本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測與結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

FCGR2A基因編碼的蛋白是巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面的免疫球蛋白Fc受體，參與吞噬和清除免疫復(fù)合體的生物學(xué)過程。人類FCGR2A基因位于1q23，含有6個(gè)外顯子，編碼317個(gè)氨基酸，編碼蛋白為35KD。研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)于免疫系統(tǒng)細(xì)胞的球蛋白Fc區(qū)段受體與自身抗體或者自身免疫病中免疫復(fù)合物觸發(fā)的致病過程相關(guān)，也與某些免疫治療的有效性相關(guān)。此外，研究報(bào)道FCGR2A基因多態(tài)性與多種疾病相關(guān)，例如4541T（rs1801274）多態(tài)性與淋巴瘤、瘧疾、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病相關(guān)。

FCGR3A編碼免疫球蛋白G的Fc段受體，參與抗體依賴的反應(yīng)中抗原-抗體復(fù)合物的清除。人類FCGR3A基因位于1q23，含有6個(gè)外顯子，編碼290個(gè)氨基酸，編碼蛋白為33KD。研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)于免疫系統(tǒng)細(xì)胞的球蛋白Fc區(qū)段受體與自身抗體或者自身免疫病中免疫復(fù)合物觸發(fā)的致病過程相關(guān)，也與某些免疫治療的有效性相關(guān)。此外，研究報(bào)道FCGR3A基因多態(tài)性與多種疾病相關(guān)，例如5872G（rs396991）與艾滋病的易感性和進(jìn)程、克羅恩氏病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病相關(guān)。

研究報(bào)道FCGR2A基因和FCGR3A基因多態(tài)性與多種疾病相關(guān)，并且可以采用不同的基因分型方法來檢測。溶解曲線法及質(zhì)譜分型是針對大樣本多位點(diǎn)的高通量分型方法，而Taqman探針法是中通量分型的金標(biāo)準(zhǔn)，具有靈敏性高、花費(fèi)相對較少的優(yōu)點(diǎn)。Taqman探針法是在PCR上下游引物間選取一段序列作為探針，并在探針上標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，該探針可與模板結(jié)合，在延伸反應(yīng)中，當(dāng)引物合成至探針與模板結(jié)合處時(shí)，Taq酶的5’外切酶活性可以降解探針5’端，使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，釋放熒光。相對于傳統(tǒng)的限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR-RFLP），Taqman探針法具有靈敏性更高、操作更簡單的優(yōu)勢，且通量更高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種檢測與結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關(guān)基因的多態(tài)性的試劑盒，該試劑盒可用于制備與結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關(guān)的基因多態(tài)性的試劑。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

所述檢測與結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關(guān)的基因多態(tài)性試劑盒中含有檢測FCGR2A基因4541T位點(diǎn)和/或FCGR3A基因5872G位點(diǎn)的探針和引物，所述探針和引物能與FCRG2A基因4541T位點(diǎn)和FCGR3A基因5872G位點(diǎn)前后的基因序列特異性結(jié)合并擴(kuò)增出包含F(xiàn)CRG2A基因4541T位點(diǎn)和/或FCGR3A基因5872G位點(diǎn)的基因序列。

優(yōu)選的，所述探針和引物是與FCRG2A基因4541T位點(diǎn)和/或FCGR3A基因5872G位點(diǎn)前后500bp的基因序列特異性結(jié)合并能擴(kuò)增出包含F(xiàn)CRG2A基因4541T位點(diǎn)和/或FCGR3A基因5872G位點(diǎn)的基因序列。

優(yōu)選的，所述檢測與結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關(guān)基因的多態(tài)性的試劑盒中含有如下探針：

FCGR2A：FAM-TCCAAACGGGAGAATT-MGB(SEQ ID NO.1);

VIC-TGGGATCCAAATGG-MGB(SEQ ID NO.2);

FCGR3A：FAM-AGGGGGCTTGTTG-MGB (SEQ ID NO.3);

VIC-CAGGGGGCTTTTTG-MGB (SEQ ID NO.4);

該試劑盒中還含有如下引物：

FCGR2A-F：5’-TTTGCTTGTGGGATGGAGAAG-3’ (SEQ ID NO.5)

FCGR2A-R：5’-TGAGGTGCCACAGCTGGAA-3’ (SEQ ID NO.6)

FCGR3A-F：5’- CTCAAAGACAGCGGCTCCTACTT -3’ (SEQ ID NO.7)

FCGR3A-R：5’- GGTGATGTTCACAGTCTCTGAAGACA -3’ (SEQ ID NO.8)

其中，F(xiàn)AM吸收波長485-505nm，發(fā)射波長515-530nm；VIC吸收波長515-535nm，發(fā)射波長540-560nm；MGB為淬滅基團(tuán)。所述與結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關(guān)基因?yàn)镕CGR2A基因4541T和FCGR3A基因5872G。

所述試劑盒中每條引物濃度為900nM，每個(gè)探針濃度為250nM。

試劑盒中還包括探針型PCR反應(yīng)液（2X）和無核酸酶無菌純水。

所述探針、引物及包含兩者的試劑盒均可用于制備檢測與結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關(guān)基因多態(tài)性的試劑。

FCRG2A基因4541T位點(diǎn)用于制備檢測與結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性的制劑中的應(yīng)用。

FCGR3A基因5872G位點(diǎn)用于制備檢測與結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性的制劑中的應(yīng)用。

FCGR2A基因4541T和FCGR3A基因5872G可能通過增加病人的無進(jìn)展生存期而具有更好的對西妥昔單抗的藥物應(yīng)答，從而與結(jié)直腸癌的靶向用藥西妥昔單抗的治療敏感性相關(guān)，之前并無相關(guān)報(bào)道。

FCGR2A基因4541T位點(diǎn)位于FCGR2A基因內(nèi)部，在中國漢族人群中，其最小等位基因頻率（Minor Allele Frequency,MAF）為33.5%；FCGR3A基因5872G位點(diǎn)位于FCGR3A基因內(nèi)部，在中國漢族人群中，其最小等位基因頻率為32.89%。目前，還沒有FCGR2A基因4541T和FCGR3A基因5872G多態(tài)性與西妥昔單抗治療敏感性相關(guān)的檢測試劑盒產(chǎn)品面世，因此，探索檢測與結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗的治療敏感性相關(guān)基因的多態(tài)性的方法和產(chǎn)品顯得意義深遠(yuǎn)。

有益效果：本發(fā)明的試劑盒能準(zhǔn)確、快速、簡便的檢測與結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關(guān)的基因位點(diǎn)（FCGR2A基因4541T和FCGR3A基因5872G的多態(tài)性）。

附圖說明

圖1為實(shí)施例中FCGR2A 4541T位點(diǎn)方法驗(yàn)證的熒光散點(diǎn)圖；

圖2為實(shí)施例中FCGR3A 5872G位點(diǎn)方法驗(yàn)證的熒光散點(diǎn)圖；

圖3為實(shí)施例中FCGR2A 4541T位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)樣本的熒光散點(diǎn)圖；

圖4為實(shí)施例中FCGR3A 5872G位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)樣本的熒光散點(diǎn)圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1.設(shè)計(jì)Taqman探針及引物

1.1查找FCGR2A基因4541T位點(diǎn)前后500bp序列

在PUBMED GENE數(shù)據(jù)庫中搜索FCGR2A，選擇NG_012066.1，在Fasta sequence中可以獲得此多態(tài)位點(diǎn)前、后500bp的序列（SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10）,用于尋找合適的探針和引物。

GTGCCAGGCTTTCTGGAGTGAATGGCTATAACATGAGCCATGAGAAGAAACGAGGCAAACCTCAGCTCTTAGGAATGCCCAGGAGCTTAGGGAACCTCTGCATCAATGAGGGAGCTCTGCTTCACTGCCATCTTTAGTCTGGGGCCTACATTTCAAAGTGAAACAACAGCCTGACTACCTATTACCTGGGACGTGAGGGCTCCAAGCTCTGGCCCCTACTTGTTGGTCAATACTTAGCCAGGCTTCCACCCCACTCCTCTTTGCTCCAGTGCCCAATTTTGCTGCTATGGGCTTTCTCAGACCTCCATGTAGGCCCATGTGACCTCAGCCCTTGTCCATCCCCTCTTCTCCCCTCCCTACATCTTGGCAGACTCCCCATACCTTGGACAGTGATGGTCACAGGCTTGGATGAGAACAGCGTGTAGCCTATGTTTCCTGTGCAGTGGTAATCACCACTGTGACTGTGGTTTGCTTGTGGGATGGAGAAGGTGGGATCCAAA（SEQ ID NO.9）；

Y（Y是指FCGR2A基因4541T位點(diǎn)）

GGGAGAATTTCTGGGATTTTCCATTCTGGAAGAATGTGACCTTGACCAGAGGCTTGTCCTTCCAGCTGTGGCACCTCAGCATGATGGTTTCTCCCTCCTGGAACTCCAGGTGAGGGGTCTGGAGCACCAGCCATTCTGAAAGACACAAATATGATAAGAAAAAGTTGTAAGGATAGATTCCAAGGGTTTTTCAGTCTCAGAGGTACGTTACTCACAGAACTTGACATGATGTCTGGCAGACAGAAATGAAGATGCTTCATGACAGATGTGAGCATTCTCTTATAGGCAATATATGGTATTATATCTGTGGGACTTCTAAAAGCAGAAGTTTTCAGAGGTTTCAAAGATGCAGAGCAGATATTTAAAACAATTCTGAGGAATTTAAAATACTACGTTTGAGTAGAGAAATGAGCGCATTTCAGTAACTGTAGAGGCTACTCGACAGGGCCTGAAGCCGTCAGTTTTTGTGGTCTGGGGATTACTAATTTAATGGTAAATTT（SEQ ID NO.10）。

在PUBMED SNP數(shù)據(jù)庫中搜索FCGR3A，選擇rs396991，進(jìn)入Gene View，選擇NM_001127593.1，在Fasta sequence中可以獲得此多態(tài)位點(diǎn)前、后500bp的序列（SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12），用于尋找合適的探針和引物。

CTGCAGATATGCTCATCGTTGCTTCTCACTTACCTCATTGCTTAGTCCCTCTGCTCTAACCCTGTGTGTTGATCACATGTGTGTGTGTCCCTCTTCCCCATTAGACAAAGGTCTTGGTATGACTTCAGTTCTCTTGCAGGGCCCCATCAGCTCTTCCCCAAAGGGAGCTATGCAGGGTTGACTCCCAATCTGGCTTTCCCTTATGTCTCAGGATCTGGGTGGTACGTGGCCCCTTCACAAAGCTCTGCACTGAGAGCTGAGGCCTCCCGGGCCTGGGGTGTCTGTGTCTTTCAGGCTGGCTGTTGCTCCAGGCCCCTCGGTGGGTGTTCAAGGAGGAAGACCCTATTCACCTGAGGTGTCACAGCTGGAAGAACACTGCTCTGCATAAGGTCACATATTTACAGAATGGCAAAGGCAGGAAGTATTTTCATCATAATTCTGACTTCTACATTCCAAAAGCCACACTCAAAGACAGCGGCTCCTACTTCTGCAGGGGGCTT（SEQ ID NO.11）；

Y（Y是指FCGR3A基因5872G位點(diǎn)）

TTGGGAGTAAAAATGTGTCTTCAGAGACTGTGAACATCACCATCACTCAAGGTGAGACATGTGCCACCCTGGAATGCCCAGGGACGCCTGTGTGTGGAACCTGCAATCACACTGGGAAGTTGAGTTGGGAGGAGATTCCTGATTCTTACACGCACTTCTTCATATGTGGTTCCCTCCTGGTGATCACCAGGAGGTCCCCAAAAGTCCCTGATTGCAGGGTAGGTTTGCAGCTCTGTTTCAGTCCATTCTTTTGGGGTAGCTAGGAGGTGTCATTCACTCTGCAGCATGATGGCAGGAGCAGAAGCCACATCTCCTCCCCAATAAATACCTCTGTCTTTCCTTACGCTAATCACACCCACGGTGTCATATGTTCCTATCGTGCTGGCCTCCTTCTTATCCAAGCCTTTTAGCCACGATCCAAACTGGCAGGAGCCCCTCATCCCCTCACAGAAAGAGCCCAGAACCTGGGTTCTGGCCCTGCAGCTAATTAACCATCTGAC（SEQ ID NO.12）。

1.2利用PrimerExpress 3.0進(jìn)行探針和引物的設(shè)計(jì)

（1）探針設(shè)計(jì)原則：

1.確保G-C含量在20-80%之間。

2.探針5’端的第一個(gè)堿基不能是G。

3.用Primer Express軟件計(jì)算出來的探針Tm值應(yīng)當(dāng)在68-70℃之間。

4.探針要盡可能地短，但是不要短于13個(gè)堿基。

5.避免同一堿基重復(fù)過多，特別是G，不可超過4個(gè)及以上。

6.盡量使含C多于含G的探針。如果C少于G，則使用互補(bǔ)鏈上的探針。

7.如果是SNP，多態(tài)位點(diǎn)盡量位于探針中央。

（2）引物設(shè)計(jì)原則：

1.在探針確定以后再選擇引物。

2.引物要盡可能地接近探針，但是不要重疊。

3.保持G-C含量在20-80%之間。

4.避免同一堿基重復(fù)過多。特別是G，不可超過4個(gè)及以上。

5.用Primer Express軟件計(jì)算出來的Tm值應(yīng)當(dāng)在58-60℃之間。

6.在3’端的5個(gè)堿基中，G和C堿基加起來不要超過2個(gè)。

（3）Primer Express 3.0操作方法

進(jìn)入Primer Express 3.0軟件，F(xiàn)ile/New/選擇Taqman MGB Allelic。粘貼SNP位點(diǎn)前后500bp序列，標(biāo)定SNP位置并選擇變異類型。然后選擇引物/探針查找，軟件即開始查找合適的引物和探針。若沒有匹配的探針和引物，則可手動設(shè)計(jì)。

確定FCGR2A基因4541T位點(diǎn)Taqman探針和引物如下：

探針（AB（Applied Biosystems）公司）：

Probe1（C）：FAM-TCCAAACGGGAGAATT-MGB（SEQ ID NO.1）;

Probe2（T）：VIC-TGGGATCCAAATGG-MGB（SEQ ID NO.2）;

FAM吸收波長485-505nm，發(fā)射波長515-530nm；VIC吸收波長515-535nm，發(fā)射波長540-560nm；MGB為淬滅基團(tuán)。

引物（博尚生物）：

FCGR2A-F：5’-TTTGCTTGTGGGATGGAGAAG-3’（SEQ ID NO.5）；

FCGR2A-R：5’-TGAGGTGCCACAGCTGGAA-3’（SEQ ID NO.6）;

確定FCGR3A基因5872G位點(diǎn)Taqman探針和引物如下:

探針（AB（Applied Biosystems）公司）：

Probe3（G）：FAM-AGGGGGCTTGTTG-MGB（SEQ ID NO.3）;

Probe4（T）：VIC-CAGGGGGCTTTTTG-MGB（SEQ ID NO.4）;

FAM吸收波長485-505nm，發(fā)射波長515-530nm；VIC吸收波長515-535nm，發(fā)射波長540-560nm；MGB為淬滅基團(tuán)。

引物（博尚生物）：

FCGR3A-F：5’- CTCAAAGACAGCGGCTCCTACTT -3’（SEQ ID NO.7）；

FCGR3A-R：5’- GGTGATGTTCACAGTCTCTGAAGACA -3’（SEQ ID NO.8）。

2.SNP檢測

2.1PCR擴(kuò)增體系及程序

FCGR2A擴(kuò)增體系（Takara390A）：

Premix Ex Taq (probe qPCR) 2x 10ul

FCGR2A-F primer (10 umol) 0.4ul

FCGR2A-R primer (10 umol) 0.4ul

Probe 1 (10 umol) 0.8ul

Probe 2 (10 umol) 0.8ul

gDNA 2ul

ddH₂O 6.4ul

FCGR3A擴(kuò)增體系（Takara390A）

Premix Ex Taq (probe qPCR) 2x 10ul

FCGR3A-F primer (10 umol) 0.4ul

FCGR3A-R primer (10 umol) 0.4ul

Probe 3 (10 umol) 0.8ul

Probe 4 (10 umol) 0.8ul

gDNA 2ul

ddH₂O 6.4ul

程序（Roche LightCycler 480Ⅱ）；

95℃ 30s

[95℃ 5s

60℃ 20s]40循環(huán)

擴(kuò)增產(chǎn)物1（FCGR2A）：112bp

TGAGGTGCCACAGCTGGAAGGACAAGCCTCTGGTCAAGGTCACATTCTTCCAGAATGGAAAATCCCAGAAATTCTCCCATTTGGATCCCACCTTCTCCATCCCACAAGCAAA（SEQ ID NO.13）；

擴(kuò)增產(chǎn)物2（FCGR3A）：78bp

CTCAAAGACAGCGGCTCCTACTTCTGCAGGGGGCTTTTTGGGAGTAAAAATGTGTCTTCAGAGACTGTGAACATCACC（SEQ ID NO.14）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證

對已知FCGR2A 4541T位點(diǎn)基因型的6個(gè)樣本用本檢測方法進(jìn)行檢測，其中A6/B6為CC基因型，C6/D6為CT基因型，E6/F6為TT基因型已通過質(zhì)譜分型確認(rèn)，G6為陰性對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，A6/B6FAM熒光強(qiáng)度（465-510nm）遠(yuǎn)大于VIC熒光強(qiáng)度（533-580nm），說明其為CC基因型；C6/D6FAM與VIC熒光強(qiáng)度相當(dāng)，說明其為CT基因型；E6/F6VIC熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于FAM熒光強(qiáng)度，說明其為TT基因型；G6為陰性對照。我們所建立的Taqman探針法檢測出的對應(yīng)樣本的基因型與已知基因型完全一致，表明我們的Taqman SNP檢測方法成功建立。

對已知FCGR3A 5872G位點(diǎn)基因型的6個(gè)樣本用本方法進(jìn)行檢測，其中其中A6/B6為GG基因型，C6/D6為GT基因型，E6/F6為TT基因型已通過質(zhì)譜分型確認(rèn)，G6為陰性對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，A6/B6FAM熒光強(qiáng)度（465-510nm）遠(yuǎn)大于VIC熒光強(qiáng)度（533-580nm），說明其為GG基因型；C6/D6FAM與VIC熒光強(qiáng)度相當(dāng)，說明其為GT基因型；E6/F6VIC熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于FAM熒光強(qiáng)度，說明其為TT基因型；G6為陰性對照。我們所建立的Taqman探針法檢測出的對應(yīng)樣本的基因型與已知基因型完全一致，表明我們的Taqman SNP檢測方法成功建立。

2.3實(shí)驗(yàn)樣品SNP檢測

根據(jù)上述已建立的Taqman探針法檢測FCGR2A基因4541T多態(tài)性的方法，我們對20個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行了分型實(shí)驗(yàn)。A10、A6、A32已知為TT、TC、CC基因型作為實(shí)驗(yàn)過程的參照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1及圖3所示，其中A32、A6、A10分別為CC、TC、TT 基因型，說明實(shí)驗(yàn)過程無誤；所檢測20例樣本有14例為CC基因型，4例為TC基因型，2例為TT基因型；三種基因型在圖3中呈組內(nèi)分布集中，組間分布差異明顯。更進(jìn)一步說明我們成功建立Taqman探針法對FCGR2A基因4541T多態(tài)性的檢測方法。實(shí)驗(yàn)樣本結(jié)果如表1所示：

表1

根據(jù)上述已建立的Taqman探針法檢測FCGR3A基因5872G多態(tài)性的方法，我們對20個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行了分型實(shí)驗(yàn)。B5、B83、B28已知為TT、TG、GG基因型作為實(shí)驗(yàn)過程的參照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2及圖4所示，其中B5、B83、B28分別為TT、TG、GG基因型，說明實(shí)驗(yàn)過程無誤；所檢測20例樣本有5例為TT基因型，7例為TG基因型，8例為TT基因型；三種基因型在圖4中呈組內(nèi)分布集中，組間分布差異明顯。更進(jìn)一步說明我們成功建立Taqman探針法對FCGR3A基因5872G多態(tài)性的檢測方法。實(shí)驗(yàn)樣本結(jié)果如表2所示：

表2

采用本發(fā)明所述試劑盒能迅速快捷的檢測FCGR2A 4541T和FCGR3A 5872G多態(tài)性，且靈敏度高。

我們收集了200例對結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗敏感的患者和189例對結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗不敏感的患者。對FCGR2A 4541T和FCGR3A 5872G進(jìn)行基因分型實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)位點(diǎn)與西妥昔單抗治療敏感性相關(guān)（FCGR2A 4541T：p<0.001,OR=0.397,95%CI:0.28-0.61；FCGR3A 5872G：p<0.001, OR=0.23, 95%CI: 0.18-0.47）。此結(jié)果表明攜帶FCGR2A 4541T的患者比攜帶C等位基因的患者使用西妥昔單抗治療的敏感性好，攜帶FCGR3A 5872G的患者比攜帶T等位基因的患者使用西妥昔單抗治療的敏感性好。因此，F(xiàn)CGR2A 4541T和FCGR3A 5872G對西妥昔單抗治療結(jié)直腸癌具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海杏園瑞民生物工程有限公司

<120> 一種檢測與結(jié)直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關(guān)基因的多態(tài)性的試

劑盒及其應(yīng)用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tccaaacggg agaatt 16

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgggatccaa atgg 14

<210> 3

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agggggcttg ttg 13

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagggggctt tttg 14

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttgcttgtg ggatggagaa g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgaggtgcca cagctggaa 19

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctcaaagaca gcggctccta ctt 23

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtgatgttc acagtctctg aagaca 26

<210> 9

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtgccaggct ttctggagtg aatggctata acatgagcca tgagaagaaa cgaggcaaac 60

ctcagctctt aggaatgccc aggagcttag ggaacctctg catcaatgag ggagctctgc 120

ttcactgcca tctttagtct ggggcctaca tttcaaagtg aaacaacagc ctgactacct 180

attacctggg acgtgagggc tccaagctct ggcccctact tgttggtcaa tacttagcca 240

ggcttccacc ccactcctct ttgctccagt gcccaatttt gctgctatgg gctttctcag 300

acctccatgt aggcccatgt gacctcagcc cttgtccatc ccctcttctc ccctccctac 360

atcttggcag actccccata ccttggacag tgatggtcac aggcttggat gagaacagcg 420

tgtagcctat gtttcctgtg cagtggtaat caccactgtg actgtggttt gcttgtggga 480

tggagaaggt gggatccaaa 500

<210> 10

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gggagaattt ctgggatttt ccattctgga agaatgtgac cttgaccaga ggcttgtcct 60

tccagctgtg gcacctcagc atgatggttt ctccctcctg gaactccagg tgaggggtct 120

ggagcaccag ccattctgaa agacacaaat atgataagaa aaagttgtaa ggatagattc 180

caagggtttt tcagtctcag aggtacgtta ctcacagaac ttgacatgat gtctggcaga 240

cagaaatgaa gatgcttcat gacagatgtg agcattctct tataggcaat atatggtatt 300

atatctgtgg gacttctaaa agcagaagtt ttcagaggtt tcaaagatgc agagcagata 360

tttaaaacaa ttctgaggaa tttaaaatac tacgtttgag tagagaaatg agcgcatttc 420

agtaactgta gaggctactc gacagggcct gaagccgtca gtttttgtgg tctggggatt 480

actaatttaa tggtaaattt 500

<210> 11

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctgcagatat gctcatcgtt gcttctcact tacctcattg cttagtccct ctgctctaac 60

cctgtgtgtt gatcacatgt gtgtgtgtcc ctcttcccca ttagacaaag gtcttggtat 120

gacttcagtt ctcttgcagg gccccatcag ctcttcccca aagggagcta tgcagggttg 180

actcccaatc tggctttccc ttatgtctca ggatctgggt ggtacgtggc cccttcacaa 240

agctctgcac tgagagctga ggcctcccgg gcctggggtg tctgtgtctt tcaggctggc 300

tgttgctcca ggcccctcgg tgggtgttca aggaggaaga ccctattcac ctgaggtgtc 360

acagctggaa gaacactgct ctgcataagg tcacatattt acagaatggc aaaggcagga 420

agtattttca tcataattct gacttctaca ttccaaaagc cacactcaaa gacagcggct 480

cctacttctg cagggggctt 500

<210> 12

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttgggagtaa aaatgtgtct tcagagactg tgaacatcac catcactcaa ggtgagacat 60

gtgccaccct ggaatgccca gggacgcctg tgtgtggaac ctgcaatcac actgggaagt 120

tgagttggga ggagattcct gattcttaca cgcacttctt catatgtggt tccctcctgg 180

tgatcaccag gaggtcccca aaagtccctg attgcagggt aggtttgcag ctctgtttca 240

gtccattctt ttggggtagc taggaggtgt cattcactct gcagcatgat ggcaggagca 300

gaagccacat ctcctcccca ataaatacct ctgtctttcc ttacgctaat cacacccacg 360

gtgtcatatg ttcctatcgt gctggcctcc ttcttatcca agccttttag ccacgatcca 420

aactggcagg agcccctcat cccctcacag aaagagccca gaacctgggt tctggccctg 480

cagctaatta accatctgac 500

<210> 13

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgaggtgcca cagctggaag gacaagcctc tggtcaaggt cacattcttc cagaatggaa 60

aatcccagaa attctcccat ttggatccca ccttctccat cccacaagca aa 112

<210> 14

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctcaaagaca gcggctccta cttctgcagg gggctttttg ggagtaaaaa tgtgtcttca 60

gagactgtga acatcacc 78