本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種用于植物基因組定點(diǎn)堿基替換的載體以及植物基因組定點(diǎn)堿基替換的方法。

背景技術(shù)：

鋅指核酸技術(shù)(Zinc finger nuclease，ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(transcription activator-like(TAL)effector nucleases，Talen)和CRISPR/Cas9技術(shù)是這幾年基因組編輯領(lǐng)域的幾項(xiàng)突破性技術(shù)^1-3。這三種技術(shù)都可以在生物體基因組指定位點(diǎn)特異性的切割DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂，從而利用生物的非同源末端連接或同源重組，進(jìn)行定點(diǎn)編輯。ZFN和Talen技術(shù)用特異性的蛋白引導(dǎo)，蛋白元件的構(gòu)建相對較復(fù)雜，編輯效率有待提高。CRISPR/Cas9技術(shù)以RNA引導(dǎo)，體外構(gòu)建簡單，編輯效率較高。目前，這三種技術(shù)已成功的應(yīng)用于多種生物，包括大腸桿菌、酵母、水稻、擬南芥、大豆、玉米、小鼠和人類細(xì)胞等⁴。

基因組編輯技術(shù)在生物體基因組的指定位點(diǎn)引入雙鏈斷裂后，其編輯的結(jié)果都是隨機(jī)的堿基插入或缺失(Indel)⁴。到目前為止，在植物基因組中進(jìn)行精確的堿基替換一直是一項(xiàng)難題，其實(shí)現(xiàn)途徑主要是同源重組，即通過外源供體DNA來實(shí)現(xiàn)堿基替換，但是其效率非常低，至今還尚未有效應(yīng)用于植物研究和育種?，F(xiàn)有的幾個(gè)發(fā)表在國際頂級期刊的堿基替換的報(bào)道都還只是瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)^5，6，或者其編輯位點(diǎn)本身就是篩選標(biāo)簽⁷，例如除草劑雙草醚的靶基因乙酸乳酸合成酶ALS等⁸。另一方面，大規(guī)模的基因測序表明，重要的農(nóng)藝性狀位點(diǎn)大多都是單堿基改變^9，10。因此，在植物研究和育種領(lǐng)域，迫切需要一種能夠進(jìn)行高效的堿基替換的方法。

因此，本領(lǐng)域迫切需要在植物領(lǐng)域建立一套適用于植物細(xì)胞的高效的定點(diǎn)堿基替換工具，并且可獲得穩(wěn)定植株，從而有效的應(yīng)用于植物研究和育種。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種適用于植物細(xì)胞的高效的定點(diǎn)堿基替換工具，并且可獲得穩(wěn)定植株，從而有效的應(yīng)用于植物研究和育種。

本發(fā)明第一方面提供了一種用于對植物進(jìn)行基因編輯的核酸構(gòu)建物，所述的核酸構(gòu)建物包括：

第一表達(dá)盒；

第二表達(dá)盒；和

任選的第三表達(dá)盒；

其中，所述第一表達(dá)盒為用于表達(dá)gRNA的gRNA表達(dá)盒；

所述第二表達(dá)盒為用于表達(dá)融合蛋白的融合蛋白表達(dá)盒，所述的融合蛋白具有式Ia或Ib結(jié)構(gòu)：

A-L1-B-L2-C (Ia)

B-L1-A-L2-C (Ia)

各式中，

A為胞嘧啶脫氨基酶；

L1為無或第一連接肽(如Xten)

B為無切割活性的Cas9或僅具有單鏈切割活性的Cas9；

L2為無或第二連接肽(如Xten)；

C為無或Uracil DNA glycosylase inhibitor(UGI)；

所述第三表達(dá)盒為用于表達(dá)篩選標(biāo)記的篩選標(biāo)記表達(dá)盒；

并且，所述的第一表達(dá)盒、第二表達(dá)盒、和第三表達(dá)盒各自獨(dú)立地位于相同或不同的載體上。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一表達(dá)盒具有式A結(jié)構(gòu)：

X1-X2-X3 (A)

式中，

X1為植物啟動子，優(yōu)選植物聚合酶III驅(qū)動的啟動子(如U6、U3啟動子)；

X2為gRNA的編碼序列；

X3為polyT。

在另一優(yōu)選例中，所述的第二表達(dá)盒具有式B結(jié)構(gòu)：

Y1-Y2-Y3 (B)

式中，

Y1為植物啟動子，優(yōu)選UBI、CaMV35S、Actin啟動子；

Y2為融合蛋白的編碼序列，所述融合蛋白具有如上所述的式Ia或Ib結(jié)構(gòu)；

Y3為終止子。

在另一優(yōu)選例中，所述的第三表達(dá)盒具有式C結(jié)構(gòu)：

Z1-Z2-Z3 (C)

式中，

Z1為植物啟動子，優(yōu)選35S、UBI、Actin啟動子；

Z2為編碼篩選標(biāo)記的編碼序列；

Z3為終止子。

在另一優(yōu)選例中，所述的篩選標(biāo)記選自下組：潮霉素的抗性基因(HYG)、G418和卡那霉素的抗性基因(NPTII)、Basta的抗性基因(BAR)、嘌呤霉素抗性基因(PAC)、新霉素抗性基因(NEO)、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一表達(dá)盒和第二表達(dá)盒位于同一的載體上。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一表達(dá)盒、第二表達(dá)盒和第三表達(dá)盒位于同一的載體上。

在另一優(yōu)選例中，所述的第二表達(dá)盒和第三表達(dá)盒位于同一的載體上。

在另一優(yōu)選例中，所述的載體為可轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的表達(dá)載體。

在另一優(yōu)選例中，所述的載體為農(nóng)桿菌Ti載體。

在另一優(yōu)選例中，當(dāng)?shù)谝槐磉_(dá)盒、第二表達(dá)盒和第三表達(dá)盒中的兩個(gè)或三個(gè)位于同一載體時(shí)，所述的二個(gè)或三個(gè)表達(dá)盒是成簇排列的，從而構(gòu)成表達(dá)盒簇(cluster)。

在另一優(yōu)選例中，在所述表達(dá)盒簇的5’端外側(cè)含有RB序列；并且在所述表達(dá)盒簇的3’端外側(cè)含有LB序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒簇中，各表達(dá)盒的排列次序(從5’-3’)選自下組：

第一表達(dá)盒和第二表達(dá)盒；

第一表達(dá)盒、第二表達(dá)盒和第三表達(dá)盒；

第二表達(dá)盒、第一表達(dá)盒和第三表達(dá)盒；

第三表達(dá)盒、第二表達(dá)盒和第一表達(dá)盒；

第三表達(dá)盒、第一表達(dá)盒和第二表達(dá)盒；

第三表達(dá)盒、第二表達(dá)盒；

第二表達(dá)盒、第三表達(dá)盒。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一表達(dá)盒和第二表達(dá)盒位于不同的載體上。

在另一優(yōu)選例中，當(dāng)單個(gè)表達(dá)盒位于一載體時(shí)，則在所述表達(dá)盒的5’端外側(cè)含有RB序列；并且在所述表達(dá)盒的3’端外側(cè)含有LB序列。

本發(fā)明第二方面提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有如本發(fā)明第一方面所述的核酸構(gòu)建物，其中，所述的第一表達(dá)盒、第二表達(dá)盒、和第三表達(dá)盒各自獨(dú)立地位于相同或不同的載體上。

在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體骨架為pCamiba1300。

在另一優(yōu)選例中，所述的載體為可轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的表達(dá)載體。

在另一優(yōu)選例中，所述的載體為農(nóng)桿菌Ti載體。

在另一優(yōu)選例中，所述載體是環(huán)狀的或者是線性的。

本發(fā)明第三方面提供了一種宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞含有本發(fā)明第二方面所述的表達(dá)載體。

在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為農(nóng)桿菌。

在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。

本發(fā)明第四方面提供了一種基因工程細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有本發(fā)明第一方面所述的構(gòu)建物，或其基因組整合有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明第一方面所述的構(gòu)建物。

在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞為植物細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述的植物選自下組：禾本科植物、豆科植物、十字花科植物、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的植物選自下組：水稻、大豆、番茄、玉米、煙草、小麥、高粱、擬南芥、大麥、燕麥、粟、花生、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的基因工程細(xì)胞是用選自下組的方法將本發(fā)明第一方面所述的構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞的：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、顯微注射法、電擊法、超聲波法、聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)法、或其組合。

本發(fā)明第五方面提供了一種對植物進(jìn)行基因編輯的方法，包括步驟：

(i)提供待編輯植物；

(ii)將本發(fā)明第二方面所述的表達(dá)載體導(dǎo)入所述待編輯植物。

在另一優(yōu)選例中，所述導(dǎo)入為通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入。

在另一優(yōu)選例中，所述導(dǎo)入為通過基因槍導(dǎo)入。

在另一優(yōu)選例中，所述的基因編輯為定點(diǎn)堿基替換。

在另一優(yōu)選例中，所述的定點(diǎn)突變包括將C突變?yōu)門或者C突變?yōu)镚

在另一優(yōu)選例中，所述的定點(diǎn)突變包括將PAM遠(yuǎn)端第4-8位中的C進(jìn)行定點(diǎn)突變。

本發(fā)明第六方面提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，包括步驟：

(i)將本發(fā)明第一方面所述的構(gòu)建物、或本發(fā)明第二方面所述的載體轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，使得所述構(gòu)建物與所述植物細(xì)胞中的染色體發(fā)生定點(diǎn)突變，從而制得所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)染采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法或基因槍轟擊法。

本發(fā)明第七方面提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，包括步驟：

(i)將本發(fā)明第一方面所述的構(gòu)建物、或本發(fā)明第二方面所述的載體轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，使得所述植物細(xì)胞含有所述構(gòu)建物，從而制得所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。

本發(fā)明第八方面提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括步驟：

將本發(fā)明第六方面或本發(fā)明第七方面所述方法制備的所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生為植物體，從而獲得所述轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明第九方面提供了一種轉(zhuǎn)基因植物，所述的植物是用本發(fā)明第八方面所述的方法制備的，或者所述植物的植物細(xì)胞中含有本發(fā)明第一方面所述的構(gòu)建物或其基因組整合有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明第一方面所述的構(gòu)建物。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1基于胞嘧啶脫氨酶的定點(diǎn)堿基替換示意圖。將表達(dá)Cas的DNA序列與表達(dá)胞嘧啶脫氨基酶的DNA序列連接，轉(zhuǎn)化植物受體，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的DNA表達(dá)該融合蛋白和guide RNA。融合胞嘧啶脫氨基酶(103)的Cas蛋白(101)在其guide RNA(102)的引導(dǎo)下，將植物基因組(104)中靶點(diǎn)位置的胞嘧啶C脫氨基生成尿嘧啶U，然后在植物細(xì)胞的修復(fù)系統(tǒng)作用下，將U修復(fù)成T或G。

圖2采用APOBEC1和CRISPR/Cas9的定點(diǎn)堿基替換載體。(A)載體pCSGAPO1的示意圖。(B)脫氨基區(qū)域示意圖。

圖3水稻愈傷組織定點(diǎn)堿基替換結(jié)果。(A)水稻NRT1.1B基因堿基替換示意圖。(B)水稻SLR1基因堿基替換示意圖。(C)高通量測序檢測結(jié)果。

圖4水稻轉(zhuǎn)基因植株中NRT1.1B基因的堿基替換結(jié)果。(A)Indel植株(#35)和堿基替換植株(#15)的Sanger測序結(jié)果。(B)堿基替換植株(#15)的PCR產(chǎn)物單菌落測序結(jié)果。

圖5水稻轉(zhuǎn)基因植株中SLR1基因的堿基替換結(jié)果。(A)StyI酶切檢測示意圖及結(jié)果。(B)Indel植株(#07)和堿基替換植株(#07、#10、#18、#23、#28和#37)的Sanger測序結(jié)果。(C)堿基替換植株(#07)的單菌落測序結(jié)果。(D)SLR1基因野生型(WT)、敲除(SLR#09)和堿基替換(SLR#07)的T0代植株表型。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，通過大量篩選，篩選出針對特異性位點(diǎn)的優(yōu)化的啟動子，通過采用特定結(jié)構(gòu)的核酸構(gòu)建物，本發(fā)明首次在植物中成功實(shí)現(xiàn)了RNA引導(dǎo)的堿基定點(diǎn)突變(如C突變?yōu)門或G)，并且突變效率可高達(dá)11.5％，并且在一個(gè)突變植株內(nèi)，有高達(dá)60％的細(xì)胞發(fā)生了替換。

具體地，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)胞嘧啶脫氨基酶能夠在CRISPR/Cas9的引導(dǎo)下，在植物細(xì)胞的基因組上定點(diǎn)修改靶點(diǎn)上的胞嘧啶，將其突變?yōu)門或G，并在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

如本文所用，術(shù)語“堿基替換”、堿基突變”可互換使用，均指將某一堿基突變?yōu)槠渌麎A基，比如C突變?yōu)門或者C突變?yōu)镚。

如本文所用，“篩選標(biāo)記基因”指轉(zhuǎn)基因過程中用來篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動物的基因，可用于本申請的篩選標(biāo)記基因沒有特別限制，包括轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域常用的各種篩選標(biāo)記基因，代表性例子包括(但并不限于)：潮霉素抗性基因(Hyg)、卡那霉素抗性基因(NPTII)、新霉素基因、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素的抗性基因(HYG)、G418和卡那霉素的抗性基因(NPTII)、Basta的抗性基因(BAR)、嘌呤霉素抗性基因(PAC)、和/或新霉素抗性基因(NEO)。

如本文所用，術(shù)語“表達(dá)盒”是指含有待表達(dá)基因以及表達(dá)所需元件的序列組件的一段多聚核苷酸序列。例如，在本發(fā)明中，術(shù)語“篩選標(biāo)記表達(dá)盒”指含有編碼篩選標(biāo)記的序列以及表達(dá)所需元件的序列組件的多聚核苷酸序列。表達(dá)所需的組件包括啟動子和聚腺苷酸化信號序列。此外，篩選標(biāo)記表達(dá)盒還可以含有或不含有其他序列，包括(但并不限于)：增強(qiáng)子、分泌信號肽序列等。

在本發(fā)明中，適用于外源基因表達(dá)盒和篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒的啟動子可以是任何一種常見的啟動子，它可以是組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。較佳地，該啟動子是組成型啟動子，例如UBI啟動子等其它適用于真核表達(dá)的植物啟動子。

如本文所用，術(shù)語“植物啟動子”指能夠在植物細(xì)胞中啟動核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。該植物啟動子可以是來源于植物、微生物(如細(xì)菌、病毒)或動物等，或者是人工合成或改造過的啟動子。

如本文所用，術(shù)語“植物終止子”指能夠在植物細(xì)胞中可使轉(zhuǎn)錄停止的終止子。該植物轉(zhuǎn)錄終止子可以是來源于植物、微生物(如細(xì)菌、病毒)或動物等，或者是人工合成或改造過的終止子。代表性的例子包括(但并不限于)：Nos終止子。

如本文所用，術(shù)語“Cas蛋白”指一種核酸酶。一種優(yōu)選的Cas蛋白是Cas9蛋白。典型的Cas9蛋白包括(但并不限于)：來源于釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9。在本發(fā)明中，Cas9蛋白為突變的Cas9蛋白，具體地，是無切割活性或只具有單鏈切割活性的突變的Cas9蛋白。

如本文所用，術(shù)語“Cas蛋白的編碼序列”指編碼Cas蛋白的核苷酸序列。在插入的多聚核苷酸序列被轉(zhuǎn)錄和翻譯從而產(chǎn)生功能性Cas蛋白的情況下，技術(shù)人員會認(rèn)識到，因?yàn)槊艽a子的簡并性，有大量多聚核苷酸序列可以編碼相同的多肽。另外，技術(shù)人員也會認(rèn)識到不同物種對于密碼子具有一定的偏好性，可能會根據(jù)在不同物種中表達(dá)的需要，會對Cas蛋白的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，這些變異體都被術(shù)語“Cas蛋白的編碼序列”所具體涵蓋。此外，術(shù)語特定地包括了全長的、與Cas基因序列基本相同的序列，以及編碼出保留Cas蛋白功能的蛋白質(zhì)的序列。

如本文所用，術(shù)語“植物”包括全植株、植物器官(如葉、莖、根等)、種子和植物細(xì)胞以及它們的子代?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物的種類沒有特別限制，一般包括任何可進(jìn)行轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物類型，包括單子葉、雙子葉植物和裸子植物。

本發(fā)明的構(gòu)建物

在本發(fā)明中，提供了一種核酸構(gòu)建物，用于對植物進(jìn)行基因編輯，所述的核酸構(gòu)建物包括：

第一表達(dá)盒；

第二表達(dá)盒；和

任選的第三表達(dá)盒；

其中，第一表達(dá)盒為用于表達(dá)gRNA的gRNA表達(dá)盒；

第二表達(dá)盒為用于表達(dá)融合蛋白的融合蛋白表達(dá)盒，所述的融合蛋白具有式Ia或Ib結(jié)構(gòu)：

A-L1-B-L2-C (Ia)

B-L1-A-L2-C (Ia)

各式中，

A為胞嘧啶脫氨基酶；

L1為無或第一連接肽(如Xten)

B為無切割活性的Cas9或僅具有單鏈切割活性的Cas9；

L2為無或第二連接肽(如Xten)；

C為無或Uracil DNA glycosylase inhibitor(UGI)；

第三表達(dá)盒為用于表達(dá)篩選標(biāo)記的篩選標(biāo)記表達(dá)盒；

并且，所述的第一表達(dá)盒、第二表達(dá)盒、和第三表達(dá)盒各自獨(dú)立地位于相同或不同的載體上。

本發(fā)明的構(gòu)建物中所用的各種元件都是本領(lǐng)域中已知的，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用常規(guī)方法，如PCR方法、全人工化學(xué)合成法、酶切方法獲得相應(yīng)的元件，然后通過熟知的DNA連接技術(shù)連接在一起，就形成了本發(fā)明的構(gòu)建物。

將本發(fā)明的構(gòu)建物插入外源載體(尤其是適合轉(zhuǎn)基因植物操作的載體)，就構(gòu)成了本發(fā)明的載體。

將本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞從而介導(dǎo)本發(fā)明的載體對植物細(xì)胞染色體進(jìn)行整合，制得轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。

將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生為植物體，從而獲得轉(zhuǎn)基因植物。

將本發(fā)明構(gòu)建好的上述核酸構(gòu)建物，通過常規(guī)的植物重組技術(shù)(例如農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)讓技術(shù))，可以導(dǎo)入植物細(xì)胞，從而獲得攜帶所述核酸構(gòu)建物(或帶有所述核酸構(gòu)建物的載體)的植物細(xì)胞，或獲得基因組中整合有所述核酸構(gòu)建物的植物細(xì)胞。

載體構(gòu)建

該載體的主要特征是將胞嘧啶脫氨基酶與CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Cas蛋白連接形成融合蛋白，并由guide RNA引導(dǎo)至基因組中的靶點(diǎn)位置。由于胞嘧啶脫氨基酶直接將胞嘧啶C脫氨基生成U，并不需要Cas蛋白的DNA雙鏈切割活性。因此，在本發(fā)明中Cas蛋白是無切割活性的突變的Cas蛋白。胞嘧啶C脫氨基生成U后，植物細(xì)胞啟動堿基錯(cuò)配修復(fù)，將U-G修復(fù)為T-A或者C-G。為了增加U-G轉(zhuǎn)化為T-A的比例，可以保留Cas蛋白的DNA單鏈切刻活性，即在非編輯單鏈(編輯靶點(diǎn)C的匹配鏈)造成單鏈切刻。因此，優(yōu)選的，將胞嘧啶脫氨基酶與具有單鏈切刻活性的Cas蛋白融合，形成融合蛋白。一般的，為了增加融合蛋白的活性，蛋白間一般通過一些柔性短肽連接，即Linker。優(yōu)選的，該Linker可以選用XTEN。

為了增加修復(fù)效率，一般選擇適用于植物細(xì)胞的強(qiáng)啟動子，比如CaMV 35S啟動子或者UBI啟動子等。選擇適用于植物細(xì)胞的guide RNA的表達(dá)框，并將其與上述融合蛋白表達(dá)框構(gòu)建在同一載體。顯而易見的，這兩個(gè)表達(dá)框也可以在不同的DNA分子上。

靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

胞嘧啶脫氨基酶通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)引導(dǎo)至靶點(diǎn)位置后，脫氨基酶的作用區(qū)域一般固定。例如，將胞嘧啶脫氨基酶APOBEC1蛋白通過16個(gè)氨基酸的XTEN Linker連接至Cas9的N端后，其脫氨基的作用區(qū)域?yàn)間uilde RNA的第4-8個(gè)堿基區(qū)域，該區(qū)域即為“脫氨基窗口區(qū)”(圖2)。根據(jù)這一原則，在設(shè)計(jì)靶點(diǎn)時(shí)，需將待編輯的胞嘧啶處于“脫氨基窗口區(qū)”。

遺傳轉(zhuǎn)化

將上述載體通過合適的方法導(dǎo)入到植物受體中。導(dǎo)入方法包括但不局限于：基因槍法、顯微注射法、電擊法、超聲波法和聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)法等。受體植物包括但不限于水稻、大豆、番茄、玉米、煙草、小麥、高粱等。上述DNA載體或片段導(dǎo)入植物細(xì)胞后，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的DNA表達(dá)該融合蛋白和guide RNA。融合胞嘧啶脫氨基酶的Cas蛋白在其guide RNA的引導(dǎo)下，將靶點(diǎn)位置的胞嘧啶C脫氨基生成尿嘧啶U，然后在植物細(xì)胞的修復(fù)系統(tǒng)作用下，將U修復(fù)成T或G。進(jìn)一步的，通過組織培養(yǎng)獲得堿基替換后的植株。

應(yīng)用

本發(fā)明可以用于植物基因工程領(lǐng)域，用于植物研究和育種，尤其是具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的農(nóng)作物和林業(yè)作物的遺傳改良。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：

(1)本發(fā)明首次提供了一種在植物中實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)堿基突變的高效方法，可以廣泛的用于植物研究和育種。

(2)本發(fā)明的定點(diǎn)堿基突變的方法可高效地在植物細(xì)胞的特定位置進(jìn)行堿基突變(如C突變?yōu)門或G)。

(3)用本發(fā)明的方法在植物細(xì)胞中進(jìn)行堿基突變的效果高達(dá)11.5％，并且在一個(gè)突變植株內(nèi)，有高達(dá)60％的細(xì)胞發(fā)生了堿基替換。

(4)本發(fā)明的方法在對植物細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)堿基替換時(shí)，無需額外引入供體DNA，能有效避免外源DNA的隨機(jī)整合。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。本發(fā)明中所涉及的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無特殊說明均可從市售渠道獲得。

通用方法

體外合成小鼠胞嘧啶脫氨基酶APOBEC1，并將其連接至突變的Cas9(D10A)的N端，通過16aa的XTEN柔性短肽連接形成融合蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：1所示：

其蛋白序列如SEQ ID NO.：8所示：

將該序列構(gòu)建至水稻pCambia1300載體(購自澳大利亞Camiba研究所)，并由植物強(qiáng)啟動子UBI啟動表達(dá)。同時(shí)，將guide RNA的表達(dá)框也構(gòu)建至該載體，生成載體pCSGAPO1(圖2A)。將該載體應(yīng)用于下列實(shí)施例。

實(shí)施例1在水稻愈傷組織中實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)堿基替換

首先嘗試應(yīng)用該發(fā)明在水稻愈傷中實(shí)現(xiàn)堿基替換。我們選擇水稻兩個(gè)重要的基因NRT1.1B和SLR1。NRT1.1B可以控制水稻營養(yǎng)元素氮的吸收，增加產(chǎn)量；SLR1控制赤霉素的合成，影響水稻植株高度。利用本發(fā)明，我們設(shè)計(jì)相應(yīng)的靶點(diǎn)，通過高通量測序，成功地在水稻愈傷中檢測到定點(diǎn)堿基替換，其效率可達(dá)11.5％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以前的在植物原生質(zhì)體中的運(yùn)用同源重組的瞬時(shí)實(shí)驗(yàn)。具體操作流程如下：

1.1載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

水稻NRT1.1B基因待編輯的氨基酸為Thr327，而SLR1基因待編輯的氨基酸為Ser97。針對這兩個(gè)位點(diǎn)，我們分別設(shè)計(jì)了靶點(diǎn)。如圖3A和3B所示，待替換的胞嘧啶C都處于靶點(diǎn)的“脫氨基窗口”內(nèi)。因此，我們分別將這兩個(gè)靶點(diǎn)的guide RNA表達(dá)框(SEQ ID NO.：2和SEQ ID NO.：3)構(gòu)建至載體pCSGAPO1(獲自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)，獲得堿基替換載體pCSGAPO1-NRT和pCSGAPO1-SLR1。

將上述兩個(gè)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EAH105，然后轉(zhuǎn)化水稻中花11的愈傷組織。經(jīng)過4周篩選培養(yǎng)后，挑選100-200顆抗性愈傷顆粒至新的培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選2周。最后，挑出全部的抗性愈傷顆粒，混合后提取基因組DNA，進(jìn)行堿基替換檢測。

1.2堿基替換效率檢測

在獲得總的基因組DNA后，分別設(shè)計(jì)引物(表1)，通過PCR擴(kuò)增NRT1.1B和SLR1，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序分析。如圖3C所示，在NRT1.1B的靶點(diǎn)位置上，其第7位的胞嘧啶被替換成了T或者G，其效率分別為1.4％和1.6％；在SLR1的靶點(diǎn)位置上，其guide RNA的第4位置產(chǎn)生了C→T堿基替換，其效率為2.9％，而第6位置的胞嘧啶產(chǎn)生了C→T和C→G的堿基替換，其效率分別為11.5％和3.9％。同時(shí)，我們也檢測到了一定比率的Indel，其由單鏈切刻活性的Cas9(D10A)導(dǎo)致。由于NRT1.1B所設(shè)計(jì)的guide RNA的靶向效率低于SLR1，其堿基替換效率也比SLR1低。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該發(fā)明可有效的應(yīng)用于植物基因組的定點(diǎn)堿基替換。

表1.擴(kuò)增靶點(diǎn)所用的引物

實(shí)施例2獲得定點(diǎn)堿基替換的水稻

將實(shí)施例1中的兩個(gè)堿基替換載體pCSGAPO1-NRT和pCSGAPO1-SLR1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，通過常規(guī)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化，分別獲得了37株編輯NRT1.1B的轉(zhuǎn)基因植株和45株編輯SLR1的轉(zhuǎn)基因植株(表2)。

表2.水稻轉(zhuǎn)基因植株的堿基替換效率統(tǒng)計(jì)

針對37株編輯NRT1.1B的轉(zhuǎn)基因植株，我們采用Sanger測序進(jìn)行DNA測序分析。測序結(jié)果表明，其中4株在靶點(diǎn)位置產(chǎn)生了Indel突變，有1株植株(NRT#15)在其guide RNA的第7位置的胞嘧啶產(chǎn)生了C→G堿基替換。將該轉(zhuǎn)基因植株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至T載體，挑選17個(gè)單克隆進(jìn)行測序，結(jié)果表明該植株中的C→G堿基替換效率為23.5％(4/17)。

對于SLR1的編輯，由于C→T堿基替換可以產(chǎn)生StyI的酶切位點(diǎn)，因此可以通過酶切多態(tài)性檢測該位點(diǎn)的堿基替換。如圖5A所示，對于C→T堿基替換的PCR產(chǎn)物(404bp)，StyI可以將其酶切成90bp+314bp兩個(gè)條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，45株編輯SLR1的轉(zhuǎn)基因植株中，有6株在其guide RNA的第6位置產(chǎn)生了C→T的堿基替換。對這45株植株進(jìn)行Sanger測序分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了該實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們將轉(zhuǎn)基因植株SLR#07的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至T載體，挑選10個(gè)單克隆進(jìn)行測序，結(jié)果表明該植株中的C→T堿基替換效率為60％(6/10)。該結(jié)果與NRT1.1B的編輯結(jié)果類似，即SLR1靶點(diǎn)上的胞嘧啶也未被徹底的替換，也就是說轉(zhuǎn)基因植株NRT#15和SLR#07中的堿基替換位點(diǎn)是嵌合的或者雜合的。但是，這些轉(zhuǎn)基因植株中，靶位點(diǎn)上高達(dá)23.5％-60％的堿基替換率使其足夠遺傳至下一代。

根據(jù)以前的研究，SLR1基因在該位點(diǎn)的堿基替換為顯性突變，可以影響植株生長高度。通過對SLR1的T0代植株的觀察發(fā)現(xiàn)，SLR1敲除植株的植株莖葉纖細(xì)，而發(fā)生堿基替換的轉(zhuǎn)基因植株的植株高度明顯矮于野生型的T0代植株，呈現(xiàn)又矮又壯的表型(圖5D)。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了，應(yīng)用本發(fā)明，在該位點(diǎn)成功進(jìn)行了定點(diǎn)堿基替換，并且替換效率很高。

在該實(shí)施例中，我們只采取了常規(guī)的遺傳轉(zhuǎn)化工作，便獲得了定點(diǎn)堿基替換的植株，說明本發(fā)明在植物研究和育種中廣泛推廣和應(yīng)用的巨大潛力。

并且，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，動物啟動子不能對本發(fā)明的植物(如水稻)進(jìn)行定點(diǎn)堿基替換，只有本發(fā)明的植物啟動子(尤其是水稻特異性的強(qiáng)啟動子)才可對本發(fā)明的植物(如水稻)進(jìn)行定點(diǎn)堿基替換，并且堿基替換效率可達(dá)11.5％，并且在一個(gè)突變植株內(nèi)，有高達(dá)60％的細(xì)胞發(fā)生了堿基替換。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

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