本發(fā)明涉及利用生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蝎神經(jīng)毒素AaIT及其編碼基因與應用。

背景技術(shù)：

昆蟲神經(jīng)毒素是一類只作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)，有毒殺作用的多肽類神經(jīng)毒素，主要來自于蝎，其次來自蜘蛛。這類對昆蟲有專一毒殺作用的毒素的作用位點是各種離子通道，具有高效昆蟲專一性的神經(jīng)毒素主要是作用于鈉離子通道的長鏈神經(jīng)毒素，這類長鏈神經(jīng)毒素一般由60-70個氨基酸組成，有2-4對鏈內(nèi)二硫鍵。不同種屬來源的神經(jīng)毒素在氨基酸的組成上沒有明顯的保守性，而同種來源神經(jīng)毒素在一級結(jié)構(gòu)上具有很高的保守性。AaIT是由Tal Arnon從蝎子Androctonus australis的毒液中分離到的一種對昆蟲具有高度選擇性的作用于鈉離子通道的α-型昆蟲神經(jīng)毒素，該成熟神經(jīng)毒素由64個氨基酸殘基組成，對農(nóng)業(yè)害蟲具有很強的毒殺作用，天然毒素對蝗蟲的半數(shù)癱瘓劑量(PD₅₀)為50ng/g體重，因此該毒素具有重要抗蟲價值。

現(xiàn)有技術(shù)中將昆蟲神經(jīng)毒素構(gòu)建表達載體，然后轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)進行表達，但得到的都是無活性的包涵體，通過在體外合適的條件下進行溶解、變性、復性和純化，從每升培養(yǎng)基僅能得到微量的可溶性蛋白質(zhì)，生產(chǎn)量低；也存在將構(gòu)建的表達載體在酵母中表達的方法，但其表達量低且分離純化困難。目前，還沒有通過改造AaIT的DNA序列且優(yōu)化AaIT表達純化方法來高效生產(chǎn)AaIT重組蛋白的方式，極大影響了AaIT在抗蟲中的應用，因此需開發(fā)出一種可以降低成本、實現(xiàn)大量生產(chǎn)且具有生物活性的昆蟲神經(jīng)毒素AaIT的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明目的在于提供一種蝎神經(jīng)毒素AaIT及其編碼基因。

本發(fā)明提供基因，為編碼蝎神經(jīng)毒素AaIT類蛋白的基因，為如下(1)-(3)中任一一種的DNA分子：

(1)由序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有毒殺昆蟲活性的蛋白的DNA分子；

(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼具有毒殺昆蟲活性的蛋白的DNA分子。

嚴格條件可為如下：50℃，在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中雜交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；還可為：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中雜交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；還可為：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中雜交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；還可為：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中雜交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；還可為：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中雜交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可為：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的序列1由210個脫氧核苷酸組成，本序列為成熟AaIT蛋白的全長cDNA的讀碼框，編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。

由上述序列表中的序列1編碼得到的蛋白屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明提供蛋白，是如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有毒殺昆蟲活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。

其中，序列表中的序列2由70個氨基酸殘基組成，其編碼基因的讀碼框包含210個核苷酸。

一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

含有上述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。

重組載體具體為將上述基因插入表達載體中，得到表達上述蛋白的重組載體。重組載體具體優(yōu)選為將上述基因插入表達載體pET32的BamH I和Hind III酶切位點間，得到表達上述蛋白的重組載體。

擴增基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。

上述引物對中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3(GCGGATCCAAGAAGAACGGTTACGCTG)，引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4(GCAAGCTTTTAGTTGATGATAGTGGTGTC)，利用序列3和序列4的引物擴增的目標基因同樣可以進行相關(guān)的酶切和連接操作。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備蛋白的方法，包括步驟：將基因的重組表達載體導入宿主細胞，宿主細胞優(yōu)選為大腸桿菌，用于構(gòu)建重組表達載體的原始載體優(yōu)選為pET32載體。

還包括純化蛋白的步驟：將表達得到的融合蛋白用腸激酶切割，然后在pH值為6.0～6.2的條件下透析，將透析后的物質(zhì)用CM陽離子柱吸附，然后用NaCl溶液漂洗并洗脫。

根據(jù)上述的制備蛋白的方法制備得到的純化后的蛋白也屬于本發(fā)明的保護范圍。

制備蛋白的優(yōu)選方法具體包括：

S1：優(yōu)化基因、構(gòu)建原核表達載體及轉(zhuǎn)化：人工合成經(jīng)優(yōu)化的成熟蝎昆蟲神經(jīng)毒素AaIT基因，并連接至表達載體pET32中，得到重組表達載體pET32/AaIT，將重組載體pET32/AaIT轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10菌株中，再從TOP10中提取重組載體pET32/AaIT；用熱激法將重組載體pET32/AaIT轉(zhuǎn)入到宿主細胞大腸桿菌表達菌株中，用含有Amp抗性的LB平板篩選得到包含有重組載體pET32/AaIT的大腸桿菌表達菌株轉(zhuǎn)化子；

S2：可溶性Trx-AaIT融合蛋白的表達與提取：將步驟S1所得的包含有重組載體pET32/AaIT的大腸桿菌表達菌株轉(zhuǎn)化子在37℃的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5～0.6時，加入濃度為0.1～0.5mM的IPTG，于16℃～25℃誘導6～10小時，然后超聲破碎，離心取上清液，得到重組的可溶性融合蛋白Trx-AaIT；

S3：Trx-AaIT融合蛋白的純化：利用鎳親合層析柱對Trx-AaIT融合蛋白進行純化，先用含50mM～100mM咪唑的pH 8.0Tris-HCl溶液漂洗親合層析柱，然后用含100mM～200mM咪唑的pH 8.0Tris-HCl溶液將融合蛋白洗脫下來，即可得純度在90％以上的Trx-AaIT融合蛋白；

S4：Trx標簽的切割及重組AaIT蛋白的純化：將Trx-AaIT融合蛋白用腸激酶切割，然后在pH值為6.0～6.2的條件下透析，經(jīng)CM陽離子柱吸附后用20mM NaCl溶液漂洗雜蛋白，再用100mM NaCl溶液洗脫，便可得到純度在95％以上的AaIT重組蛋白。

上述蛋白、上述基因或上述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在抗蟲領(lǐng)域中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將上述蛋白的編碼基因?qū)氲侥康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲性高于目的植物。

上述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。將基因?qū)肽康闹参?，會使蛋白質(zhì)目的植物中合成，進而是目的植物的抗蟲性能得到改良。

本發(fā)明還提供一種培育轉(zhuǎn)基因病毒的方法，是將上述蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入到目的病毒中，得到轉(zhuǎn)基因病毒，轉(zhuǎn)基因病毒的抗蟲性高于目的病毒，目的病毒優(yōu)選為桿狀病毒、核型多角體病素和質(zhì)型多角體病毒中的一種。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有以下優(yōu)點：一是利用pET32載體和大腸桿菌表達菌株，實現(xiàn)了表達產(chǎn)物與增溶因子Trx融合，得到大量可溶形式的Trx-AaIT融合蛋白；二是在本發(fā)明的表達系統(tǒng)內(nèi)，Trx-AaIT融合蛋白可按適當?shù)姆绞秸郫B，并保持天然構(gòu)象；三是摸索出一條有效純化活性重組Trx-AaIT、快速切割Trx并進一步純化得到無任何標簽的AaIT重組蛋白得方法；四是通過大腸桿菌表達得到的AaIT蛋白的生物活性得到了顯著的提高。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中的pET32/AaIT載體構(gòu)建示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例中含有優(yōu)化前AaIT的pET28、pET30和pET32重組載體表達的目標蛋白的SDS－PAGE檢測結(jié)果圖。

圖3為本發(fā)明實施例中的含有優(yōu)化后AaIT的pET28、pET30和pET32重組載體表達的目標蛋白的SDS－PAGE檢測結(jié)果圖。

圖4為本發(fā)明實施例中的包含優(yōu)化后基因的pET32/AaIT載體的大腸桿菌表達得到的可溶性Trx-AaIT融合蛋白的SDS－PAGE檢測結(jié)果圖。

圖5為本發(fā)明實施例中的純化前Trx-AaIT融合蛋白和用包括不同濃度的咪唑的緩沖液C純化得到的Trx-AaIT融合蛋白的SDS－PAGE檢測結(jié)果圖。

圖6為本發(fā)明實施例中的Trx-AaIT融合蛋白在不同酶切時間酶切得到的蛋白的SDS－PAGE檢測結(jié)果圖。

圖7為本發(fā)明實施例中的rAaIT重組蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖。

圖8為本發(fā)明實施例中的注射rAaIT重組蛋白組和PBS對照組的各2只家蠶在注射10分鐘后表現(xiàn)的癥狀特征圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復實驗，數(shù)據(jù)為三次重復實驗的平均值或平均值±標準差。

本發(fā)明選用大腸桿菌表達菌、載體擴增菌株TOP10和表達載體pET32均購自美國Invritrogen公司。

本發(fā)明中的引物具體序列如序列表中的序列3和序列4所示。

所用培養(yǎng)基配方如下：

1)LB液體培養(yǎng)基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸餾水1L，高壓滅菌，室溫保存；

2)LB/Amp平板：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸餾水1L，瓊脂粉15g，高壓滅菌后，冷卻至70℃以下，加入1mL濃度為100mg/ml的氨芐青霉素(Ampicillin)，充分混均后倒板，4℃避光保存；

3)LB/Amp培養(yǎng)基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸餾水1L，高壓滅菌后，冷卻至70℃以下，加入1mL Ampicillin(100mg/ml)，充分混均，4℃保存；LB液體培養(yǎng)基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸餾水1L，高壓滅菌，室溫保存。

4)50×TAE瓊脂糖凝膠電泳緩沖液：Tris堿121g，冰乙酸28.6mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)50mL，加蒸餾水定容至500mL，室溫保存；

5)50mg/mL氨芐青霉素保存液：氨芐青霉素0.5g，加蒸餾水溶解并定容至10mL，分裝后于-20℃保存；

6)5×SDS-PAGE上樣緩沖液：1M Tris-HCl(pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，BPB 25mg，甘油2.5mL，加去離子水溶解后定容至5mL，分裝(約500μL每份)后于室溫保存，使用每份加入25μLβ-巰基乙醇混勻；

7)5×SDS-PAGE電泳緩沖液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5.0g，加入約800mL去離子水，充分攪拌溶解后定容至1L，室溫保存；

8)考馬斯亮藍R-250染色液：考馬斯亮藍R-250 0.25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去離子水并攪拌均勻，濾紙去除顆粒物質(zhì)后，室溫保存；

9)考馬斯亮藍脫色液：冰乙酸50mL，甲醇150mL，去離子水300mL，充分混合后，室溫保存。

實施例一

本實施例提供了一種優(yōu)化的人工合成的AaIT基因，具體序列如序列表中的序列1所示，該基因所對應的蛋白質(zhì)序列如序列表中的序列2所示。本實施例的優(yōu)化前的序列是根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的DNA序列，是合成AaIT神經(jīng)毒素的天然DNA，根據(jù)大腸桿菌表達的特點，優(yōu)化并合成優(yōu)化后的DNA。優(yōu)化后的DNA序列與AaIT的天然多核苷酸(GenBank登錄號M27706)相比幾乎沒有同源性。

將上述優(yōu)化前后的基因連接到大腸桿菌表達載體pET28、pET30及pET32中并獲得重組載體，以上經(jīng)測序驗證的重組載體分別熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌株的感受態(tài)細胞，涂布對應的抗性LB平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時，篩選轉(zhuǎn)化子，其中pET32/AaIT載體構(gòu)建如圖1所示，圖1為本發(fā)明實施例中的pET32/AaIT載體構(gòu)建示意圖。

利用含未經(jīng)優(yōu)化的天然AaIT基因序列的pET28、pET30及pET32重組載體為表達載體，其對應的表達菌轉(zhuǎn)化子經(jīng)0.5mM的IPTG在16℃、25℃及37℃下誘導均未檢測到目標蛋白的表達，其菌體總蛋白SDS－PAGE結(jié)果如圖2所示，圖2為本發(fā)明實施例中含有優(yōu)化前AaIT的pET28、pET30和pET32重組載體表達的目標蛋白的SDS－PAGE檢測結(jié)果圖。利用含優(yōu)化后的AaIT基因序列的pET28、pET30及pET32重組載體為表達載體，其對應的表達菌轉(zhuǎn)化子經(jīng)0.5mM的IPTG在16℃、25℃及37℃下誘導，其中以pET28和pET30為重組表達載體的轉(zhuǎn)化子未檢測到目標蛋白的表達，以pET32為表達載體檢測到目標蛋白的表達，其菌體總蛋白SDS－PAGE結(jié)果如圖3所示，圖3為本發(fā)明實施例中的含有優(yōu)化后AaIT的pET28、pET30和pET32重組載體表達的目標蛋白的SDS－PAGE檢測結(jié)果圖，AaIT蛋白分子量為8kDa，pET32載體在目標蛋白的N－端融合了一個大小為17kDa左右的Trx片段，Trx-AaIT大小為25kDa左右，表達的目標蛋白如箭頭所示。

實施例二

本實施例提供一種制備蛋白的方法，具體包括如下步驟：

S1：優(yōu)化基因、構(gòu)建原核表達載體及轉(zhuǎn)化：人工合成經(jīng)優(yōu)化的成熟蝎昆蟲神經(jīng)毒素AaIT基因，并連接至表達載體pET32中，得到重組表達載體pET32/AaIT，載體構(gòu)建如圖1所示。主要的載體構(gòu)建步驟如下：

(1)用BamH I和Hind III雙酶切重組載體PCP/pUC，獲得目的片斷PCP，反應體系如下(所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司)：

(2)用BamH I和Hind III雙酶切pET32，獲得載體片斷，反應體系如下(所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司)：

(3)將步驟(1)和(2)得到的目的片斷和載體片斷用DNA凝膠收回試劑盒回收，該試劑盒購自大連TAKARA公司，具體操作按試劑盒說明書進行。

(4)將步驟(3)回收得到的目的片斷和載體用T4DNA連接酶(購自大連TAKARA公司)進行連接反應，目的基因準確插入到表達載體讀碼框內(nèi)，反應體系如下：

將重組載體pET32/AaIT轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10菌株中，再從TOP10中提取重組載體pET32/AaIT；用熱激法將重組載體pET32/AaIT轉(zhuǎn)入到宿主細胞大腸桿菌表達菌株中，用含有Amp抗性的LB平板篩選得到包含有重組載體pET32/AaIT的大腸桿菌表達菌株轉(zhuǎn)化子。

S2：可溶性Trx-AaIT融合蛋白的表達與提?。簩瑑?yōu)化后基因的pET32/AaIT載體的大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子在37℃的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6，然后分別加入濃度為0、0.1mM、0.5mM和1.0mM的IPTG，分別在16℃、25℃和37℃誘導6小時，誘導后收集的菌體超聲破碎，破碎功率300W，破碎5s，間隙9s，循環(huán)90次后，離心取上清液，得到重組的可溶性融合蛋白Trx-AaIT。

S3：Trx-AaIT融合蛋白的純化：經(jīng)擴大培養(yǎng)和在16℃下用0.1mM IPTG誘導8小時，收集經(jīng)IPTG誘導表達后后的表達菌的菌體，將菌體重懸于50ml的緩沖液A(含50mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑和1mM蛋白酶抑制劑PMSF，pH 8.0)中，然后用超聲破碎儀進行破碎，破碎功率300W，破碎5s，間隙9s，循環(huán)90次；將破碎后的菌液在4℃下，30000g離心15min；將離心所得到的上清液加入到經(jīng)緩沖液A預平衡的鎳親合層析柱中；用100ml緩沖液B(含50mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑和0.5-1.0％Triton X-114，pH 8.0，先于冰浴上預冷至0℃-4℃)漂洗蛋白純化柱子后，分別加入包括濃度為50mM、100mM、200mM、300mM和400mM咪唑的緩沖液C(含50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH 8.0)，將蛋白洗脫下來，即可得純度在90％以上的Trx-AaIT融合蛋白。

S4：Trx標簽的切割及重組AaIT蛋白的純化：取1mg Trx-AaIT融合蛋白，加入1U的重組小牛腸激酶，于25℃下進行酶切，每2小時取樣，至酶切12小時。酶切完成后，將蛋白質(zhì)樣品在pH6.0的30mM Tris-HCl下透析，經(jīng)CM陽離子柱吸附后用20mM NaCl漂洗雜蛋白，100mM的NaCl洗脫便可得到純度在95％以上的rAaIT蛋白。

需要說明的是，在步驟S2得到的上清液中加入SDS-PAGE樣品緩沖液，對其可溶蛋白進行分析。在16℃、25℃和37℃溫度下IPTG的濃度為0.1mM、0.5mM和1.0mM時，都可以得到可溶性Trx-AaIT融合蛋白，具體結(jié)果如圖4所示，圖4為本發(fā)明實施例中的包含優(yōu)化后基因的pET32/AaIT載體的大腸桿菌表達得到的可溶性Trx-AaIT融合蛋白的SDS－PAGE檢測結(jié)果圖。其中，在16℃時，在供試濃度范圍內(nèi)，可溶性Trx-AaIT均可高水平表達；在25℃時，在IPTG的濃度為0.1mM-0.5mM時都有高水平的可溶性Trx-AaIT表達。為節(jié)約成本，縮短生產(chǎn)周期，我們優(yōu)選采用誘導溫度16℃-25℃，0.1mM～0.5mM的IPTG進行誘導表達。

對于步驟S3，結(jié)果顯示利用包括100mM～200mM的咪唑緩沖液C洗脫可以得到純度達90％的重組蛋白，融合蛋白的分子量約為25kDa，表達產(chǎn)物可溶性Trx-AaIT的純化過程的優(yōu)化如圖5所示，圖5為本發(fā)明實施例中的純化前Trx-AaIT融合蛋白和用包括不同濃度的咪唑的緩沖液C純化得到的Trx-AaIT融合蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖。

對于步驟S4，用SDS-PAGE分析酶切效果，結(jié)果如圖6所示，圖6為本發(fā)明實施例中的Trx-AaIT融合蛋白在不同酶切時間酶切得到的蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖，目標蛋白如箭頭所示。經(jīng)2小時酶切即可獲得大量經(jīng)切割的rAaIT蛋白，考慮到生產(chǎn)成本，在實際生產(chǎn)中優(yōu)先選擇用腸激酶切割6小時到10小時。rAaIT重組蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖7所示，目標蛋白如箭頭所示。

對比例

人工合成并優(yōu)化蝎神經(jīng)毒素AaIT天然DNA，在該基因的5′-端添加金龜子綠僵菌基因MCL1，并克隆入pBarPc的Sma I酶切位點得到質(zhì)粒pMcl 1prAaIT，經(jīng)SwaI酶切、線性化后使用真菌原生質(zhì)體的方法進行金龜子綠僵菌菌株ARSEF 549轉(zhuǎn)化，篩選獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子AaIT-549，轉(zhuǎn)化子AaIT-549在昆蟲血液離體培養(yǎng)表達，并純化得到AaIT蛋白。

通過本實施例提供的技術(shù)方案制備的目的蛋白AaIT的表達量顯著提高，對于步驟S3經(jīng)20mM Tris-HCl透析后的Trx-AaIT融合蛋白，1L誘導表達的菌液可純化得到50mg的Trx-AaIT融合蛋白，純度超過90％；對于步驟S4經(jīng)過Trx標簽的切割及重組AaIT蛋白的純化，每升大腸桿菌培養(yǎng)液可純化得到5mg的純度在95％以上的rAaIT重組蛋白。而對比例中，從1L的培養(yǎng)液中僅可以得到純度在50％的蛋白2.4mg，并且對比例需要利用昆蟲血液離體培養(yǎng)，生產(chǎn)成本高。

將對比例純化得到AaIT蛋白(A組)、上述步驟S3得到的純化后Trx-AaIT融合蛋白(B組)和上述步驟S4得到的純化后的重組蛋白rAaIT(C組)進行生物學活性分析，具體分析方法和結(jié)果如下。

實驗方法：利用PBS將對比例純化得到AaIT蛋白(A組)、純化的Trx-AaIT融合蛋白(B組)和純化的rAaIT蛋白(C組)分別稀釋至2mg/ml，按10μg/g體重注射5齡家蠶各20只，同時以注射相同體積PBS(D組)的家蠶作為對照，觀察家蠶的中毒死亡癥狀。

實驗結(jié)果：結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射對比例純化得到AaIT蛋白的家蠶(A組)表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀，并在24小時內(nèi)70％死亡，注射純化的Trx-AaIT融合蛋白的家蠶未表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)中毒的癥狀，而注射相同體積PBS的對照組家蠶也無一出現(xiàn)中毒癥狀；注射rAaIT(C組)的家蠶表現(xiàn)出強烈的神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀，并在24小時內(nèi)100％死亡。其中注射rAaIT和PBS對照的各2只家蠶在注射10分鐘所表現(xiàn)的癥狀特征如圖8所示，圖8為本發(fā)明實施例中的注射rAaIT重組蛋白組和PBS對照組的各2只家蠶在注射10分鐘后表現(xiàn)的癥狀特征圖。生物學活性檢測結(jié)果表明，本發(fā)明技術(shù)方案制備得到的rAaIT蛋白具有很強的生物活性。具體結(jié)果如下表1所示：

表1 A、B、C和D組生物學活性分析結(jié)果(n＝3)

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型，而并不使相應技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求和說明書的范圍當中。