本發(fā)明涉及生物細胞領(lǐng)域，涉及一種新型細胞培養(yǎng)液制備方法。

背景技術(shù)：

細胞培養(yǎng)技術(shù)指的是細胞在體外條件下的生長，在培養(yǎng)的過程中細胞不再形成組織。培養(yǎng)物是單個細胞或細胞群。細胞在培養(yǎng)時都要生活在人工環(huán)境中，由于環(huán)境的改變，細胞的移動或受一些其他因素的影響，培養(yǎng)時間加長，傳代導(dǎo)致細胞出現(xiàn)單一化型。對細胞培養(yǎng)液的研究迫在眉睫。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種解決或部分解決上述問題的一種新型細胞液制備方法。

為達到上述技術(shù)方案的效果，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種新型細胞液制備方法，其特征在于，包含以下步驟：

1)首先，進行100mg/mL Amp的配制：稱量50gAmp置于500mL容量瓶中，其后加入80mL滅菌水，充分混合溶解后，定容至500mL；用0.1μm厚度的濾膜過濾其中的除菌，用10個50ml的小瓶分裝后于在-20℃的恒溫下培養(yǎng)1至2個小時；

2)氨芐青霉素陽性液體培養(yǎng)基的配制；取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g溶解于1000mL水中，進行分裝成20個50ml的小瓶，然后在121℃的高溫下滅菌20分鐘；待溫度降至40℃以下時，按照6μL/mL，加入氨卞青霉素貯存液，使其終濃度達到60μg/mL，即制備完成氨芐青霉素陽性液體培養(yǎng)基；

3)氨芐青霉素陽性固體培養(yǎng)基的配制：先按照上一步的步驟配制氨芐青霉素陽性液體培養(yǎng)基，然后在其中加入濃度為2.5g/100mL的瓊脂粉，進行高壓滅菌30分鐘，然后待溫度降至40℃以下時，按照6μL/mL加入氨芐青霉素貯存液，使終濃度達到60μg/mL，即制備完成氨芐青霉素陽性固體培養(yǎng)基；

4)將氨芐青霉素陽性液體培養(yǎng)基與氨芐青霉素陽性固體培養(yǎng)基進行混合，將第1)步制備所得100mg/mL Amp的加入，再溶解于180mL去離子水中，定容于500mL，用0.1μm厚度的濾膜過濾除菌，保存于-20℃待用。

本發(fā)明的有益成果是：本發(fā)明的細胞培養(yǎng)液制備方法對細胞培養(yǎng)的劃分更加細致，培養(yǎng)參數(shù)更加嚴謹，因此本方法的實用性更強。

具體實施方式

為了使本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行詳細的說明。應(yīng)當說明的是，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明，能實現(xiàn)同樣功能的產(chǎn)品屬于等同替換和改進，均包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。具體方法如下：

實施例1：細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：

1、潛伏期(Latent Phase)：細胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細胞貼附慢，可長達10～24小時或更多；連續(xù)細胞系和惡性細胞系快，10～30分鐘即可貼附。細胞貼附現(xiàn)象是一個非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。

另外在貼附過程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素(Fibronectin)，又稱LETS(Larger External Transformation Substance)，細胞表面蛋白(Cell Surface Protein：CSP)等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細胞膜的表面(如CSP)，有的則來自培養(yǎng)基中的血清(LETS)。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。

細胞貼附于支持物后，除先經(jīng)過前述延展過程變成極性細胞，還要經(jīng)過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時，可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約24～96小時或更長，連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24小時；細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志細胞已進入指數(shù)增生期。

2、指數(shù)增生期(Logarithmic growth Phase)：這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂(Mitotic Index：MI)表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)受細胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1％～0.5％，初代細胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3％～5％。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細胞分裂指數(shù)有很大影響。

指數(shù)增生期是細胞一代中活力最好的時期，因此是進行各種實驗最好的和最主要的階段。在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制(Contact Inhibition)。而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動和增殖，導(dǎo)致細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積(Piledup)。細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制(Density Inhibition)，導(dǎo)致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念，不應(yīng)混淆。

3、停滯期(Stagnate Phase)：細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期(Plateau)。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚(已有中毒跡象)能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復(fù)后，才能再用。結(jié)果反而耽誤了時間，這是在實驗中應(yīng)特別注意的。

實施例2：第一次細胞培養(yǎng)，是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。有幾方面含義：

培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿(瓶)中就不在分割，任其生長繁殖；

原代培養(yǎng)中的“代”并非細胞的“代”數(shù)，因為培養(yǎng)過程中細胞經(jīng)多次分裂已經(jīng)產(chǎn)生多代子細胞；

原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液，也不等于不更換培養(yǎng)器皿。正常細胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞才能無限生長下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細胞。目前世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養(yǎng)而成。此細胞系一直延用至今。原代培養(yǎng)的細胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細胞的生長就會出現(xiàn)停滯，大部分細胞衰老死亡。但是有極少數(shù)的細胞能夠度過“危機”而繼續(xù)傳下去，這些存活的細胞一般能夠傳到40～50代，這種傳代細胞叫做細胞株。細胞株的遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變,在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。當細胞株傳至50代以后又會出現(xiàn)“危機”，不能再傳下去。但是有部分細胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，并且?guī)в邪┳兊奶攸c，有可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去，這種傳代細胞稱為細胞系。

原代培養(yǎng)是建立各種細胞系(株)必經(jīng)的階段，其是否成功與組織污染與否、供體年齡、培養(yǎng)技術(shù)和方法、適宜培養(yǎng)基的選擇等多種因素有關(guān)。由于原代培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)化性極小，對病毒敏感性好，因此適應(yīng)制備疫苗等生物制品；但也存在有潛在外源因子、不能事先檢查標本、且受供體年齡健康狀況的影響而導(dǎo)致批間差異大等缺陷。目前常用的原代細胞培養(yǎng)有雞胚成纖維細胞及豬腎、猴腎、地鼠腎等原代細胞。

原代培養(yǎng)的基本過程包括取材、培養(yǎng)材料的制備、接種、加培養(yǎng)液、置培養(yǎng)條件下培養(yǎng)等步驟，在所有的操作過程中，都必須保持培養(yǎng)物及生長環(huán)境的無菌。多數(shù)情況下，分散的細胞若屬于貼壁依賴型細胞，就能黏附、鋪展于培養(yǎng)器皿和載體表面生長而形成細胞單層，這種培養(yǎng)方式稱為單層細胞培養(yǎng)(monolayer culture)，又叫貼壁培養(yǎng)(adherent culture)。少數(shù)情況下，培養(yǎng)的細胞沒有貼壁依賴性，可通過專門設(shè)備使細胞始終處于懸狀態(tài)而在體外生長，這種形式稱為懸浮培養(yǎng)(suspension culture)。如何讓接種的細胞盡快貼壁，是決定培養(yǎng)成功的關(guān)鍵步驟：可降低接種后培養(yǎng)液對細胞的浮力，如先少補加少量培養(yǎng)液，待細胞貼壁后再補足營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；注意適當?shù)募毎臃N密度，一般105個/ml左右。

以上所述僅為本發(fā)明之較佳實施例，并非用以限定本發(fā)明的權(quán)利要求保護范圍。同時以上說明，對于相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)可以理解及實施，因此其他基于本發(fā)明所揭示內(nèi)容所完成的等同改變，均應(yīng)包含在本權(quán)利要求書的涵蓋范圍內(nèi)。

本發(fā)明的有益成果是：本發(fā)明的細胞培養(yǎng)液制備方法對細胞培養(yǎng)的劃分更加細致，培養(yǎng)參數(shù)更加嚴謹，因此本方法的實用性更強。