本發(fā)明涉及一種結(jié)直腸癌易感基因變異文庫構(gòu)建方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：目前腫瘤的發(fā)病率和死亡率高于其他疾病，開發(fā)以非侵入式診斷策略進行腫瘤基因診斷研發(fā)，針對腫瘤靶標與化療用藥后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與抗藥性，而傳統(tǒng)疾病診斷通過臨床經(jīng)驗、病理監(jiān)測、細胞檢測作為依據(jù)，有靈敏度的限制，也無法做到早期發(fā)現(xiàn)早期治療或提早預(yù)測提早預(yù)防。新一代高通量基因檢測技術(shù)，當(dāng)今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的IonTorrentTM系列測序儀為代表，有著其他技術(shù)不可比擬的高通量、低成本等優(yōu)勢。已被廣泛用于各類生物學(xué)研究核醫(yī)學(xué)檢測。對有參考的物種序列，進行全基因組重測序，在全基因組水平上檢測突變位點，發(fā)現(xiàn)個體差異的分子基礎(chǔ)。新一代測序技術(shù)通過全基因組測序構(gòu)建了大量常規(guī)物種的基因組圖譜，也促進了測序技術(shù)的告訴發(fā)展。同時，高通量測序技術(shù)在基因診斷和基因治療方面也有著重要的作用。SNPs(單核苷酸多態(tài)性)指在不同個體的同一條染色體或同一位點的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一直，而只有一個堿基不同的現(xiàn)象。SNP是人類DNA中常見的變異形式，數(shù)以百萬存在整個人類的基因組中，部分SNP能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)氨基酸編碼改變或基因表達調(diào)控改變。結(jié)直腸癌(colorectalcancer,CRC)是我國常見的惡性腫瘤之一。在西方國家其發(fā)病率居惡性腫瘤的第2～3位,隨著我國人民生活水平的不斷提高和飲食習(xí)慣的改變,我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率也在逐年升高,已躍居第3～5位。結(jié)直腸癌的預(yù)后與早期診斷密切相關(guān),多數(shù)早期結(jié)直腸癌可以治愈,5年生存率可達90％,而晚期則不足10％,內(nèi)鏡是早期診斷的主要手段。大量研究證實遺傳因素在疾病的易感性中發(fā)揮重要作用，復(fù)雜疾病的遺傳因素己證實存在微效基因劑量效應(yīng)，即微效基因作用的累加才可以形成明顯的表型綜合效應(yīng)。因此，對疾病的多個易感基因及突變位點進行檢測至關(guān)重要，約占整個基因組中遺傳突變的92％。對結(jié)直腸癌的易感基因的研究并不需要對全基因組測序，而只需要對特定的幾個基因進行研究，目標序列捕獲測序的出現(xiàn)，使得對基因組塔頂區(qū)域的研究成為可能。這項技術(shù)首先合成大量能與基因組特定區(qū)域互補結(jié)合的寡核苷酸序列，通過PCR擴增富集目標區(qū)段，然后用高通量測序技術(shù)對這些區(qū)段進行測序。高通量多基因檢測可以一次性檢測多個基因的多種變異類型，同步解析靶向用藥、化療用藥和遺傳風(fēng)險，綜合指導(dǎo)腸癌患者的個體化治療，最大化患者獲益可能。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種測序通量高，靈敏度強，特異性強，基于二代測序平臺技術(shù)，能夠用于檢測游離DNA低頻突變的結(jié)直腸癌易感基因變異文庫構(gòu)建方法。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：一種結(jié)直腸癌易感基因變異文庫構(gòu)建方法，包括以下步驟：A.根據(jù)結(jié)直腸癌相關(guān)基因的變異區(qū)域，設(shè)計能夠檢測這些變異區(qū)域的引物對；B.通過引物設(shè)計軟件得到各引物對的參數(shù)W1、Tm1、W2和Tm2，從而計算得到各引物對的判斷參數(shù)R，計算公式如下：R＝0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]；其中，W1是擴增產(chǎn)物的GC含量，Tm1是擴增產(chǎn)物的退火溫度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火溫度和下游引物退火溫度的平均值，將判斷參數(shù)R的值小于或等于1的引物對，歸為第一組引物組合液，將判斷參數(shù)R的值大于1的引物對，歸為第二組引物組合液；C.將待測樣品DNA抽提純化；D.分別采用第一組引物組合液和第二組引物組合液對純化后的樣品進行初始PCR擴增得到目標片段，然后清除引物，采用第一組引物組合液進行初始PCR擴增時的退火溫度低于采用第二組引物組合液進行初始PCR擴增時的退火溫度；E.對所述目標片段進行接頭連接得到帶接頭片段，然后進行純化；F.采用第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液對純化后的帶接頭片段進行文庫PCR擴增，然后進行純化，得到測序文庫。上述結(jié)直腸癌相關(guān)基因包括APC、BMPR1A、CDH1、CHEK2、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH2、MUTYH、PMS2、C-met、PTEN、SMAD4、STK11、TP53、AXIN2、MLH3、BUB1、CYP1A2、MMP2中的一種或多種。上述引物對所覆蓋的變異區(qū)域包括chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489、chr5：112767236-112767252、chr5：112792503-112792252、chr5：112827956-112827986、chr5：112838873-112838928、chr5：112840654-112840677、chr17:65536321-65536383、chr17:65537388-65537406、chr17:65557986-65558000、chr17:65549523-65549581、chr10:86890071-86890091、chr10:86921583-86921623、chr2:110638014-110639101、chr2:110641182-110641198、chr2:110653457-110653493、chr2:110661715-110661778、chr16：68808708-68808772、chr16：6881687-68818751、chr16：68808708-68808772、chr16：68819374-68819424、chr16：68808708-68808772、chr22：28694055-28694109、chr22：28696891-28696981、chr22：28695721-28695804、ch2:47373517-47373532、ch2:47373921-47373956、ch2:47378954-47378980、chr7:116731688-116731707、chr7:116740046-116740083、chr7:116771552-116771574、chr7:116782003-116782070、chr7:116795915-116795945、hr7:116775003-116775102、chr3:37020368-37020459、chr3:37028815-37028859、chr3:37048982-37049005、chr14:75018901-75018935、chr14:75032111-75032150、chr14:75042427-75042446、chr14:75047713-75047731、chr2:47403286-47403289、chr2:47412447-47412470、chr2:47445572-47445651、chr2:47482870-47482922、chr2:47795926-47795977、chr2:47798612-47798658、chr2:47800355-47800407、chr2:47806534-47806558、chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489、chr2:189791856-189791868、chr2:189854456-189854497、chr2:189877284-189877298、chr2:5982845-5982871、chr2:5991989-5992032、chr2:6005894-6005938、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048、chr18:51054783-51054797、chr18:51058154-51058204、chr18:51067085-51067078、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、ch10:97938720-ch10:94938771、ch10:94942196-ch10:94942266、ch10:94949247-ch10:94949282、ch16:55484117-55484159、ch16:55485699-55485770、ch16:55488596-55488662、ch16:55489754-55489820中的一個或多個。上述步驟F中的混合液是第一組引物組合液和第二組引物組合液按照體積比為1﹕1混合而成。上述引物對的5’端均引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基。上述步驟D中初始PCR擴增時，在反應(yīng)體系中加入二甲基亞砜，加入二甲基亞砜的體積占反應(yīng)體系體積的3％～7％。上述步驟F中文庫PCR擴增時，在反應(yīng)體系中加入甘油，加入甘油的體積占反應(yīng)體系體積的5％～8％。上述步驟E中帶接頭片段的純化是采用磁珠進行純化，所述步驟F中文庫PCR擴增產(chǎn)物的純化是采用磁珠進行純化。上述步驟D中第一組引物混合液在初始PCR擴增時的實驗條件是：99℃，2min，1個循環(huán)；99℃，15s，55℃，20s，72℃，30s15個循環(huán)；上述步驟D中第二組引物組合液在初始PCR擴增時的實驗條件是：99℃，2min，1個循環(huán)；99℃，15s，65℃，20s，72℃，30s，15個循環(huán)；上述步驟F中第一組引物組合液和第一組引物組合液的混合液在文庫擴增的實驗條件是：98℃，2min，1個循環(huán)；99℃，15s，62℃，1min，5個循環(huán)。本發(fā)明具有積極的效果：(1)本發(fā)明提供一種基于二代測序平臺技術(shù)的結(jié)直腸癌易感基因文庫構(gòu)建方法，能夠?qū)崿F(xiàn)樣本濃度低起始量(低于10ng)、高通量、短周期、低成本的建庫。采用本發(fā)明的文庫構(gòu)建方法所得到的文庫進行測序，可以一次檢測20個基因的上百個突變和多態(tài)位點，相對于一代測序突變的成本節(jié)約4000元/樣本。本發(fā)明主要是對腫瘤易感人群，尤其是攜帶結(jié)直腸癌易感基因突變和多態(tài)的人群，結(jié)合測序技術(shù)，通過基因檢測可以確定自身腫瘤易感基因的突變狀態(tài)和多態(tài)性情況，對腫瘤發(fā)生風(fēng)險并進行干預(yù)，真正意義上做到“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”。對結(jié)直腸癌高危人群的診斷和預(yù)防策略提供指南，如進行定期體檢或有效普查以獲得早診早治，大大降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率。(2)本發(fā)明中所用的引物組合物是針對結(jié)直腸癌易感基因突變和多態(tài)位點的特定序列進行設(shè)計，通過5’端引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基，使得各引物之間相互干擾性小。通過分管擴增捕獲所選取變異區(qū)域，相互之間幾乎不干擾。根據(jù)判斷參數(shù)R將引物組合物分管進行擴增，在其他條件相同的條件下，文庫構(gòu)建的成功率由原來的71％提高到92％。本發(fā)明可以用于微量DNA文庫構(gòu)建，降低對檢測樣本的要求，樣本的DNA濃度可以低至1ng～10ng，與其他建庫相比，文庫起始量降低了40ng。(3)本發(fā)明計算的基因突變和多態(tài)與金標準實驗結(jié)果對比，二代測序的敏感度和特異度分別是99.1％和98.9％；(4)本發(fā)明對樣本的DNA濃度要求很低，所以可以適用于非侵入式采集外圍血、口腔粘膜、唾液等，具有方便采樣、可早期檢測與復(fù)發(fā)評估、易定期追蹤、高靈敏度、高精準分辨率及專一性的優(yōu)勢。(5)本發(fā)明對初始擴增和文庫擴增過程中使用的試劑進行優(yōu)化，建立最適合建庫的反應(yīng)條件，與現(xiàn)有的實驗步驟相比，本發(fā)明在文庫初始擴增和文庫擴增，引入一定少量的有機試劑，初始擴增時采用二甲基亞砜、文庫擴增時采用甘油，通過在反應(yīng)步驟中加入有機試劑，文庫構(gòu)建的成功率由原來的92％提高到96％。具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述本
發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。下述實施例中，若非特意表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。主要試劑：所有試劑購買自正規(guī)廠家：MultisourceGenomicDNAMiniprepKit(Axygen)、結(jié)直腸癌易感基因檢測引物第一組引物組合液和第二組引物組合液(上海百力格生物技術(shù)有限公司)、5*IonAmpliSeqTMHiFiMix(Lifetechnologies)、FuPaReagentTM(Lifetechnologies)、AmPureXPReagent磁珠(Lifetechnologies)、IonPGMBeads(Lifetechnologies)、PGMTemplateOT2Solutions(Lifetechnologies)、PlatinumPCRSuperMixHighFidelity(Lifetechnologies)、LibraryAmplificationPrimerMix(Lifetechnologies)等。上機模板準備和上機過程中用到的試劑和耗材與IonTorrent二代測序平臺相配套，包括PGMTemplateOT2kit和Ion314chip等部分。本方法實驗前需要新鮮配制的試劑：75％乙醇(100％乙醇與無核酸酶水按3:1比例配制)。主要儀器：IonTorrentPGM測序儀、3.0熒光定量儀、高速離心機、水浴鍋、漩渦震蕩儀、冰箱、滅菌鍋、磁力架、移液槍、PCR儀、震蕩儀等。本實施例的結(jié)直腸癌易感基因變異文庫構(gòu)建方法，包括以下步驟：A.根據(jù)結(jié)直腸癌相關(guān)基因的變異區(qū)域，設(shè)計能夠檢測這些變異區(qū)域的引物對；B.根據(jù)引物和產(chǎn)物的GC含量、Tm值，將引物對分成兩組，即第一組引物組合液和第二組引物組合液；C.將待測樣品DNA抽提純化；D.采用第一組引物組合液和第二組引物組合液對純化后的樣品分別進行初始PCR擴增，得到目標片段，然后清除引物；E.對所述目標片段進行接頭連接得到帶接頭片段，然后采用磁珠進行純化；F.采用第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液對純化后的帶接頭片段進行文庫PCR擴增，然后采用磁珠進行純化，得到測序文庫。整個過程中，也可以在任何步驟按照要求通過切膠回收或磁珠片段選擇的方法對DNA片段分子大小進行選擇，最終獲得所需大小DNA片段的文庫分子，并且在接頭連接中引入特征性序列標簽，用于測序中不同文庫的區(qū)分。與陰性樣品，質(zhì)控品一起進行大規(guī)模平行測序，儀器獲得的結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析，得出樣本中含有的SNP位點信息。所述陰性樣本為正常人基因組DNA，所述的質(zhì)控品為加入1％的controlparticles,是一種商品化試劑，包含在上機測序的試劑盒PGMSequencingOT2kit中，作為上機測序?qū)嶒灥膬?nèi)參，對測序情況進行評估和質(zhì)控，如果測序結(jié)果中不包含1％的controlparticles結(jié)果，說明上機實驗失敗，結(jié)果不可靠。一、引物設(shè)計。根據(jù)結(jié)直腸癌相關(guān)基因的變異區(qū)域，設(shè)計能夠檢測這些變異區(qū)域的引物對。本發(fā)明中，結(jié)直腸癌相關(guān)基因包括但不限于下列基因：表1結(jié)直腸癌易感基因信息表序號基因名稱DNALocusmRNALocus1APCNG_008481.4NM_0000382BMPR1ANG_009362.1NM_0043293CDH1NG_008021.1NM_0013171844CHEK2NG_008150.1NM_0010057355EPCAMNG_012352.2NM_0023546MLH1NG_007109.2NM_0002497MSH2NG_007110.2NM_0002518MSH6NG_007111.1NM_0001799MUTYHNG_008189.1NM_00104817110PMS2NG_008466.1NM_00053511C-metNG_008996.1NM_00024512PTENNG_007466.2NM_00031413SMAD4NG_013013.2NM_00535914STK11NG_007460.2NM_00045515TP53NG_017013.2NM_00054616AXIN2NG_012142.1NM_00465517MLH3NG_008649.1NM_00104010818BUB1NG_012048.1NM_00127861619CYP1A2NG_008385.1NM_00077120MMP2NG_008989.1NM_001127891本實施例根據(jù)上述各結(jié)直腸癌相關(guān)基因的變異區(qū)域，設(shè)計用于檢測這些結(jié)直腸癌易感基因的變異區(qū)域是否存在變異的引物對。變異區(qū)域包括各基因的外顯子區(qū)域，或者與外顯子相連的上下游30bp的內(nèi)含子區(qū)域，或者與結(jié)直腸癌相關(guān)的其他突變和多態(tài)區(qū)域。引物對能夠覆蓋表1中所有基因的需要檢測的變異區(qū)域。所覆蓋的區(qū)域如下：chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489、chr5：112767236-112767252、chr5：112792503-112792252、chr5：112827956-112827986、chr5：112838873-112838928、chr5：112840654-112840677、chr17:65536321-65536383、chr17:65537388-65537406、chr17:65557986-65558000、chr17:65549523-65549581、chr10:86890071-86890091、chr10:86921583-86921623、chr2:110638014-110639101、chr2:110641182-110641198、chr2:110653457-110653493、chr2:110661715-110661778、chr16：68808708-68808772、chr16：6881687-68818751、chr16：68808708-68808772、chr16：68819374-68819424、chr16：68808708-68808772、chr22：28694055-28694109、chr22：28696891-28696981、chr22：28695721-28695804、ch2:47373517-47373532、ch2:47373921-47373956、ch2:47378954-47378980、chr7:116731688-116731707、chr7:116740046-116740083、chr7:116771552-116771574、chr7:116782003-116782070、chr7:116795915-116795945、hr7:116775003-116775102、chr3:37020368-37020459、chr3:37028815-37028859、chr3:37048982-37049005、chr14:75018901-75018935、chr14:75032111-75032150、chr14:75042427-75042446、chr14:75047713-75047731、chr2:47403286-47403289、chr2:47412447-47412470、chr2:47445572-47445651、chr2:47482870-47482922、chr2:47795926-47795977、chr2:47798612-47798658、chr2:47800355-47800407、chr2:47806534-47806558、chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489、chr2:189791856-189791868、chr2:189854456-189854497、chr2:189877284-189877298、chr2:5982845-5982871、chr2:5991989-5992032、chr2:6005894-6005938、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048、chr18:51054783-51054797、chr18:51058154-51058204、chr18:51067085-51067078、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、ch10:97938720-ch10:94938771、ch10:94942196-ch10:94942266、ch10:94949247-ch10:94949282、ch16:55484117-55484159、ch16:55485699-55485770、ch16:55488596-55488662、ch16:55489754-55489820。本實施例中的引物對的設(shè)計和制備采用現(xiàn)有的常規(guī)方法。本實施例中的引物對包括特異性上游引物和特異性下游引物，上游引物和下游引物是根據(jù)所覆蓋的變異區(qū)域在參考基因組的起始和終止位置設(shè)計的。引物均由母液稀釋而成，母液由百力格生物技術(shù)有限公司合成的干粉稀釋而成，引物的最終濃度為100nM。引物純度應(yīng)達到PAGE或者HPLC級，不含雜帶。設(shè)計時所用核苷酸序列均來自NCBI數(shù)據(jù)庫公布的基因序列，引物擴增后的產(chǎn)物長度主要集中在100bp-500bp之間。引物的核苷酸序列可為任意的已知序列，其序列自身不形成發(fā)卡二級結(jié)構(gòu)，且G、C含量占堿基數(shù)量總和的30％～70％，引物序列選擇長度18bp～25bp的核苷酸序列。使用專門的多重引物設(shè)計軟件包(如DNAsoftwares的VisualOMP,MultiPLX，ABI的PrimerExpress等)來設(shè)計引物，為了減少在核酸擴增過程中假象例如引物二聚體的形成，引物對經(jīng)過預(yù)測在擴增過程中顯示最小的與引物中其他引物的相互作用、各個引物對的Tm等參數(shù)盡量接近、不要存在嚴重的二級結(jié)構(gòu)比如發(fā)夾、dimers等。通過使用不同的軟件，綜合評價，將引物盡可能設(shè)計為靶特異性或者擴增子特異性的，并且引物通常被分組為子集以使引物間相互作用、引物二聚體形成和超級擴增子減少至最低程度。PCR的延伸是從引物3’端開始的，并決定著PCR產(chǎn)物的特異性，而5’端則限定PCR產(chǎn)物的長度。5’端修飾后不但不影響正常的PCR反應(yīng)，而且修飾后的引物能夠更穩(wěn)定地與模板結(jié)合，對于PCR產(chǎn)物的分析與進一步操作有很大的方便，在引物上進行基團修飾，引物所攜帶的修飾基團隔離開其他引物，使得同一反應(yīng)體系中，完成更多引物的同時擴增。引物5’端修飾包括磷酸化修飾、氨基修飾和引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基，優(yōu)選地為5’端引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基。本實施例中設(shè)計的引物對是經(jīng)過反復(fù)實驗篩選驗證得到的最佳組合引物對，能夠?qū)崿F(xiàn)高效、快速、微量建庫，保持了與現(xiàn)有建庫方法的文庫測序流程的兼容性，靈活方便，可以用于IonProton測序平臺，適于構(gòu)建IonProton的文庫，構(gòu)建文庫可以直接上機測序。本實施例中的引物對可以直接應(yīng)用到不同的第二代測序平臺，包括但不限于由Illumina，LifeTechnologies(ABI)，Roche，HelicosBiotechnologies，PacificBiosciences這些公司制造的儀器，同樣也適用于其它廠商生產(chǎn)的測序儀。二、引物對分組。由于擴增的模板是固定的序列模板，設(shè)計引物時不可避免會有GC含量和Tm值不一致的引物對，為了順利構(gòu)建測序文庫，這些差別較大的引物對在實驗的過程中對實驗條件和樣本的要求會更加嚴格，并且實驗結(jié)果不一定立項。退火溫度是引物和模板結(jié)合時候的溫度參數(shù)，即當(dāng)50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度，它是影響PCR特異性的比較重要因素，為了確定較適合的退火溫度，根據(jù)引物和產(chǎn)物的GC含量、退火溫度等相關(guān)參數(shù)計算的判斷參數(shù)R，從而更加方便準確地將設(shè)計合成、稀釋后引物分成兩組。判斷參數(shù)R的計算公式如下：R＝0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]。其中，W1是擴增產(chǎn)物的GC含量，Tm1是擴增產(chǎn)物的退火溫度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火溫度和下游引物退火溫度的平均值。W1、W2、Tm1、Tm2是設(shè)計引物核苷酸序列時，通過多重引物設(shè)計軟件包，自動生成的參數(shù)。通過軟件包生成的參數(shù)代入，計算公式得到所有引物對的判斷參數(shù)R(R一般保留5位有效數(shù)字)，其中判斷參數(shù)R的值小于或等于1的引物對，歸為第一組引物混合液，判斷參數(shù)R的值大于1的引物對，歸為第二組引物混合液。以基因MUTYH為例，在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到該基因的DNA序列(NG_008189.1)，找到DNA序列中檢測覆蓋區(qū)域：chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489；根據(jù)軟件PrimerExpress設(shè)計覆蓋目的區(qū)域的引物對，引物對盡可能設(shè)計為靶特異性并且與其他引物不相互干擾，設(shè)計后的引物核苷酸序列如表2所示。表2MUTYH引物序列表表2中的引物由百力格生物技術(shù)有限公司合成，合成引物的5’端引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基。根據(jù)判斷參數(shù)R的取值，序號為1至7的引物對均歸為第二組引物組合液。其他結(jié)直腸癌相關(guān)基因的引物設(shè)計和分組參照MUTYH基因，最終將設(shè)計檢測結(jié)直腸癌相關(guān)基因變異區(qū)域的所有引物對分組，引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基的引物對分別合成稀釋后，按照分組的結(jié)果配置成第一組引物對組合液和第二組引物組合液。第一組引物對組合液和第二組引物組合液在初始擴增分別進行初始擴增反應(yīng)，能夠增加每個反應(yīng)擴增產(chǎn)物的總體產(chǎn)物率，然后在引物清除步驟再將擴增產(chǎn)物等量混合在一起進行實驗。三、待測樣品DNA抽提純化。本實施例中檢測5例攜帶結(jié)直腸癌易感基因突變和多態(tài)位點的樣本和5例不攜帶結(jié)直腸癌易感基因突變和突變位點的樣本，這10例樣本的相關(guān)位點已經(jīng)經(jīng)過ARMS驗證。本發(fā)明中的檢測樣本為能提取核酸的任意形式的樣品，較佳地為口腔粘膜，包括但不限于：全血、血清、血漿和組織樣品；組織樣品包括但不限于：石蠟包埋組織、新鮮組織和冰凍切片。3.1樣本DNA抽提采用北京索萊寶口腔、咽拭子DNA提取試劑盒(50T，貨號：D3300)提取口腔粘膜的樣本DNA，，具體的操作參見試劑盒產(chǎn)品說明書。抽提結(jié)束后用Thermo-Fisher核酸蛋白定量儀(NanoDrop2000)測定樣本濃度。3.2DNA純化1)取5ngDNA，加入Nuclease-freeWater至40μL；2)加入1.5倍體積(60μL)Ampurebeads，室溫放置5min，再放置于磁力架上約5min，至澄清；3)棄上清，用75％的酒精(200μL，現(xiàn)配現(xiàn)用)洗滌2次，晾干(不要過干)；4)用25μLNuclease-freeWater溶解，Qubit檢測濃度。3.3組織樣本DNA濃度測定采用3.0對抽提后的DNA濃度測定：1)向樣本管加入1ulQubitdsDNAHSReagent和199ulQubitdsDNAHSbuffer,漩渦混勻4s；2)向已添加工作液的樣品管內(nèi)吸棄1ul工作液，加入1ul的DNA樣本，漩渦混勻4s，每管的最終體積是200ul；3)所有管在室溫避光孵育2分鐘；4)在3.0主屏上點擊“DNA”鍵，然后選擇dsDNAHighSensitivity分析模式；5)把樣本管放入3.0中，蓋上蓋子，點擊read；6)選擇CalculateInitial初始濃度，然后選擇VolumeofSampleUsed:1ul，此時顯示的結(jié)果為樣本初始濃度，單位ng/ul；7)讀取下一個樣本：取出Qubit3.0熒光光度計中樣本。四、獲得目標片段。分別采用第一組引物組合液和第二組引物組合液對純化后的樣品進行初始PCR擴增得到目標片段，然后清除引物。4.1初始PCR擴增由于初始PCR擴增是多重PCR反應(yīng)，每一個引物對在擴增反應(yīng)中與另外的引物競爭有限量的dNTPs、聚合酶和其他試劑，因此存在對改進的方法和組合物需要，以允許選擇性擴增一群核酸分子內(nèi)的多個靶核酸分子，同時避免非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體的形成，或者將非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體的程度降至最低，達到更高效、低濃度檢測。本發(fā)明在反應(yīng)體系中加入有機試劑，有機試劑包括甘油、橄欖油、DMSO(二甲基亞砜)，優(yōu)選地，在初始擴增加入的有機試劑為DMSO(二甲基亞砜)。采用本實施例的第一組引物組合液和第二組引物組合液，若樣本的濃度大于10ng，可以將第一組引物組合液和第二組引物組合液混合在一起對樣本進行初始PCR擴增。若樣本的濃度小于10ng，必須分別采用第一組引物組合液和第二組引物組合液進行初始PCR擴增，以保證文庫的質(zhì)量，下面以樣本的濃度小于10ng為例。按照表3中的初始PCR擴增反應(yīng)體系，進行試劑配比。表3初始PCR擴增反應(yīng)體系成分反應(yīng)體系分為兩管，一管反應(yīng)體系采用第一組引物組合液，另一管反應(yīng)體系采用第二組引物組合液，其他成分相同。在反應(yīng)體系中加入少量的二甲基亞砜(DMSO)，能夠降低熔解溫度，有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)，提高引物特異性，有效促進GC含量高達52％～73％模板的擴增，使用低濃度的引物，少量循環(huán)，使得引物間互不干擾。分兩管分別進行初始PCR擴增反應(yīng)得到目標片段(目標區(qū)域測序目的片段)，采用第一組引物組合液的擴增反應(yīng)程序如表4所示，采用第二組引物組合液的擴增反應(yīng)程序如表5所示。表4采用第一組引物組合液的擴增反應(yīng)程序表5采用第二組引物組合液的擴增反應(yīng)程序PCR反應(yīng)條件：特異引物與靶序列退火延伸，選擇較高的復(fù)性溫度以減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,確保PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間略微延長,以使引物與模板之間完全結(jié)合，但是延伸時間不宜過長,否則會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。4.2引物清除在兩管擴增反應(yīng)分別獲得目標片段后，不同的擴增目標區(qū)域產(chǎn)物再混合在同一個反應(yīng)體系中，進行文庫構(gòu)建步驟，降低了樣品檢測的要求，提高測序反應(yīng)的效率。將兩管初始PCR擴增的產(chǎn)物等體積混合成一管，取20ul的PCR產(chǎn)物混合物，加入2ulFuPaReagent，此時總體積為22μL，漩渦充分混勻，瞬間離心2秒，根據(jù)表6的程序清除引物。表6引物清除反應(yīng)程序PCR產(chǎn)物可立即使用或保存于-20℃冰箱。五、獲得接頭片段。對目標片段進行接頭連接得到帶接頭片段，然后采用磁珠進行純化。5.1接頭反應(yīng)拿出SwitchSolution，室溫混勻，將清除引物后的目標片段置于樣品管中，漩渦充分混勻，瞬間離心2秒,取2ul加入如表7所示的接頭反應(yīng)體系中。表7接頭反應(yīng)體系成分表將上述反應(yīng)體系放入PCR儀內(nèi)，進行引物清除，反應(yīng)程序如表8所示。表8接頭反應(yīng)程序表Barcode為合成的單鏈，其中所述隨機序列有6～12個堿基隨機組成且位于靠近單鏈游離DNA3’端的一側(cè)，所述Adaptor序列為任意的已知序列且位于遠離單鏈游離DNA3’端的一側(cè)，兩種試劑均由LifeTechnologies提供。通過連接反應(yīng)，獲得各連接唯一標簽序列的核酸樣本，樣品可立即使用或保存于-20℃冰箱。5.2純化，采用AmpureXPReagent磁珠：1)向樣品管中加入45μL(1.5倍樣品體積)AmpureXPReagent，混勻，室溫孵育5min；2)將樣品管放在磁力架上，靜置2min，至管內(nèi)溶液完全澄清；3)棄上清，保持離心管在磁力架上，溫和添加150μL70％酒精(現(xiàn)配現(xiàn)用)洗滌beads(輕輕旋轉(zhuǎn)樣品管，充分洗滌)；4)重復(fù)上述步驟，充分去除酒精，晾干(磁力架上晾干，不要過干)。5.3測定樣本庫的濃度1)向樣本管加入1ulQubitdsDNAHSReagent和199ulQubitdsDNAHSbuffer,漩渦混勻4s；2)向已添加工作液的樣品管內(nèi)吸棄3ul工作液，加入3ul的DNA樣品，漩渦混勻4s，每管的最終體積是200ul；3)所有管在室溫避光孵育2分鐘；4)在3.0主屏上點擊“DNA”鍵，然后選擇dsDNAHighSensitivity分析模式；5)把樣本管放入3.0中，蓋上蓋子，點擊read；6)選擇CalculateInitial初始濃度，然后選擇VolumeofSampleUsed:3ul，此時顯示的結(jié)果為樣本初始濃度，單位ng/ul；7)讀取下一個樣品：取出Qubit3.0熒光光度計中樣品，放入新的樣品，按“ReadNextSsmple”；8)重復(fù)樣本讀數(shù)，直到所有樣品讀完。六、文庫擴增和純化6.1文庫擴增由于文庫構(gòu)建是多重PCR反應(yīng)，每一個引物對在擴增反應(yīng)中與另外的引物競爭有限量的dNTPs、聚合酶和其他試劑，因此存在對改進的方法和組合物需要，以允許選擇性擴增一群核酸分子內(nèi)的多個靶核酸分子，同時避免非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體的形成，或者將非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體的程度降至最低，達到更高效、低濃度檢測。本發(fā)明在反應(yīng)體系中加入有機試劑，有機試劑包括甘油、橄欖油、DMSO(二甲基亞砜)，優(yōu)選地，在文庫擴增加入的有機試劑為甘油。向純化后風(fēng)干的樣品中加入50μLPlatinumPCRSuperMixHighFidelity(黑色蓋)、3.5ul甘油和2ul的第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液,重懸磁珠混勻，磁力架上放置3min，取上清至PCR管中，漩渦混勻進行PCR擴增，擴增反應(yīng)程序如表9所示。表9文庫擴增反應(yīng)程序表甘油能夠提高文庫產(chǎn)量，有利于擴增后上機測序，擴增后的PCR產(chǎn)物可立即使用或保存于-20℃冰箱。6.2文庫純化文庫進行磁珠純化，采用AMPureXPReagent磁珠：1)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管內(nèi)，加入25ul(0.5倍樣品體積)AMPureXPReagent充分吹打混勻，室溫孵育5min；2)將樣本放置磁力架上，等待5min至管內(nèi)溶液完全澄清；4)小心吸取上清液并轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管內(nèi)；5)向上述步驟的離心管中加入60ul(1.2倍原始樣品體積)的AMPureXPReagent磁珠，吹打混勻，室溫孵育5min；6)將樣本管放在磁力架上靜止3min或至溶液澄清，棄上清；7)保持離心管在磁力架上，溫和添加150ul新鮮配制的75％酒精溶液洗滌beads(輕輕轉(zhuǎn)動樣品管，充分洗滌)，旋轉(zhuǎn)離心管，小心去除酒精；8)重復(fù)上述步驟清洗一次，充分去除酒精，晾干(磁力架上晾干，不要過干)，室溫風(fēng)干磁珠5min，不要過度干燥；9)將樣品管從磁力架上取下，加入50μLLowTE溶液到樣本管內(nèi)，漩渦混勻；10)將樣本管放置在磁力架上，靜止2min，將洗脫的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管內(nèi)，用Qubit檢測樣品濃度；6.3用3.0測定樣本庫的濃度1)向樣本管加入1ulQubitdsDNAHSReagent和199ulQubitdsDNAHSbuffer,漩渦混勻4s；2)向已添加工作液的樣品管內(nèi)吸棄3ul工作液，加入3ul的DNA樣品，漩渦混勻4s，每管的最終體積是200ul；3)所有管在室溫避光孵育2分鐘；4)在3.0主屏上點擊“DNA”鍵，然后選擇dsDNAHighSensitivity分析模式；5)把樣本管放入3.0中，蓋上蓋子，點擊read；6)選擇CalculateInitial初始濃度，然后選擇VolumeofSampleUsed:3ul，此時顯示的結(jié)果為樣本初始濃度，單位ng/ul；7)讀取下一個樣品：取出Qubit3.0熒光光度計中樣品，放入新的樣品，按“ReadNextSample”；8)重復(fù)樣本讀數(shù)，直到所有樣品讀完；純化后的文庫可直接通過IonTorrent平臺進行上機測序，測序結(jié)束以后，對獲得的測序數(shù)據(jù)進行分析，通過比對設(shè)計的引物和位點信息，篩選出結(jié)直腸癌相關(guān)基因上的突變和多態(tài)位點。本發(fā)明的檢測結(jié)果與臨床ARMS法檢測結(jié)果一致，測序反應(yīng)樣本的數(shù)量分布均勻。本發(fā)明對結(jié)直腸癌易感基因變異具有檢測通量高、特異性強、不易污染、安全性高的優(yōu)點，檢測結(jié)果具有較好的準確性和重復(fù)性，對結(jié)直腸癌易感人群提供預(yù)防指南。。本發(fā)明實施方式中，所述的基因變異存在于結(jié)直腸癌但不僅限于如表1列出的結(jié)直腸癌相關(guān)基因，也存在常見胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌等相關(guān)基因。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本發(fā)明所限定的范圍。發(fā)明人經(jīng)深入研究和篩選得到一組可以用于IonProton的文庫，構(gòu)建的文庫可以直接可以上機測序。為了降低對組織樣本濃度和質(zhì)量的要求，提高測序文庫構(gòu)建的成功率，本發(fā)明進行了以下嘗試1)采用1ng、3ng、5ng、7ng、9ng的口腔粘膜抽提DNA樣本，根據(jù)常用的退火溫度55℃進行初始濃度擴增，對文庫擴增使用60℃退火溫度，測得文庫的濃度均低于0.5ng/ul。對初始擴增和文庫擴增的退火溫度進行50℃～65℃的梯度實驗，文庫的成功率仍然很低；2)根據(jù)軟件設(shè)計引物參數(shù)對引物對進行分組，分組以50％為界，上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值小于等于50％為第一組引物組合物，上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值大于50％為第二組引物組合物，第一組引物組合物采用的50℃退火溫度進行初始濃度擴增，文庫擴增使用60℃退火溫度，第二組引物組合物采用的60℃退火溫度進行初始濃度擴增，文庫擴增使用60℃退火溫度，相對于初始擴增不分管擴增，文庫的成功率雖然有所提高，但是低于50％；3)退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素，良好的退火溫度，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜，退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成，還有模板序列組成和長度。本發(fā)明綜合考慮了引物和產(chǎn)物的GC含量和退火溫度參數(shù)對PCR反應(yīng)的影響，設(shè)計了分管判斷參數(shù)R，根據(jù)判斷參數(shù)R對引物對分組，在初始擴增和文庫擴增的退火溫度進行50℃～65℃的梯度試驗，選擇文庫成功率較高的退火溫度，最終優(yōu)選第一組引物組合液初始擴增的退火溫度為55℃，第二組引物組合液初始擴增的退火溫度為65℃，第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液在文庫擴增的退火溫度為62℃，文庫構(gòu)建成功率大幅度提升，特別適用于文庫起始量低至1ng～10ng的情況。上述實施例僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3