤10mg強的松(或等同物)≥4周；能夠無輔助行走≥100米。排除標準包括以下：對生物制劑嚴重變態(tài)反應或過敏反應的歷史或已知對lebrikizumab注射的任意成分超敏反應；間質性肺疾病的其他已知原因的證據(jù)；預期6個月內肺移植；顯著的阻塞性肺疾病或其他ipf以外的臨床上顯著的肺疾病或其他臨床上顯著的醫(yī)學疾病(包括感染性疾病)的證據(jù)；紐約心臟協(xié)會(newyorkheartassociation)iv類慢性心力衰竭或左心室射血分數(shù)<35％的歷史證據(jù)；篩查前30天內由于ipf加重而住院；體重<40kg。有效性結果測量主要有效性結果測量是無進展存活(pfs)，其定義為從研究治療隨機化至首次出現(xiàn)任意以下事件的時間：死于任意原因；因任意原因非選擇性住院；fvc(l)從基線減少≥10％。次要有效性結果測量是：絕對fvc(l)的年變化速率；第52周時dlco(mlco/分鐘-1/mmhg-1)從基線減少≥15％；從隨機化至因任意原因死亡或非選擇性住院的時間；ipf中評估生活質量的工具(ataq-ipf)從基線至第52周的變化；從隨機化至fvc(l)首次相對于基線減少≥10％的時間；絕對dlco(mlco/分鐘-1/mmhg-1)的年變化速率；6分鐘步行距離(6mwd)從基線至第52周的變化。探究性結果測量是：fvc([l]和預測值的百分比)從基線至第52周的變化；fvc(l)從基線至第52周的百分比變化；絕對fvc(l)從基線至第52周變化200ml或10％的發(fā)生率；dlco([mlco/分鐘-1/mmhg-1]和預測值的百分比)從基線至第52周的變化；dlco(mlco/分鐘-1/mmhg-1)從基線至第52周的百分比變化；基線時接受補充供氧治療的患者的靜息氧流速從基線至第52周的變化；基線時未接受補充供氧的患者從隨機化至加入補充供氧治療的時間；從隨機化至因任意原因非選擇性住院的時間；從隨機化至首例急性ipf加重的時間；從隨機化至首例ipf惡化事件的時間；肺hrct上的放射照像結果(包括定量肺纖維化(qlf)得分)從基線至第24周和第52周的變化；6分鐘步行測試(6mwt)中的行走距離從基線的變化；血清生物標志(例如骨膜蛋白、ccl-18、ykl40、comp、opn、ccl-13)從基線的變化；euroqol5維問卷(eq-5d)從基線至第52周的變化。研究評估特發(fā)性肺纖維化加重將ipf加重定義為符合以下標準的事件：之前30天內未能解釋的惡化或出現(xiàn)呼吸困難；疊加在與常見的間質肺炎(uip)一致的網(wǎng)狀或蜂窩狀背景模式上的新的雙側毛玻璃樣異常和/或固結的放射學證據(jù)；缺乏備選的原因，如左心衰竭、肺栓塞、肺部感染(根據(jù)氣管內吸出物或支氣管肺泡灌洗(如果可得)，或研究人員的判斷)，或其他導致急性肺損傷的事件(例如膿毒、誤吸、創(chuàng)傷、再灌注肺水腫)。特發(fā)性肺纖維化疾病的惡化將“ipf疾病惡化”定義為符合以下的事件：(i)之前30天內未能解釋的惡化或出現(xiàn)呼吸困難；(ii)以下任意兩項：疊加在與uip一致的網(wǎng)狀或蜂窩狀背景模式上的新的雙側毛玻璃樣異常和/或固結的放射學證據(jù)；符合以下標準中的至少1項的肺功能惡化：-fvc(l)，至少10％；-dlco(mlco/分鐘-1/mmhg-1)，至少15％；-氧飽和(spo2)，至少4％；和(iii)缺乏備選的原因，上文在ipf加重下列出的那些原因。肺活量測定法肺活量測定法(包括用于支氣管擴張藥測試的方法)將按基于ats/ersconsensusstatement(miller等2005,eurrespirj26:319-38)的研究“肺功能手冊(pulmonaryfunctionmanual)”進行。該手冊將包括關于設備、方案、患者說明和警惕的信息。要收集的肺活量測定將包括fev1和fvc值及呼氣流量峰值，以及流量和體積-時間曲線。將用源自hankinson及其同事(hankinson等1999,amjrespircritcaremed159:179-87)所述的國家健康與營養(yǎng)檢查調查(nationalhealthandnutritionexaminationsurvey)數(shù)據(jù)集的方程來從這些體積測量得到的預測的fev1和fvc的百分比。在按研究需要配置的計算機化肺活量測定系統(tǒng)上按照ats/ers肺活量測定標準化(ats/ersstandardisationofspirometry)(miller等2005,eurrespirj26:319-38)所公開的指導進行肺活量測定。dlco將按照ats/ers指導(包括血清血紅蛋白濃度的校正)進行，并將連同fvc測量作為主要和次要端點評估的部分。數(shù)據(jù)(包括操作法的圖示)的可用性將由不知情的讀者確定。對于可用的操作法的重現(xiàn)性的計算將編程。高分辨率計算層析x射線照相術將進行俯臥(prone)肺hrct掃描并記錄。通過肺hrct掃描診斷ipf應證明雙基底、外周或胸膜下小葉內中隔增厚的對稱模式、纖維化變化、蜂窩樣和牽拉性支氣管擴張或細支氣管擴張?？梢园殡S肺的相關毛玻璃樣渾濁。六分鐘步行測試按照集中ats指導(atsstatement2002,amjrespircritcaremed166:111-117)進行6mwt測試?；颊邎蟾娼Y果此研究中將得到患者報告結果(pro)，以更充分地表征lebrikizumab的臨床概況。在研究期間，根據(jù)當?shù)卣Z言的需要翻譯的pro文件將由患者指定的時間點整體完成。將使用兩個pro工具：特發(fā)性肺纖維化中評估生活質量的工具(ataq-ipf)ataq-ipf是74項的ipf專用生活質量文件(swigris等2010,healthandqualityoflifeoutcomes8:77)。評估生活質量的工具(ataq)包含13個領域：咳嗽(6項)、呼吸困難(6項)、遠見(5項)、睡眠(6項)、死亡率(6項)、衰竭(5項)、情感健康(7項)、社會參與(5項)、財務(6項)、獨立(5項)、性健康(5項)、關系(6項)和治療(6項)。在從1(強烈不同意)至5(強烈同意)的量表上評估ataq的每一項。在ataq中規(guī)定無回憶期。ataq-ipf得分和已知在ipf中重要的生理學變量之間的相關模式連同使用補充供氧的受試者和不使用補充供氧的受試者之間ataq-ipf得分的顯著差異支持其有效性。euroqol5維eq-5d是基于一般偏好的健康相關生活質量問卷，其提供健康狀態(tài)的單個指數(shù)值(rabin和decharro2001,annmed33:337-43)。此工具包括關于移動性、自我護理、慣常活動、疼痛/不適和焦慮/抑郁的問題，用來建立患者健康狀態(tài)的組合材料。序列表<110>基因技術公司<120>預測、診斷和治療特發(fā)性肺纖維化的方法<130>p4841r1<140><141><150>61/707,411<151>2012-09-28<150>61/616,394<151>2012-03-27<160>14<170>patentin版本3.5<210>1<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成肽<400>1alatyrservalasn15<210>2<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成肽<400>2metiletrpglyaspglylysilevaltyrasnseralaleulysser151015<210>3<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成肽<400>3aspglytyrtyrprotyralametaspasn1510<210>4<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成肽<400>4argalaserlysservalaspsertyrglyasnserphemethis151015<210>5<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成肽<400>5leualaserasnleugluser15<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成肽<400>6glnglnasnasngluaspproargthr15<210>7<211>117<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成多肽<400>7valthrleuarggluserglyproalaleuvallysprothrglnthr151015leuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuseralatyrser202530valasntrpileargglnproproglylysalaleuglutrpleuala354045metiletrpglyaspglylysilevaltyrasnseralaleulysser505560argleuthrileserlysaspthrserlysasnglnvalvalleuthr65707580metthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyrcysalagly859095aspglytyrtyrprotyralametaspasntrpglyglnglyserleu100105110valthrvalserser115<210>8<211>118<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成多肽<400>8glnvalthrleuarggluserglyproalaleuvallysprothrgln151015thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuseralatyr202530servalasntrpileargglnproproglylysalaleuglutrpleu354045alametiletrpglyaspglylysilevaltyrasnseralaleulys505560serargleuthrileserlysaspthrserlysasnglnvalvalleu65707580thrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyrcysala859095glyaspglytyrtyrprotyralametaspasntrpglyglnglyser100105110leuvalthrvalserser115<210>9<211>112<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成多肽<400>9aspilevalmetthrglnserproaspserleuservalserleugly151015gluargalathrileasncysargalaserlysservalaspsertyr202530glyasnserphemethistrptyrglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuiletyrleualaserasnleugluserglyvalproasp505560argpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrileser65707580serleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglnglnasnasn859095gluaspproargthrpheglyglyglythrlysvalgluilelysarg100105110<210>10<211>443<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成多肽<400>10valthrleuarggluserglyproalaleuvallysprothrglnthr151015leuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuseralatyrser202530valasntrpileargglnproproglylysalaleuglutrpleuala354045metiletrpglyaspglylysilevaltyrasnseralaleulysser505560argleuthrileserlysaspthrserlysasnglnvalvalleuthr65707580metthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyrcysalagly859095aspglytyrtyrprotyralametaspasntrpglyglnglyserleu100105110valthrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleu115120125alaprocysserargserthrsergluserthralaalaleuglycys130135140leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser145150155160glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser165170175serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserser180185190leuglythrlysthrtyrthrcysasnvalasphislysproserasn195200205thrlysvalasplysargvalgluserlystyrglyproprocyspro210215220procysproalaproglupheleuglyglyproservalpheleuphe225230235240proprolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluval245250255thrcysvalvalvalaspvalserglngluaspprogluvalglnphe260265270asntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlyspro275280285argglugluglnpheasnserthrtyrargvalvalservalleuthr290295300valleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysval305310315320serasnlysglyleuproserserileglulysthrileserlysala325330335lysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproprosergln340345350gluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysgly355360365phetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnpro370375380gluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyser385390395400phepheleutyrserargleuthrvalasplysserargtrpglnglu405410415glyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhis420425430tyrthrglnlysserleuserleuserleugly435440<210>11<211>444<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成多肽<400>11glnvalthrleuarggluserglyproalaleuvallysprothrgln151015thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuseralatyr202530servalasntrpileargglnproproglylysalaleuglutrpleu354045alametiletrpglyaspglylysilevaltyrasnseralaleulys505560serargleuthrileserlysaspthrserlysasnglnvalvalleu65707580thrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyrcysala859095glyaspglytyrtyrprotyralametaspasntrpglyglnglyser100105110leuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro115120125leualaprocysserargserthrsergluserthralaalaleugly130135140cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn145150155160serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln165170175serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser180185190serleuglythrlysthrtyrthrcysasnvalasphislysproser195200205asnthrlysvalasplysargvalgluserlystyrglyproprocys210215220proprocysproalaproglupheleuglyglyproservalpheleu225230235240pheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrproglu245250255valthrcysvalvalvalaspvalserglngluaspprogluvalgln260265270pheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlys275280285proargglugluglnpheasnserthrtyrargvalvalservalleu290295300thrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslys305310315320valserasnlysglyleuproserserileglulysthrileserlys325330335alalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproser340345350glngluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallys355360365glyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglygln370375380progluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspgly385390395400serphepheleutyrserargleuthrvalasplysserargtrpgln405410415gluglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasn420425430histyrthrglnlysserleuserleuserleugly435440<210>12<211>444<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成多肽<400>12valthrleuarggluserglyproalaleuvallysprothrglnthr151015leuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuseralatyrser202530valasntrpileargglnproproglylysalaleuglutrpleuala354045metiletrpglyaspglylysilevaltyrasnseralaleulysser505560argleuthrileserlysaspthrserlysasnglnvalvalleuthr65707580metthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyrcysalagly859095aspglytyrtyrprotyralametaspasntrpglyglnglyserleu100105110valthrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleu115120125alaprocysserargserthrsergluserthralaalaleuglycys130135140leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser145150155160glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser165170175serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserser180185190leuglythrlysthrtyrthrcysasnvalasphislysproserasn195200205thrlysvalasplysargvalgluserlystyrglyproprocyspro210215220procysproalaproglupheleuglyglyproservalpheleuphe225230235240proprolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluval245250255thrcysvalvalvalaspvalserglngluaspprogluvalglnphe260265270asntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlyspro275280285argglugluglnpheasnserthrtyrargvalvalservalleuthr290295300valleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysval305310315320serasnlysglyleuproserserileglulysthrileserlysala325330335lysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproprosergln340345350gluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysgly355360365phetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnpro370375380gluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyser385390395400phepheleutyrserargleuthrvalasplysserargtrpglnglu405410415glyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhis420425430tyrthrglnlysserleuserleuserleuglylys435440<210>13<211>445<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成多肽<400>13glnvalthrleuarggluserglyproalaleuvallysprothrgln151015thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuseralatyr202530servalasntrpileargglnproproglylysalaleuglutrpleu354045alametiletrpglyaspglylysilevaltyrasnseralaleulys505560serargleuthrileserlysaspthrserlysasnglnvalvalleu65707580thrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyrcysala859095glyaspglytyrtyrprotyralametaspasntrpglyglnglyser100105110leuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro115120125leualaprocysserargserthrsergluserthralaalaleugly130135140cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn145150155160serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln165170175serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser180185190serleuglythrlysthrtyrthrcysasnvalasphislysproser195200205asnthrlysvalasplysargvalgluserlystyrglyproprocys210215220proprocysproalaproglupheleuglyglyproservalpheleu225230235240pheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrproglu245250255valthrcysvalvalvalaspvalserglngluaspprogluvalgln260265270pheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlys275280285proargglugluglnpheasnserthrtyrargvalvalservalleu290295300thrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslys305310315320valserasnlysglyleuproserserileglulysthrileserlys325330335alalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproser340345350glngluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallys355360365glyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglygln370375380progluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspgly385390395400serphepheleutyrserargleuthrvalasplysserargtrpgln405410415gluglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasn420425430histyrthrglnlysserleuserleuserleuglylys435440445<210>14<211>218<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成多肽<400>14aspilevalmetthrglnserproaspserleuservalserleugly151015gluargalathrileasncysargalaserlysservalaspsertyr202530glyasnserphemethistrptyrglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuiletyrleualaserasnleugluserglyvalproasp505560argpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrileser65707580serleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglnglnasnasn859095gluaspproargthrpheglyglyglythrlysvalgluilelysarg100105110thrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglugln115120125leulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyr130135140proargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnser145150155160glyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthr165170175tyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulys180185190hislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserpro195200205valthrlysserpheasnargglyglucys210215當前第1頁12