本發(fā)明屬于微生物脫氮技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于微生物抗逆協(xié)助的同步異養(yǎng)硝化好氧反硝化的脫氮方法。

背景技術(shù)：

氨氮是當(dāng)前我國境內(nèi)水體的主要污染物之一。氨氮的不合理排放導(dǎo)致河流、湖泊、地下水及近海岸海域等自然水體氨氮污染日益嚴重。由于氨氮污染導(dǎo)致的生物及環(huán)境安全問題受到高度關(guān)注。污廢水及自然水體環(huán)境的氨氮降解凈化處理的理論和技術(shù)研究具有重大的經(jīng)濟價值和社會效益。

已被用于氨氮凈化處理的技術(shù)方法主要有吹脫法、膜吸收法、MAP沉淀法、離子交換法和折點加氯法等物理和化學(xué)方法。自十九世紀發(fā)現(xiàn)具有脫氮能力菌株以后，氨氮的微生物降解理論和技術(shù)研究進展迅速，全程硝化反硝化、厭氧氨氧化、同步異養(yǎng)硝化好氧反硝化脫氮工藝已被廣泛用于污廢水脫氮中，同時形成了較為系統(tǒng)的脫氮生化過程、脫氮相關(guān)酶及基因研究的理論體系。氨氮微生物降解技術(shù)在污廢水深度處理方面體現(xiàn)了顯著的優(yōu)勢。

近年來同步異養(yǎng)硝化好氧反硝化(Simultaneous Heterotrophic Nitrification and Aerobic Denitrification,SND)的微生物降解氨氮技術(shù)成為研究熱點。SND脫氮是在同一反應(yīng)器中和相同操作條件下異養(yǎng)硝化反應(yīng)和好氧反硝化反應(yīng)同步進行。SND脫氮技術(shù)具有脫氮效率高；脫氮體系pH穩(wěn)定；適合于含有機物的含氮廢水脫氮處理；工藝操作簡單、減少占地、降低成本等優(yōu)勢。SND脫氮技術(shù)和理論的研究是氨氮微生物降解的研究熱點之一。已報道的部分SND方式脫氮菌株有不動桿菌(Acinetobacter)、假單胞菌(Pseudomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)、副球菌(Paracoccus)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)等【蘇婉昀，高俊發(fā)，趙紅梅.異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的研究進展.工業(yè)水處理.2013.33(12):1-5】。

某些行業(yè)的氨氮廢水具有高鹽和高氨氮的特點，如船舶柴油發(fā)動機氧化鎂脫硫廢液。國際海事組織(IMO)根據(jù)《環(huán)境和發(fā)展里約宣言》第15條原則，于1997年制定《MARPOL73/78防污公約1997年議定書》，并在該議定書中以附件形式新增加MARPOL73/78防污公約附則Vl《防止船舶造成大氣污染規(guī)則》【周舫震，張曉東.實施MARPOL73/78公約附則VI的對策.航海技術(shù)，2006，6:43-44】。該規(guī)則要求船舶設(shè)備的硫氧化物排放總量控制在6.0g/kwh以內(nèi)。船舶氧化鎂脫硫工藝是一種使用氧化鎂作為脫硫劑，吸收二氧化硫生成含水亞硫酸鎂和少量硫酸鎂漿液的濕法脫硫技術(shù)。船舶柴油發(fā)動機氧化鎂濕法燃油脫硫廢液主要含有懸浮物、硝酸鹽、亞硝酸鹽、硫氧化物、有機物污染物、苯系物、直鏈烴和重金屬化合物等，有含鹽高、化學(xué)需氧量高及可生化性差等特點。IMO對船舶煙氣洗滌水的pH值、多環(huán)芳烴值、混濁度、硝酸鹽含量、添加劑等都有相關(guān)規(guī)定的排放標準。除船舶柴油發(fā)動機氧化鎂濕法燃油脫硫廢液外，皮革加工、海產(chǎn)品養(yǎng)殖、合成氨、化肥生產(chǎn)、垃圾填埋、鎳電池生產(chǎn)等行業(yè)廢水，都具有高鹽和高濃度氨氮的特點。

目前SND脫氮技術(shù)在這類廢水處理中的脫氮效率仍比較低下。其主要原因一是高鹽或高濃度氨氮導(dǎo)致的高滲透壓抑制了傳統(tǒng)的、非耐鹽的SND脫氮菌株(如乙酸鈣不動桿菌Acinetobacter calcoaceticus，居海假單胞菌Pseudomonas marincola)的生長和代謝活性；二是高濃度氨氮水體脫氮過程中會累積較高濃度的中間產(chǎn)物亞硝酸鹽，而一定濃度的亞硝酸鹽對細胞具有毒性，會抑制脫氮反應(yīng)，降低脫氮率；三是某些具有SND脫氮能力的耐鹽性的中度嗜鹽菌(如Halomonas campisalis ha3)雖然能夠耐受一定濃度的NaCl，但是其硝化過程反應(yīng)速率較低，因此SND脫氮速率較低【Guo,Y.,Zhou,X.M.,Li,Y.G.,Li,K.,Wang,C.X.,Liu,J.F.,Yan,D.J.,Liu,Y.L.,Yang,D.H.&Xing,J.M.Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by a novel Halomonas campisalis.Biotechnology Letters.2013.35,2045-2049】。另外Halomonas屬的菌可用于反硝化的有機碳源種類，對于實際應(yīng)用而言具有一定的限制性【Haba,R.R.,Arahal,D.R.,Sanchez-Porro,C.&Ventosa,A.2014The prokaryotes:Gammaproteobacteria:17The Family Halomonadaceae.Springer,Heidelberg,2014,338-339】。SND脫氮過程中的硝化反應(yīng)，對反應(yīng)條件尤為敏感。大量研究表明鹽分濃度為10g/L NaCl時開始對硝化反應(yīng)產(chǎn)生抑制，30g/L NaCl時硝化率開始顯著降低，60g/L NaCl是硝化反應(yīng)體系能夠耐受的極限濃度【徐寒莉，梁志偉，毛巍，王存豹，吳偉祥，鹽分對生物脫氮工藝中硝化反應(yīng)的影響與機理，應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2014，25(7)，2132-2140】。綜上，提高高鹽含氮廢水SND脫氮效率的技術(shù)方法，具有重大的經(jīng)濟價值和社會效益。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開一種高鹽含氮廢水抗逆協(xié)助脫氮方法，屬于微生物脫氮技術(shù)領(lǐng)域。其通過構(gòu)建一個四氫嘧啶分泌型鹽單胞菌和傳統(tǒng)脫氮菌株組合的抗逆協(xié)助的同步異養(yǎng)硝化好氧反硝化脫氮模式，據(jù)此提供一種高鹽含氮廢水脫氮技術(shù)。本發(fā)明解決了目前高鹽含氮廢水脫氮中，因高鹽對脫氮菌株生長和代謝的抑制而導(dǎo)致脫氮效率低下的問題。在高鹽含氮廢水處理和海水養(yǎng)殖水體凈化等方面有應(yīng)用前景。

本發(fā)明一方面在于：公開四氫嘧啶分泌型菌株在SND脫氮中的抗逆協(xié)助功能。其包括四氫嘧啶分泌型菌株與SND脫氮菌株。

對于上述技術(shù)方案中，優(yōu)選的四氫嘧啶分泌型菌株為四氫嘧啶合成量和分泌量高的菌株，例如，鹽單胞菌Halomonas venusta。所述的SND脫氮菌株選自乙酸鈣不動桿菌、居海假單胞菌、脫氮副球菌、糞產(chǎn)堿桿菌、蠟狀芽孢桿菌、螯臺球菌、嗜吡啶紅球菌。

當(dāng)四氫嘧啶分泌型菌株與SND脫氮菌株各優(yōu)選一個菌株時，其優(yōu)選的接種比例按重量計為1:0.5～2；更優(yōu)選的情況下，接種比例為1:1。

當(dāng)四氫嘧啶分泌型菌株優(yōu)選一個菌株，SND脫氮菌株優(yōu)選兩個或以上的菌株時，最優(yōu)選的接種比例為按重量計等比例接種。

更為具體的優(yōu)選組合為：鹽單胞菌：乙酸鈣不動桿菌：居海假單胞菌的接種比例為按重量計1:1:1。

對于上文所述的技術(shù)方案，進一步優(yōu)選的是在高效合成和分泌四氫嘧啶的同時，還能夠SND脫氮的組合菌群：鹽單胞菌Halomonas venusta DSM 4743、乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281。

另一方面在于提供SND脫氮抗逆協(xié)助的方法，其將四氫嘧啶分泌型菌株與傳統(tǒng)的SND脫氮菌株組合脫氮，并將其用于高鹽含氮廢水的SND脫氮。

所述的組合菌群在處理高鹽含氮廢水和凈化海水養(yǎng)殖水體技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。

對于上文所述的技術(shù)方案，具體的所述的應(yīng)用，在處理高鹽含氮廢水和凈化海水養(yǎng)殖水體時，可以采用同時接種或者錯時接種的方式；優(yōu)選的情況下，先接種四氫嘧啶分泌型菌株，再接種SND脫氮菌株的錯時接種方式，更利于菌體生長，并能有效提高脫氮率。具體的錯時接種的間隔時間為6～18h。

上文所述的高鹽含氮廢水是指含NaCl濃度≥30g/L、含氮元素濃度≤3000mg/L的廢水。

本發(fā)明的創(chuàng)新特征是：

①本發(fā)明提出將優(yōu)選的四氫嘧啶分泌型鹽單胞菌作為抗逆因子與SND脫氮菌組合，構(gòu)建一個抗逆協(xié)助的SND脫氮模式，據(jù)此提供一種高鹽含氮廢水脫氮技術(shù)。四氫嘧啶分泌型菌株的抗逆協(xié)助為本發(fā)明首次提出。

②抗逆協(xié)助因子四氫嘧啶由菌株Halomonas venusta DSM 4743在位提供，無需額外加入四氫嘧啶，操作簡便，成本低，效果顯著。

③本發(fā)明方法可廣泛用于高鹽含氮廢水的凈化處理領(lǐng)域，如船舶柴油發(fā)動機氧化鎂脫硫廢液、皮革加工、海產(chǎn)品養(yǎng)殖、合成氨、化肥生產(chǎn)、垃圾填埋、鎳電池生產(chǎn)等行業(yè)廢水。具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1.基于四氫嘧啶分泌型菌株抗逆協(xié)助的脫硫廢液SND脫氮；

圖2.組合菌株添加比例對組合菌SND脫氮效率的影響；

圖3.不同菌株組合的脫硫廢液SND脫氮。

具體實施方式

本發(fā)明實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均由商業(yè)途徑獲得，或者由常規(guī)方法制備，其中：

菌株：鹽單胞菌Halomonas venusta DSM 4743購自德國DSMZ公司(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)。

菌株：乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304(Acinetobacter calcoaceticus CCTCC AB 205304)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

菌株：居海假單胞菌MCCC 1A02281(Pseudomonas marincola MCCC 1A02281)購自中國海洋微生物菌種保藏管理中心。

培養(yǎng)基A(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 60，pH 7.2，121℃、20min滅菌。

培養(yǎng)基B(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 3，谷氨酸單鈉10，MgSO₄·7H₂O 0.05，K₂HPO₄ 9，KH₂PO₄3，MnSO₄·4H₂O 0.01，F(xiàn)eSO₄ 0.01，NaCl 30，pH 8.0，121℃、20min滅菌。

培養(yǎng)基C(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 4，谷氨酸單鈉8，檸檬酸三鈉30，K₂HPO₄ 9，KH₂PO₄ 3，MgSO₄·7H₂O 0.4，MnSO₄·H₂O 0.01，酵母粉0.5，NaCl 30，微量元素(Na₂EDTA 63.7，ZnSO₄2.2，CaCl₂ 5.5，MnCl₂·4H₂O 5.06，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 5；Na₂MoO₄·2H₂O 1.1，CuSO₄·5H₂O 1.57，CoCl₂·6H₂O 1.61)2mL，pH 8.0，121℃、20min滅菌。

四氫嘧啶標準品：購自Sigma-Aldrich公司，CAS:96702-03-3。

實施例1Halomonas venusta DSM 4743四氫嘧啶的合成及分泌實驗

菌株：Halomonas venusta DSM 4743

菌株活化：培養(yǎng)基A，30℃，120r/min，24h。

四氫嘧啶誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上述活化后的菌液按1％的接菌量接種至培養(yǎng)基B中(30mL/300mL)，30℃，120r/min，48h。

四氫嘧啶濃度測定：

胞內(nèi)四氫嘧啶：取1mL發(fā)酵液，離心(4℃、14000×g、離心15min)，沉淀中加入1mL80％乙醇(v/v)重新懸浮，室溫靜置過夜。懸浮液再離心，取上清液用于HPLC測定。

胞外四氫嘧啶：取1mL發(fā)酵液，離心(4℃、14000×g、離心15min)，取上清液，用去離子水稀釋10倍后用于HPLC測定。

四氫嘧啶總濃度是胞內(nèi)與胞外濃度之和。四氫嘧啶分泌率為胞外四氫嘧啶濃度占總濃度的百分比。

高效液相色譜法(HPLC)四氫嘧啶濃度：

采用TSK-GEL reversed phase column(TOSOH corporation,Japan)，50mmol/L，pH 6.0磷酸緩沖液為流動相，柱溫35℃，流速1mL/min，紫外檢測器，檢測波長210nm。四氫嘧啶的保留時間通過檢測四氫嘧啶標準品獲得

實驗結(jié)果：按上述方法進行了Halomonas venusta DSM 4743四氫嘧啶合成和分泌的實驗，結(jié)果顯示，胞內(nèi)四氫嘧啶濃度為179.5mg/L，胞外四氫嘧啶濃度775.3mg/L，四氫嘧啶總合成量為954.8mg/L，四氫嘧啶分泌率為81.2％。實驗結(jié)果表明菌株Halomonas venusta DSM 4743是四氫嘧啶分泌型菌株，而且能夠高效合成和分泌四氫嘧啶。

實施例2乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281吸收四氫嘧啶實驗

為了考查SND脫氮菌株乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281能否吸收四氫嘧啶，進行以下實驗。

菌株：乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304，居海假單胞菌MCCC 1A02281。

菌株活化：培養(yǎng)基A(調(diào)整NaCl濃度為5g/L)，30℃，120r/min，24h。

細胞培養(yǎng)：將上述活化菌株分別按1％的接菌量接種至培養(yǎng)基A(調(diào)整NaCl濃度為5g/L)，30℃，120r/min，培養(yǎng)48h。

四氫嘧啶吸收：細胞培養(yǎng)液14000×g、4℃、15min離心，棄上清液，菌體用NaCl-Kpi Buffer(100mM，pH 7.2，NaCl 5g/L)洗滌2次。而后將該菌體轉(zhuǎn)移至含30g/L NaCl和300mg/L四氫嘧啶的30mL NaCl-Kpi Buffer(100mM，pH 7.2)，30℃，60rpm，30min，使細胞在30g/L NaCl的脅迫下吸收四氫嘧啶。

細胞所吸收的四氫嘧啶量，按實施例1胞內(nèi)四氫嘧啶濃度測定方法測定。

實驗結(jié)果：按上述方法進行的四氫嘧啶吸收實驗結(jié)果顯示，乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281均能夠在NaCl脅迫下將四氫嘧啶從細胞外吸收至細胞內(nèi)。胞內(nèi)四氫嘧啶濃度乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304為26.3mg/g，居海假單胞菌MCCC 1A02281為29mg/g。而未經(jīng)過吸收實驗過程的對照樣品，細胞內(nèi)未檢測到四氫嘧啶。

實施例3四氫嘧啶分泌型菌株對SND脫氮菌株在不同鹽濃度下生長的抗逆協(xié)助實驗

將四氫嘧啶分泌型菌株(Halomonas venusta DSM 4743)與SND脫氮菌株(乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281)混合接種培養(yǎng)(分別含0、15、30、45、60、75、90g/L NaCl的培養(yǎng)基C)。在該組合培養(yǎng)體系中菌株Halomonas venusta DSM 4743在NaCl誘導(dǎo)下合成并分泌四氫嘧啶，而乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281吸收分泌至培養(yǎng)中的四氫嘧啶，獲得抗逆性，耐鹽生長。耐鹽生長的對照實驗為SND脫氮菌株或四氫嘧啶分泌型菌株單獨培養(yǎng)。

菌株：Halomonas venusta DSM 4743，乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304，居海假單胞菌MCCC 1A02281。

菌株活化：實驗菌株活化方法Halomonas venusta DSM 4743同實施例1，乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281同實施例2。

高鹽下培養(yǎng)：乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304、居海假單胞菌MCCC 1A02281和Halomonas venusta DSM 4743分別單獨培養(yǎng)，另Halomonas venusta DSM 4743分別與乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281混合培養(yǎng)。培養(yǎng)均使用培養(yǎng)基C，調(diào)整培養(yǎng)基C的NaCl濃度分別為0、15、30、45、60、75、90g/L。接種量1％，30℃，120r/min，培養(yǎng)48h。

細胞生長量測定：取培養(yǎng)液在4℃，14000×g離心15min，菌體用NaCl-Kpi Buffer(100mM，pH 7.2，NaCl濃度與培養(yǎng)基濃度相同)洗滌，離心后沉淀，105℃烘干至恒重，稱量。細胞生長量定義為每升發(fā)酵液細胞干重(g/L)。

實驗結(jié)果：四氫嘧啶分泌型菌株對SND脫氮菌株在高鹽下生長的抗逆協(xié)助實驗結(jié)果見表1。

表1四氫嘧啶分泌型菌株對SND脫氮菌株在高鹽下生長的抗逆協(xié)助

注：“-”為未檢測到。

實驗結(jié)果表明，單獨的乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304在NaCl濃度≥30g/L的培養(yǎng)基中基本不生長；單獨的居海假單胞菌MCCC 1A02281在NaCl濃度≥30g/L的培養(yǎng)基中生長量隨NaCl濃度的升高而顯著降低。乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304不具備耐鹽生長的能力，居海假單胞菌MCCC 1A02281的耐鹽生長能力低下。Halomonas venusta DSM 4743在不同NaCl濃度的培養(yǎng)基C中均有生長，最適生長NaCl濃度為60g/L。菌株Halomonas venusta DSM 4743分別與乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281混合培養(yǎng)，培養(yǎng)基中細胞生長量顯著提高?；旌吓囵B(yǎng)與單獨培養(yǎng)的生長量之差，為四氫嘧啶分泌型鹽單胞菌對脫氮菌株的抗逆協(xié)助生長量。組合生長模式中，在NaCl濃度為15-60g/L范圍內(nèi)，四氫嘧啶分泌型菌株Halomonas venusta DSM 4743對乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304的抗逆協(xié)助生長量為1.3-3.4g/L，對居海假單胞菌MCCC 1A02281抗逆協(xié)助生長量為0.8-1.9g/L。表1同時顯示了在兩個組合培養(yǎng)體系中的四氫嘧啶濃度，這個四氫嘧啶是菌株Halomonas venusta DSM 4743分泌至培養(yǎng)基中的。

實施例4四氫嘧啶分泌型菌株對SND脫氮菌株在不同鹽濃度下脫氮的抗逆協(xié)助實驗

將四氫嘧啶分泌型菌株(Halomonas venusta DSM 4743)與SND脫氮菌株(酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281)組合進行SND脫氮實驗。在該組合培養(yǎng)體系中菌株Halomonas venusta DSM 4743在NaCl誘導(dǎo)下合成并分泌四氫嘧啶，而酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281吸收分泌至培養(yǎng)中的四氫嘧啶，獲得抗逆性，耐鹽脫氮。耐鹽脫氮的對照實驗為SND脫氮菌株或四氫嘧啶分泌型菌株單獨脫氮。

菌株：Halomonas venusta DSM 4743，乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304，居海假單胞菌MCCC 1A02281。

菌株活化：實驗菌株活化方法同實施例3。

脫氮基質(zhì)為的培養(yǎng)基C，將(NH₄)₂SO₄濃度調(diào)整為10g/L，NaCl濃度分別調(diào)整為0、15、30、45、60、75、90g/L。

SND脫氮：乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304、居海假單胞菌MCCC 1A02281和Halomonas venusta DSM 4743分別單獨脫氮，另Halomonas venusta DSM 4743分別與乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281組合脫氮。接種量1％，30℃，120r/min，培養(yǎng)48h。

氨態(tài)氮(NH₄⁺-N)濃度測定：采用納氏試劑法測定。以游離態(tài)的氨或銨離子等形式存在的氨氮與納氏試劑反應(yīng)生成淡紅棕色絡(luò)合物。測定樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，加入納氏試劑，室溫下靜置10min后，使用1cm比色皿在420nm處測定吸光值。使用氯化銨標準溶液制作標準曲線【APHA:Standard methods for the examination of water and wastewater,20th ed.,American Public Health Association,Washington,D.C.(1999).】。

亞硝酸鹽態(tài)氮(NO₂^--N)濃度測定：采用重氮化偶合反應(yīng)法測定。在酸性條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酰胺進行重氮化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物與1-萘替乙二胺二鹽酸鹽作用，生成深紅色偶氮染料。測定樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，先加入氨基苯磺酰胺溶液，室溫下靜置5min，再加入1-萘替乙二胺二鹽酸鹽溶液，室溫下靜置15min后，使用1cm比色皿在543nm處測定吸光值。使用亞硝酸鈉標準溶液制作標準曲線【APHA:Standard methods for the examination of water and wastewater,20th ed.,American Public Health Association,Washington,D.C.(1999).】。

硝酸鹽態(tài)氮(NO₃^--N)濃度測定：采用鋅鎘還原法測定。使用鍍鎘的鋅片將硝酸鹽定量地還原為亞硝酸鹽，再采用上述重氮-偶氮法測定總亞硝酸鹽以及原有的亞硝酸鹽濃度，計算硝酸鹽濃度【Sun,H.F.,Wang,H.W.,and Yuan,C.Y.:Optimization of zinc-cadmium reduction method for determination of nitrate in seawater,Adv.Mater.Res.2013 864–867,1004–1007】。

細胞含氮測定：采用凱氏定氮方法測定細胞總氮【AOAC:Official Methods of Analysis,15th ed.,Association of Official Analytical Chemist,Arlington,V.A.1990】。取不同CDW細胞測定細胞總氮，擬合細胞生長量與細胞總氮的關(guān)系式。實驗中通過測定CDW計算細胞總氮。

N平衡計算：脫氮體系氮平衡方程為：TN₀(初始總無機氮)＝CN(細胞總氮)+TN_t(終了總無機氮)+GN(溢出的氣體氮)【Jin,R.F.,Liu,T.Q.,Liu,G.F.,Zhou,J.T.,Huang,J.Y.,and Wang,A.J.:Simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by the marine origin bacterium Pseudomonas sp.ADN-42,Appl.Biochem.Biotechnol.2015,175,2000–2011.】。其中總無機氮定義為NH₄⁺-N、NO^-₂-N、NO^-₃-N之和。

脫氮率：脫氮率＝(TN₀－CN－TN_t)/(TN₀－CN)×100％。其中TN₀為脫氮初始時的總無機氮，CN為細胞總氮，TN_t為脫氮結(jié)束時的總無機氮(該脫氮率計算中不包括細胞生長消耗氮素)。

實驗結(jié)果：四氫嘧啶分泌型菌株對SND脫氮菌株在不同鹽濃度下脫氮的抗逆協(xié)助實驗結(jié)果見表2。

表2不同鹽濃度下脫氮的抗逆協(xié)助(脫氮率，％)

注：“-”為未檢測到。

實驗結(jié)果表明，單獨的乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281在NaCl濃度≥15g/L的脫氮基質(zhì)中的脫氮率顯著降低。Halomonas venusta DSM 4743在不同NaCl濃度的脫氮基質(zhì)中呈現(xiàn)一定的脫氮能力。菌株Halomonas venusta DSM 4743分別與乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281組合脫氮，組合脫氮與單獨脫氮的脫氮率之差為脫氨菌株吸收四氫嘧啶后的耐鹽脫氮。在組合脫氮模式中，NaCl濃度為15-60g/L范圍內(nèi)，四氫嘧啶分泌型菌株Halomonas venusta DSM 4743對乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304的抗逆協(xié)助脫氮率為14.1-34.9％，對居海假單胞菌MCCC 1A02281抗逆協(xié)助脫氮率為7-25.5％。

實施例5組合脫氮中接種方式對脫氮菌株生長和脫氮的影響實驗

將四氫嘧啶分泌型菌株(Halomonas venusta DSM 4743)與SND脫氮菌株(乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281)混合培養(yǎng)進行SND脫氮實驗?？疾檫@兩株菌的不同接種方式對生長和脫氮的影響。以兩種方式接種：一是同時接種，即組合的兩個菌株在SND脫氮開始時同時分別接種至脫氮培養(yǎng)基C中(接種量均為1％)；二是錯時接種，即SND脫氮開始時只接種Halomonas venusta DSM 4743，培養(yǎng)6-18h后，再接種乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304(或居海假單胞菌MCCC 1A02281)。

菌株：Halomonas venusta DSM 4743，乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304，居海假單胞菌MCCC 1A02281。

菌株活化：同實施例3。

脫氮基質(zhì)為培養(yǎng)基為C，(NH₄)₂SO₄ 10g/L，NaCl濃度分別為30、60、90g/L。SND脫氮方法同實施例4。氨氮濃度測定方法同實施例4。結(jié)果如表3所示。

表3接種方式對菌株生長和SND脫氮率的影響

四氫嘧啶分泌型菌株對SND脫氮菌株在高鹽下生長和脫氮的抗逆協(xié)助效果，與接種方式有關(guān)，錯時接種好于同時接種。因為錯時接種，培養(yǎng)的前6-18h，Halomonas venusta DSM 4743合成并分泌四氫嘧啶，在培養(yǎng)基中含有四氫嘧啶的條件下，再接種乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304(或居海假單胞菌MCCC 1A02281)，這兩種菌會因為迅速吸收四氫嘧啶而快速生長，快速生長有利于提高脫氮率。錯時接種6-18h范圍內(nèi)，截止48h，細胞生長量提高了4.1-22.8％，脫氮率提高了8.5％-15.7％。優(yōu)選的錯時接種時間為12h，最大生長量為12.7g/L，最高脫氮率為92.5％(48h)。

實施例6基于四氫嘧啶分泌型菌株抗逆協(xié)助的脫硫廢液SND組合脫氮實驗

船舶柴油發(fā)動機氧化鎂濕法燃油脫硫廢液為高鹽含氮廢水(NH₄⁺-N 460mg/L，NO₂^--N 300mg/L，NO₃^--N 600mg/L，Cl^-34g/L)。

將四氫嘧啶分泌型菌株Halomonas venusta DSM 4743分別與乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281按菌體重量等比例混合，進行基于四氫嘧啶分泌型菌株抗逆協(xié)助的脫硫廢液脫氮實驗。

菌株：Halomonas venusta DSM 4743，乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304，居海假單胞菌MCCC 1A02281。

菌株活化和培養(yǎng)：菌株活化方法同實施例3。培養(yǎng)基C培養(yǎng)，30℃，120rpm，24h。培養(yǎng)Halomonas venusta DSM 4743時，調(diào)整NaCl濃度為30g/L。

脫硫廢液SND脫氮：三個菌株的活化和培養(yǎng)方法同實施例4。菌株培養(yǎng)24h后，離心收集細胞，按菌體重量等比例混合后轉(zhuǎn)接至脫硫廢液中，并向脫硫廢液中添加10g/L檸檬酸三鈉(反硝化能量來源)，6g/L K₂HPO₄，2g/L KH₂PO₄(提供細胞生長無機磷)。30℃，120rpm在供氧和有機碳源下進行SND脫氮。氨氮測定方法同實施例4。

實驗結(jié)果：四氫嘧啶分泌型菌株Halomonas venusta DSM 4743、SND分別與脫氮菌株乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281組合，用于船舶柴油發(fā)動機氧化鎂濕法燃油脫硫廢液SND凈化處理，結(jié)果見圖1。圖1可見，脫氮120h，乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281的脫氮率分別為14.1％和43.2％，單獨的Halomonas venusta DSM 4743的脫氮率為57.1％。而四氫嘧啶分泌型菌株Halomonas venusta DSM 4743分別與SND脫氮菌株乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304和居海假單胞菌MCCC 1A02281組合脫氮，脫氮率顯著提高，分別達到89.3％和92.3％。與單菌株脫氮相比，組合脫氮脫氮率分別提高75.2％和49.1％。脫氮效率分別由1.6和4.9提高到10.1和10.5mg/L.h。而且整個SND脫氮過程中，NO₂^--N濃度≤4.1mg/L，脫氮過程pH變化幅度較小(pH 6.5-8.5)。

實施例7菌株添加比例對組合菌SND脫氮率的影響實驗

船舶柴油發(fā)動機氧化鎂濕法燃油脫硫廢液為高鹽含氮廢水(NH₄⁺-N 460mg/L，NO₂^--N 300mg/L，NO₃^--N 600mg/L，Cl^-34g/L)。

將四氫嘧啶分泌型菌株Halomonas venusta DSM 4743與SND脫氮菌株居海假單胞菌MCCC 1A02281組合，進行基于四氫嘧啶分泌型菌株抗逆協(xié)助的脫硫廢液脫氮實驗。

菌株：Halomonas venusta DSM 4743，乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304，居海假單胞菌MCCC 1A02281。

脫硫廢液SND脫氮：菌株的活化和培養(yǎng)方法同實施例6。菌株培養(yǎng)24h后，離心收集細胞，兩個菌株按不同添加量轉(zhuǎn)接至脫硫廢液中(30mL/300mL)，并向脫硫廢液中添加10g/L檸檬酸三鈉(反硝化能量來源)，6g/L K₂HPO₄，2g/L KH₂PO₄(提供細胞生長無機磷)。30℃，120rpm在供氧和有機碳源下進行SND脫氮。氨氮濃度測定方法同實施例4。

組合菌株添加比例：菌株Halomonas venusta DSM 4743細胞量(g/L)：居海假單胞菌MCCC 1A02281細胞量(g/L)分別為1:0.5(4g/L和2g/L)；1:1(3g/L和3g/L)；1:2(2g/L和4g/L)。

實驗結(jié)果：三種不同添加比例(1:0.5,1:1,1:2)，60h SND脫氮，脫氮率分別為69.5％，83.7％和75.7％，其中添加比例為1:1時脫氮率最高。

上述菌株添加比例對組合菌SND脫氮率的影響實驗中，將居海假單胞菌MCCC 1A02281換成乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304，三種不同添加比例(1:0.5,1:1,1:2)，60h SND脫氮，脫氮率分別為63.9％，81.2％和72.3％，其中添加比例為1:1時脫氮率最高。

實施例8不同菌株組合方式對脫硫廢液SND脫氮影響實驗

考查單一脫氮菌株(一個菌株)、四氫嘧啶分泌型鹽單胞菌與一個脫氮菌株組合(兩個菌株組合)、四氫嘧啶分泌型鹽單胞菌與兩個脫氮菌株組合(三個菌株組合)的脫氮效果。

船舶柴油發(fā)動機氧化鎂濕法燃油脫硫廢液為高鹽含氮廢水(NH₄⁺-N 460mg/L，NO₂^--N 300mg/L，NO₃^--N 600mg/L，Cl^-34g/L)。

菌株：(1)菌株四氫嘧啶分泌型菌株Halomonas venusta DSM 4743，(2)乙酸鈣不動桿菌CCTCC AB 205304，(3)居海假單胞菌MCCC 1A02281。活化和培養(yǎng)方法同實施例6。

菌株組合：菌株(1)與(2)各取3g/L組合；菌株(1)與(3)各取3g/L組合；菌株(1)、(2)和(3)各取2g/L組合。

脫硫廢液SND脫氮：上述不同組合方式的細胞分別轉(zhuǎn)移至脫硫廢液中，并向脫硫廢液中添加10g/L檸檬酸三鈉(反硝化能量來源)，6g/L K₂HPO₄，2g/L KH₂PO₄(提供細胞生長無機磷)。30℃，120rpm在供氧和有機碳源下進行SND脫氮(60h)。氨氮測定方法同實施例4。

實驗結(jié)果：不同菌株組合的脫氮效果見圖3。由圖3可見，單一菌株、兩個菌株組合、三個菌株組合的脫氮率在12.4％-95.1％范圍內(nèi)。其中三個菌株組合的脫氮率最高(95.1％)，預(yù)示著四氫嘧啶分泌型鹽單胞菌與多個傳統(tǒng)脫氮菌株組合更有利于脫氮。