本發(fā)明涉及糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀的臨床檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測糖尿病酮酸中毒因子的探針及其合成和使用方法。

背景技術(shù)：

目前，一般醫(yī)學(xué)上都是通過檢測總酮體含量來診斷和治療酮癥酸中毒。對于酮體檢測的方法目前最常用的是傳統(tǒng)的硝普鹽法。這種方法的基本原理是在亞硝基鐵氰化鈉或者氨基鐵氰化鈉存在下，乙酰乙酸與之絡(luò)合生成紫紅色的化合物。硝普鹽法本身它是一種半定量的方法，準(zhǔn)確度很有限。另外氨基鐵氰化鈉只對酮體中的乙酰乙酸有較好的響應(yīng)，對于酮體的主要成分D-3羥基丁酸幾乎沒有反應(yīng)。病情越重的酮癥酸中毒患者，其酮體中D-3羥基丁酸的比例越高，乙酰乙酸越少，很容易造成漏診。同時，恢復(fù)期的患者往往因為D-3羥基丁酸大量轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸而造成誤診。

國家知識產(chǎn)權(quán)局于2010年12月1日公布的一篇專利申請?zhí)枮?01010104920.X，名稱：一種糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀診斷試紙，此專利提出如下技術(shù)方案：將濾紙在第一相浸液中浸泡后，取出迅速溫?zé)岣稍铮俜湃氲诙嘟褐薪?，取出再次干燥并切割成塊，即得測定試劑條。該發(fā)明的診斷試紙只能半定量檢測尿液或血液中的D-3羥基丁酸的含量，該診斷試紙在臨床應(yīng)用的過程中可能會造成了很多的漏診、誤診等現(xiàn)象。

目前用于臨床的測量方法主要有酮體粉和酮體試紙條等，這類方法雖然操作簡單且成本低廉，但是在臨床應(yīng)用的過程中造成了很多的漏診、誤診等現(xiàn)象。因此，探究有效的D-3羥基丁酸直接檢測方法非常必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種定量檢測、靈敏度高的檢測糖尿病酮酸中毒因子的探針及其合成和使用方法，本發(fā)明通過將2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉(PIPT)與二甲基亞砜(DMSO)混合配制成1mmol/L的溶液，并將溶液用蒸餾水稀釋，將稀釋后的溶液用來檢測血液或尿液中的D-3羥基丁酸的含量。

為了解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供了一種用于檢測糖尿病酮酸中毒因子的熒光探針，結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明提供了一種熒光探針的合成方法，具體步驟如下：

(1)每稱取0.001～0.003mol的鄰菲羅啉二酮加入到盛有10～15mL冰醋酸的容器中，并加熱攪拌至鄰菲羅啉二酮完全溶解；

(2)稱取0.05～0.08mol的乙酸銨加入到步驟(1)所得完全溶解有鄰菲羅啉二酮的容器中，并加熱攪拌均勻使其完全溶解；

(3)將0.001～0.003mol的2-吡啶甲醛加入到步驟(2)所得完全溶解有鄰菲羅啉二酮和乙酸銨的容器中，加熱攪拌并回流1h，即得加熱液，待加熱液冷卻至室溫時，向加熱液中加入40～50mL的水，并用濃氨水調(diào)節(jié)加熱液的pH范圍為6～7，抽濾即得棕色沉淀；

(4)將步驟(3)中所得的棕色沉淀用乙醇和乙醚各洗滌3～5次并抽濾烘干，將洗滌后的棕色沉淀用乙醇和水的混合液重結(jié)晶，即得2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉。

進(jìn)一步地，所述步驟(3)中加熱回流溫度為120℃。

進(jìn)一步地，所述步驟(3)中用濃氨水調(diào)節(jié)加熱液的pH為7。

本發(fā)明還提供了一種熒光探針應(yīng)用于檢測糖尿病酮酸中毒因子的方法，具體步驟如下：

(1)將2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉加入盛有二甲基亞砜的容器中配置成1～3mmol/L的溶液；將D-3-羥基丁酸配置成多份體積相同但濃度不同的溶液；

(2)量取多份1.95～2.05mL的蒸餾水分別加到多個熒光比色皿中，并向各個熒光比色皿中加入15～25μL步驟(1)中配置的溶液，再將多份D-3-羥基丁酸溶液分別加到各個熒光比色皿中，即得多份反應(yīng)液；

(3)用熒光分光光度計檢測步驟(2)中所配置的多份反應(yīng)液的熒光強度，并以D-3-羥基丁酸溶液的濃度為橫坐標(biāo)C、熒光強度F為縱坐標(biāo)繪圖，即得反應(yīng)液的熒光強度F關(guān)于D-3-羥基丁酸溶液濃度C的曲線，并求出該曲線的線性回歸方程；

(4)用熒光分光光度計測定樣品溶液的熒光強度，并將測得的熒光強度帶入步驟(3)中所求出的線性回歸方程中，即可求出樣品中D-3-羥基丁酸溶液的濃度。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中配置的溶液的濃度為1mmol/L。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中量取1.98mL的蒸餾水加入熒光比色皿中。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所達(dá)到的有益效果：

(1)本發(fā)明中2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉能溶于二甲基亞砜，并且二甲基亞砜能與水混溶，使得D-3-羥基丁酸分子能與2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉分子充分接觸，加快整個反應(yīng)的速度；本發(fā)明中將D-3-羥基丁酸溶液加入到PIPT-DMSO溶液中，探針分子對D-D-3-羥基丁酸識別度很高，因此，探針分子識別D-3-羥基丁酸的反應(yīng)十分迅速，在臨床應(yīng)用的過程中不會出現(xiàn)誤診、漏診的現(xiàn)象。

(2)本發(fā)明中繪制反應(yīng)液的熒光強度關(guān)于D-3-羥基丁酸溶液濃度的工作曲線，并求出曲線的線性回歸方程，只要測出樣品溶液中的熒光強度并帶入線性回歸方程即可知道樣品溶液中的D-3-羥基丁酸溶液濃度，并判斷出人們是否酮癥酸中毒。

(3)本發(fā)明中的棕色沉淀用乙醇和乙醚各洗滌3次并抽濾烘干，乙醇是介于水和有機溶劑之間的溶劑，用乙醇洗滌是為了除去脂類雜質(zhì)，用乙醚洗滌棕色沉淀一方面可以除去乙醇，另一方面乙醚易揮發(fā)，即可得到純凈的沉淀；本發(fā)明中的棕色沉淀用乙醇和水的混合液重結(jié)晶，進(jìn)一步對2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉進(jìn)行提純，本發(fā)明中制備的2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉產(chǎn)率高達(dá)42.4％。

(4)本發(fā)明中對盛有2-吡啶甲醛、鄰菲羅啉二酮和乙酸銨的容器進(jìn)行加熱攪拌并回流1h，加熱是整個反應(yīng)的反應(yīng)條件，并且可以加快整個反應(yīng)的反應(yīng)速度加快；回流是為了保證有機溶劑不會揮發(fā)。

綜上所述，本發(fā)明中檢測D-3羥基丁酸的方法具有靈敏度高、定量檢測且操作簡單等優(yōu)點。

附圖說明

以下結(jié)合附圖及具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1是本發(fā)明中探針分子的熒光強度隨D-3-羥基丁酸溶液濃度的變化曲線圖；

圖2是本發(fā)明中探針分子的熒光強度隨時間的變化曲線圖；

圖3是本發(fā)明中PIPT—D-3-HB的滴定曲線圖；

圖4是本發(fā)明中多種陽離子滴定PIPT的柱狀圖；

圖5是本發(fā)明中多種陰離子滴定PIPT的柱狀圖。

具體實施方式

以下實施例僅用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

一種用于檢測糖尿病酮酸中毒因子的熒光探針，結(jié)構(gòu)式如下：

一種熒光探針的合成方法，具體步驟如下：

(1)稱取0.002mol的鄰菲羅啉二酮加入到盛有10mL冰醋酸的容器中，并加熱攪拌至鄰菲羅啉二酮完全溶解；

(2)稱取0.05mol的乙酸銨加入到步驟(1)所得完全溶解有鄰菲羅啉二酮的容器中，并加熱攪拌均勻使其完全溶解；

(3)將0.002mol的2-吡啶甲醛加入到步驟(2)所得完全溶解有鄰菲羅啉二酮和乙酸銨的容器中，加熱攪拌并回流1h，且加熱回流的溫度為120℃，即得加熱液，待加熱液冷卻至室溫時，向加熱液中加入40mL的水，并用濃氨水調(diào)節(jié)加熱液的pH為7，抽濾即得棕色沉淀；

(4)將步驟(3)中所得的棕色沉淀用乙醇和乙醚各洗滌3次并抽濾烘干，將洗滌后的棕色沉淀用乙醇和水的混合液重結(jié)晶，即得2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉。

一種熒光探針應(yīng)用于檢測糖尿病酮酸中毒因子的方法，具體步驟如下：

(1)將2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉加入盛有二甲基亞砜的容器中配置成1mmol/L的溶液；將D-3-羥基丁酸配置成6份體積相同但濃度不同的溶液；

(2)量取多份1.98mL的蒸餾水分別加到多個熒光比色皿中，并向多個熒光比色皿中分別加入20μL步驟(1)中配置的溶液，再將多份D-3-羥基丁酸溶液分別加到多個熒光比色皿中，即得多份反應(yīng)液；

(3)用熒光分光光度計檢測步驟(2)中所配置的多份反應(yīng)液的熒光強度，并以D-3-羥基丁酸溶液的濃度C為橫坐標(biāo)、熒光強度F為縱坐標(biāo)繪圖，即得反應(yīng)液的熒光強度F關(guān)于D-3-羥基丁酸溶液濃度C的曲線，并求出該曲線的線性回歸方程F＝54.49+46.89C；

(4)用熒光分光光度計測定樣品溶液的熒光強度，并將測得的熒光強度帶入步驟(3)中所求出的線性回歸方程中，即可求出樣品中D-3-羥基丁酸溶液的濃度。

實施例2

一種用于檢測糖尿病酮酸中毒因子的熒光探針，結(jié)構(gòu)式如下：

一種熒光探針的合成方法，具體步驟如下：

(1)稱取0.001mol的鄰菲羅啉二酮加入到盛有10mL冰醋酸的容器中，并加熱攪拌至鄰菲羅啉二酮完全溶解；

(2)稱取0.05mol的乙酸銨加入到步驟(1)所得完全溶解有鄰菲羅啉二酮的容器中，并加熱攪拌均勻使其完全溶解；

(3)將0.001mol的2-吡啶甲醛加入到步驟(2)所得完全溶解有鄰菲羅啉二酮和乙酸銨的容器中，加熱攪拌并回流1h，并且加熱回流溫度為120℃，即得加熱液，待加熱液冷卻至室溫時，向加熱液中加入40mL的水，并用濃氨水調(diào)節(jié)加熱液的pH范圍為7，抽濾即得棕色沉淀；

(4)將步驟(3)中所得的棕色沉淀用乙醇和乙醚各洗滌3次并抽濾烘干，將洗滌后的棕色沉淀用乙醇和水的混合液重結(jié)晶，即得2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉。

一種熒光探針應(yīng)用于檢測糖尿病酮酸中毒因子的方法，具體步驟如下：

(1)將2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉加入盛有二甲基亞砜的容器中配置成2mmol/L的溶液；將D-3-羥基丁酸配置成7份體積相同但濃度不同的溶液；

(2)量取多份1.95mL的蒸餾水分別加到多個熒光比色皿中，并向多個熒光比色皿中分別加入15μL步驟(1)中配置的溶液，再將多份D-3-羥基丁酸溶液分別加到多個熒光比色皿中，即得多份反應(yīng)液；

(3)用熒光分光光度計檢測步驟(2)中所配置的多份反應(yīng)液的熒光強度，并以D-3-羥基丁酸溶液的濃度C為橫坐標(biāo)、熒光強度F為縱坐標(biāo)繪圖，即得反應(yīng)液的熒光強度F關(guān)于D-3-羥基丁酸溶液濃度C的曲線，并求出該曲線的線性回歸方程F＝54.49+48.89C；

(4)測定樣品溶液的熒光強度，并將測得的熒光強度帶入步驟(3)中所求出的線性回歸方程中，即可求出樣品中D-3-羥基丁酸溶液的濃度。

實施例3

一種用于檢測糖尿病酮酸中毒因子的熒光探針，結(jié)構(gòu)式如下：

一種熒光探針的合成方法，具體步驟如下：

(1)稱取0.003mol的鄰菲羅啉二酮加入到盛有15mL冰醋酸的容器中，并加熱攪拌至鄰菲羅啉二酮完全溶解；

(2)稱取0.08mol的乙酸銨加入到步驟(1)所得完全溶解有鄰菲羅啉二酮的容器中，并加熱攪拌均勻使其完全溶解；

(3)將0.003mol的2-吡啶甲醛加入到步驟(2)所得完全溶解有鄰菲羅啉二酮和乙酸銨的容器中，加熱攪拌并回流1h，并且加熱回流溫度為120℃。即得加熱液，待加熱液冷卻至室溫時，向加熱液中加入50mL的水，并用濃氨水調(diào)節(jié)加熱液的pH范圍為6，抽濾即得棕色沉淀；

(4)將步驟(3)中所得的棕色沉淀用乙醇和乙醚各洗滌3次并抽濾烘干，將洗滌后的棕色沉淀用乙醇和水的混合液重結(jié)晶，即得2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉。

一種熒光探針應(yīng)用于檢測糖尿病酮酸中毒因子的方法，具體步驟如下：

(1)將2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉加入盛有二甲基亞砜的容器中配置成3mmol/L的溶液；將D-3-羥基丁酸配置成8份體積相同但濃度不同的溶液；

(2)量取多份2.05mL的蒸餾水分別加到多個熒光比色皿中，并向多個熒光比色皿中分別加入25μL步驟(1)中配置的溶液，再將多份D-3-羥基丁酸溶液分別加到多個熒光比色皿中，即得多份反應(yīng)液；

(3)用熒光分光光度計檢測步驟(2)中所配置的多份反應(yīng)液的熒光強度，并以D-3-羥基丁酸溶液的濃度C為橫坐標(biāo)、熒光強度F為縱坐標(biāo)繪圖，即得反應(yīng)液的熒光強度F關(guān)于D-3-羥基丁酸溶液濃度C的曲線，并求出該曲線的線性回歸方程F＝54.49+47.89C；

(4)測定樣品溶液的熒光強度，并將測得的熒光強度帶入步驟(3)中所求出的線性回歸方程中，即可求出樣品中D-3-羥基丁酸溶液的濃度。

將實施例1中合成的熒光探針2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉和二甲基亞砜混合配置成1mmol/L的溶液；將D-3-羥基丁酸配置成10份體積相同、濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mmol/μL的溶液；量取10份1.98mL的蒸餾水分別加到10個熒光比色皿中，并向10個熒光比色皿中分別加入20μL的PIPT-DMSO溶液，再將10份D-3-羥基丁酸溶液分別加到10個熒光比色皿中，即得10份反應(yīng)液，用熒光分光光度計檢測10份反應(yīng)液的熒光強度為70.61、95.63、112.10、129.52、141.21、163.72、184.21、198.08、219.21，并以D-3-羥基丁酸溶液的濃度C為橫坐標(biāo)、熒光強度F為縱坐標(biāo)繪圖，即得反應(yīng)液的熒光強度F關(guān)于D-3-羥基丁酸溶液濃度C的曲線，并求出該曲線的線性回歸方程F＝54.49+48.89C，如圖1所示。

將實施例2中合成的化合物熒光探針2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉與二甲基亞砜混合配置成濃度為3mmol/L的溶液，將D-3-羥基丁酸溶液加入到PIPT-DMSO溶液中，用熒光分光光度計檢測熒光強度，熒光強度在30s后趨于不變，如圖2所示，本實施例中的探針分子對D-3-羥基丁酸分子的識別度很高，因此，在臨床的使用過程中不會出現(xiàn)漏診或誤診的現(xiàn)象。

將實施例3合成的化合物熒光探針2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉配成濃度為1.0×10^-4mol/L的溶液，將2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉溶液加入盛有1.98mL的水中，并攪拌均勻，然后向溶液中多次滴加濃度為1.0×10^-4mol/L的D-3-羥基丁酸溶液，每次滴加5μL。如圖3所示，隨著D-3-羥基丁酸的不斷加入，418nm處的熒光強度逐漸減弱，而494nm處的熒光強度逐漸增強。當(dāng)體系中D-3-羥基丁酸的濃度達(dá)到2.25×10^-6mol/L以后，體系的熒光強度不再增加。

將實施例1合成的化合物熒光探針2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉配成濃度為1.0×10^-4mol/L的溶液，將D-3-羥基丁酸、陽離子及陰離子均配成濃度為1.0×10^-5mol/L的溶液，將20μL濃度為1.0×10^-4mol/L的2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-鄰菲羅啉溶液加入盛有1.98mL的水中，然后一次性滴加D-3-羥基丁酸溶液或陰離子溶液或陽離子溶液。如圖4及圖5所示，探針分子對D-3-羥基丁酸的靈敏度很高，并且不論是陰離子還是陽離子都不會影響探針分子對D-3-羥基丁酸的檢測。

本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，以上的實施例僅是用來說明本發(fā)明，而并非用作為對本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實質(zhì)精神范圍內(nèi)，對以上所述實施例的變化、變型都將落在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。