本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無乳鏈球菌型特異性抗血清的制備方法。
背景技術(shù)：
無乳鏈球菌(S.agalactiae)是引起奶牛乳房炎的主要病原體之一，具有高傳染性，常存在于奶牛的皮膚、乳頭及乳房內(nèi)，通過擠乳人員的手或擠乳機械以及蠅類的機械攜帶而傳播，附著在乳腺管壁并將其破壞，引起慢性乳房炎，潛伏期可達數(shù)周或數(shù)月，不易發(fā)現(xiàn)。同時，無乳鏈球菌還是造成孕婦產(chǎn)褥期膿毒血癥和新生兒腦膜炎的一個重要原因。它寄生在產(chǎn)婦生殖道，可致嬰兒感染的發(fā)生。也可引起產(chǎn)后感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎、皮膚和軟組織感染及骨髓炎。
無乳鏈球菌以莢膜分型，共有10個血清型(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ型)，各個血清型之間無交叉保護力。血清型的鑒定對于無乳鏈球菌性奶牛乳房炎流行病學(xué)調(diào)查和疫苗的研制至關(guān)重要。但目前國內(nèi)并沒有商品化的無乳鏈球菌型特異性抗血清供應(yīng)，雖然國外有B組鏈球菌的陽性參考血清，但多分離自人，且價格昂貴、供貨周期期長，遠遠不能滿足需要。
莢膜分型血清的制備的關(guān)鍵在于保證莢膜的完整性，否則抗體滴度會顯著不同。因此，菌液培養(yǎng)的方法也尤為重要。傳統(tǒng)制備分型血清的方法為采用無佐劑法耳靜脈免疫家兔制備，其產(chǎn)生的抗體低，不能滿足規(guī)?；a(chǎn)的要求；近年來，有報道采用弗氏佐劑免疫家兔制備分型血清，但其價格較高，副反應(yīng)大，易造成兔子背部出現(xiàn)破潰等副反應(yīng)，且使用活菌攻毒的方法制備陽性血清，易造成免疫動物發(fā)病死亡，且短期多次免疫注射，需要不斷制備新鮮的菌液，費時費力。
因此，有必要建立一種安全、實用、產(chǎn)生效價高的制備無乳鏈球菌型特異性抗血清的制備方法，以解決目前國內(nèi)缺少分型血清的問題。目前尚未見有采用無乳鏈球菌滅活疫苗制備型特異性抗血清的報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種添加新型佐劑制備無乳鏈球菌型特異性抗血清的制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏相關(guān)方法的技術(shù)問題。
本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是無乳鏈球菌型特異性抗血清的制備抗體效價較低和需要活菌多次注射的問題。
為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種無乳鏈球菌型特異性抗血清的制備方法，包括以下步驟：
1)制備無乳鏈球菌菌液；
2)取步驟1)所得的菌液分別制備無乳鏈球菌滅活疫苗和無乳鏈球菌滅活抗原；
3)取步驟2)所述疫苗和抗原對家兔進行免疫接種；
4)從步驟3)免疫接種后的家兔體內(nèi)收獲血清。
作為優(yōu)選，步驟3)所述的家兔是2.0～4.0kg清潔級，日本大耳白兔或新西蘭大白兔。
作為優(yōu)選，步驟3)所述的免疫接種包括以下步驟：
A)基礎(chǔ)免疫：取步驟2)制備的無乳鏈球菌滅活疫苗，每次以2～4ml的劑量皮下多點注射2次，2次的時間間隔為10～15d；
B)滅活疫苗強化免疫：步驟A)完成7～10d后，取步驟2)制備的無乳鏈球菌滅活疫苗皮下和腿部肌肉多點注射2次，第1次劑量為4～6ml，第2次劑量為第1次劑量的1～2倍，2次的時間間隔為5～7d；
C)滅活抗原強化免疫：步驟B)完成5～8d后，取步驟2)制備的無乳鏈球菌滅活抗原皮下注射1～2次，第1次劑量為10～20ml，第2次劑量為第1次劑量的1～2倍。
作為優(yōu)選，步驟A)中所述無乳鏈球菌滅活疫苗中活菌濃度為0.5×1010～1×1010CFU。
作為優(yōu)選，步驟4)中所述血清的抗體效價不低于1:320。
作為優(yōu)選，步驟1)所述菌液是通過以下方法制備的：將凍干菌種用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)12h～18h后，以劃線方法接種至含5％～10％無菌綿羊脫纖血的血瓊脂平板上純化培養(yǎng)，而后挑去單菌落接種于含有2％～10％新生牛血清、0～8g/L葡萄糖的THB肉湯培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3～5次，每次培養(yǎng)的時間為4～8小時。
作為優(yōu)選，步驟2)所述的無乳鏈球菌滅活抗原是通過以下方法制備的：取步驟1)所得的無乳鏈球菌菌液，濃縮后于56℃熱滅活30min。
作為優(yōu)選，所述濃縮是通過離心方式實現(xiàn)的，離心轉(zhuǎn)速為4000～8000rpm，離心時間為15～30min。
作為優(yōu)選，所述濃縮是通過超濾方式實現(xiàn)的，濾膜的孔徑為0.22μm，濃縮倍數(shù)為5～20倍體積。
作為優(yōu)選，步驟2)所述無乳鏈球菌滅活疫苗是通過以下方法制備的：取步驟1)所得的無乳鏈球菌菌液，以4000～8000rpm的轉(zhuǎn)速離心15～30min或以0.22μm孔徑的濾膜超濾濃縮5～20倍體積，而后1:100～1:500(w/w)的比例向其中加入甲醛溶液，于37℃滅活16～96h，得到滅活產(chǎn)物；以滅活產(chǎn)物與ISA201佐劑按1:1～4:5的體積比將二者混合，乳化5～10min，而后以滅活產(chǎn)物與氫氧化鋁膠佐劑按3:1～3:5的體積比向乳化產(chǎn)物中加入氫氧化鋁膠佐劑，混合均勻。
作為優(yōu)選，步驟4)中在收獲血清之前，先使用玻片凝集試驗測定血清效價；在此基礎(chǔ)上進一步優(yōu)選的，上述效價的測定時間是步驟2)最后一次免疫接種后第5～10d。
作為優(yōu)選，步驟3)中是通過心臟采血的方式收獲血清的。
在以上技術(shù)方案中，所述無乳鏈球菌標準菌株，購自丹麥SSI；ISA201為由法國SEPPIC公司出品的佐劑產(chǎn)品，可自市面購得。鋁膠為本公司自行配制。
本發(fā)明方法所制備的無乳鏈球菌型特異性抗血清主要應(yīng)用于無乳鏈球菌的血清學(xué)鑒定。無乳鏈球菌在實驗動物中以小鼠最為敏感，其次為家兔，然而使用小鼠制備陽性血清，收獲的血清量較少，不適合大規(guī)模應(yīng)用。使用家兔制備陽性血清較小鼠收獲的血清量大，相對成本較低，具有突出的規(guī)模化應(yīng)用前景。
具體實施方式
以下將對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進行詳細描述。
以下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數(shù)值不限于該準確數(shù)值本身。在一些實施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負百分之十(10％)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時修正第一和第二數(shù)值兩個數(shù)值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關(guān)。
除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。
以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1(無乳鏈球菌性特異性抗血清的制備)
1 抗原的制備
1.1 滅活疫苗制備
1.1.1 菌液的制備 將無乳鏈球菌標準菌株凍干菌種用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)18h后，接種含7％無菌綿羊脫纖血的血瓊脂平板進行劃線進行純化培養(yǎng)后挑去典型的單菌落接種于添加2％新生牛血清和8g/L葡萄糖的THB肉湯培養(yǎng)基中繼代5次，每次培養(yǎng)的時間為6小時。
1.1.2 滅活疫苗的制備 1.1.1節(jié)中制備的菌液經(jīng)離心進行濃縮，其中離心轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心時間為30min，濃縮倍數(shù)為5倍。將濃縮后的菌液以1:500(w/w)的比例向濃縮后的無乳鏈球菌菌液中加入甲醛溶液，于37℃滅活96h。經(jīng)檢驗滅活完全后采用PBS洗滌2次并重懸，調(diào)整活菌數(shù)為1×1010CFU/ml。a)添加ISA201佐劑，以1:1的比例采用磁力攪拌器攪拌配苗，攪拌時間為5min。b)添加氫氧化鋁膠佐劑，以1:3的比例充分混勻配苗。
1.1.3 滅活疫苗檢驗 將1.1.2制成的無乳鏈球菌滅活疫苗進行性狀、無菌檢驗等，結(jié)果全部合格。其中配苗用新鮮菌液經(jīng)活菌計數(shù)，其活菌數(shù)為4.0×108CFU/ml。
1.2 滅活抗原的制備
1.2.1 菌液的制備 將無乳鏈球菌標準菌株凍干菌種用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)12h后，接種含7％無菌綿羊脫纖血的血瓊脂平板進行劃線進行純化培養(yǎng)后挑去典型的單菌落接種于添加2％新生牛血清和10g/L葡萄糖的THB肉湯培養(yǎng)基中繼代3次，每次培養(yǎng)的時間為5小時。
1.2.2 滅活抗原的制備 將1.2.1制備的菌液經(jīng)0.22μm的濾膜進行超濾濃縮，濃縮倍數(shù)為10倍，56℃水浴30min進行熱滅活，滅活檢驗為陰性后放于2～8℃?zhèn)溆?，存放時間不超過1周。
1.2.3 滅活抗原檢驗 將1.2.1制成的無乳鏈球菌滅活抗原進行無菌檢驗，結(jié)果無菌生長。其中配苗用新鮮菌液經(jīng)活菌計數(shù)，其活菌數(shù)為1×108CFU/ml。
2 家兔篩選 選擇體重為3.0～4.0kg的清潔級日本大耳白兔2只，轉(zhuǎn)入試驗用兔舍隔離飼養(yǎng)觀察5d，結(jié)果試驗兔營養(yǎng)狀況良好，未發(fā)現(xiàn)應(yīng)激和其他疾病的發(fā)生。
3 免疫接種
3.1 基礎(chǔ)免疫(滅活疫苗)：共2次。將制備的1.1項a)制備的無乳鏈球菌滅活疫苗經(jīng)背部皮下多點注射，每只兔子注射2ml，間隔10d，以同等劑量進行加強免疫1次。
3.2 強化免疫(滅活疫苗)：共2次?；A(chǔ)免疫7d后，將1.1項b)制備的滅活疫苗經(jīng)背部皮下和腿部肌肉多點注射，每只兔子注射4ml，間隔7d，每只兔子注射8ml加強免疫1次。
3.3 強化免疫(滅活抗原)：共2次。滅活抗原免疫后7d后，將1.2項制備的滅活抗原，以背部皮下注射，每只兔子注射10ml，間隔為5d，每只兔子注射20ml加強免疫1次。
4 家兔安全性觀察家兔免疫后注射部位均未出現(xiàn)膿腫破潰等局部不良反應(yīng)。
5 陽性血清收獲及鑒定
5.1 陽性血清效價測定 最后1次免疫接種后10d采集少量兔血清，使用玻片凝集試驗測定血清中和效價，確認陽性血清的中和抗體為1:640。
5.2 陽性血清的收獲 于最后一次加強免疫后15d采用心臟采血的方式收獲陽性血清100ml。
5.3 陽性血清的應(yīng)用效果 將有交叉反應(yīng)的血清進行吸附后采用玻片凝集的方法進行試驗，結(jié)果制備的陽性血清僅與本型菌體抗原發(fā)生凝集反應(yīng)。將收獲的陽性血清進行無菌檢驗、支原體檢驗及外源病毒檢驗，結(jié)果各項檢驗全部合格。表明我們自行制備的陽性確定可滿足鑒定需要。
實施例2(無乳鏈球菌性特異性抗血清的制備)
1 抗原的制備
1.1 滅活疫苗制備
1.1.1 菌液的制備 將無乳鏈球菌標準菌株凍干菌種用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)12h后，接種含7％無菌綿羊脫纖血的血瓊脂平板進行劃線進行純化培養(yǎng)后挑去典型的單菌落接種于添加3％新生牛血清和4g/L葡萄糖的THB肉湯培養(yǎng)基中繼代5次，每次培養(yǎng)的時間為5小時。
1.1.2 滅活疫苗的制備 制備1.1.1制備的菌液經(jīng)離心進行濃縮，其中離心轉(zhuǎn)速為6000rpm，離心時間為20min，濃縮倍數(shù)為7倍。將濃縮后的菌液以1:200(w/w)的比例向濃縮后的無乳鏈球菌菌液中加入甲醛溶液，于37℃滅活24h。經(jīng)檢驗滅活完全后采用PBS洗滌2次并重懸，調(diào)整活菌數(shù)為1×1010CFU/ml。a)添加ISA201佐劑，以1:1的比例采用磁力攪拌器攪拌配苗，攪拌時間為5min。b)添加氫氧化鋁膠佐劑，以2:3的比例充分混勻配苗。
1.1.3 滅活疫苗檢驗 將1.1.2制成的無乳鏈球菌滅活疫苗進行性狀、無菌檢驗等，結(jié)果全部合格。其中配苗用新鮮菌液經(jīng)活菌計數(shù)，其活菌數(shù)為2×108CFU/ml。
1.2 滅活抗原的制備
1.2.1 菌液的制備 將無乳鏈球菌標準菌株凍干菌種用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)12h后，接種含7％無菌綿羊脫纖血的血瓊脂平板進行劃線進行純化培養(yǎng)后挑去典型的單菌落接種于添加3％新生牛血清和4g/L葡萄糖的THB肉湯培養(yǎng)基中繼代4次，每次培養(yǎng)的時間為4小時。
1.2.2 滅活抗原的制備 將1.2.1制備的菌液經(jīng)0.22μm的濾膜進行超濾濃縮，濃縮倍數(shù)為10倍，56℃水浴30min進行熱滅活，滅活檢驗為陰性后放于2～8℃?zhèn)溆?，存放時間不超過1周。
1.2.3 滅活抗原檢驗 將1.2.1制成的無乳鏈球菌滅活抗原進行無菌檢驗，結(jié)果無菌生長。其中配苗用新鮮菌液經(jīng)活菌計數(shù)，其活菌數(shù)為1×108CFU/ml。
2 家兔篩選 選擇體重為2.0-2.5kg的清潔級日本大耳白兔2只，轉(zhuǎn)入試驗用兔舍隔離飼養(yǎng)觀察7d，結(jié)果試驗兔營養(yǎng)狀況良好，未發(fā)現(xiàn)應(yīng)激和其他疾病的發(fā)生。
3 免疫接種
3.1 基礎(chǔ)免疫(滅活疫苗)：共2次。將制備的1.1項a)制備的無乳鏈球菌滅活疫苗經(jīng)背部皮下多點注射，每只兔子注射4ml，間隔14d，以同等劑量進行加強免疫1次。
3.2 強化免疫(滅活疫苗)：共2次?；A(chǔ)免疫10d后，將1.1項b)制備的滅活疫苗經(jīng)背部皮下多點注射，每只兔子注射6ml，間隔7d，每只兔子注射9ml加強免疫1次。
3.3 強化免疫(滅活抗原)：共2次。滅活抗原免疫后8d后，將1.2項制備的滅活抗原，以背部皮下注射，每只兔子注射20ml，間隔為5d，每只兔子注射40ml加強免疫1次。
4 家兔安全性觀察 家兔免疫后注射部位均未出現(xiàn)膿腫破潰等局部不良反應(yīng)。
5 陽性血清收獲及鑒定
5.1 陽性血清效價測定 最后1次免疫接種后7d采集少量兔血清，使用玻片凝集試驗測定血清中和效價，確認陽性血清的中和抗體為1:640。
5.2 陽性血清的收獲 于最后一次加強免疫后14d采用心臟采血的方式收獲特陽性血清80ml。
5.3 陽性血清的應(yīng)用效果 將有交叉反應(yīng)的血清進行吸附后采用玻片凝集的方法進行試驗，結(jié)果制備的陽性血清僅與本型血清發(fā)生凝集反應(yīng)。將收獲的陽性血清進行無菌檢驗、支原體檢驗及外源病毒檢驗，結(jié)果各項檢驗全部合格。表明我們自行制備的陽性確定可滿足鑒定需要。
實施例3(無乳鏈球菌性特異性抗血清的制備)
1 抗原的制備
1.1 滅活疫苗制備
1.1.1 菌液的制備 將無乳鏈球菌標準菌株凍干菌種用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)12h后，接種含7％無菌綿羊脫纖血的血瓊脂平板進行劃線進行純化培養(yǎng)后挑去典型的單菌落接種于添加5％新生牛血清和10g/L葡萄糖的THB肉湯培養(yǎng)基中繼代5次，每次培養(yǎng)的時間為8小時。
1.1.2 滅活疫苗的制備 制備1.1.1制備的菌液經(jīng)離心進行濃縮，其中離心轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心時間為15min，濃縮倍數(shù)為10倍。將濃縮后的菌液以1:100(w/w)的比例向濃縮后的無乳鏈球菌菌液中加入甲醛溶液，于37℃滅活16h。經(jīng)檢驗滅活完全后采用PBS洗滌2次并重懸，調(diào)整活菌數(shù)為1×1010CFU/ml。a)添加ISA201佐劑，以2:3的比例采用磁力攪拌器攪拌配苗，攪拌時間為10min。b)添加氫氧化鋁膠佐劑，以1:3的比例充分混勻配苗。
1.1.3 滅活疫苗檢驗 將1.1.2制成的無乳鏈球菌滅活疫苗進行性狀、無菌檢驗等，結(jié)果全部合格。其中配苗用新鮮菌液經(jīng)活菌計數(shù)，其活菌數(shù)為1×109CFU/ml。
1.2 滅活抗原的制備
1.2.1 菌液的制備 將無乳鏈球菌標準菌株凍干菌種用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)12h后，接種含7％無菌綿羊脫纖血的血瓊脂平板進行劃線進行純化培養(yǎng)后挑去典型的單菌落接種于添加5％新生牛血清和5g/L葡萄糖的THB肉湯培養(yǎng)基中繼代4次，每次培養(yǎng)的時間為8小時。
1.2.2 滅活抗原的制備 將1.2.1制備的菌液經(jīng)0.22μm的濾膜進行超濾濃縮，濃縮倍數(shù)為20倍，56℃水浴30min進行熱滅活，滅活檢驗為陰性后放于2～8℃?zhèn)溆茫娣艜r間不超過1周。
1.2.3 滅活抗原檢驗 將1.2.1制成的無乳鏈球菌滅活抗原進行無菌檢驗，結(jié)果無菌生長。其中配苗用新鮮菌液經(jīng)活菌計數(shù)，其活菌數(shù)為1×108CFU/ml。
2 家兔篩選 選擇體重為2.5-3.0kg的清潔級新西蘭大白兔2只，轉(zhuǎn)入試驗用兔舍隔離飼養(yǎng)觀察7d，結(jié)果試驗兔營養(yǎng)狀況良好，未發(fā)現(xiàn)應(yīng)激和其他疾病的發(fā)生。
3 免疫接種
3.1 基礎(chǔ)免疫(滅活疫苗)：共2次。將制備的1.1項a)制備的無乳鏈球菌滅活疫苗經(jīng)背部皮下多點注射，每只兔子注射4ml，間隔10d，以同等劑量進行加強免疫1次。
3.2 強化免疫(滅活疫苗)：共2次?；A(chǔ)免疫7d后，將1.1項b)制備的滅活疫苗經(jīng)背部皮下多點注射，每只兔子注射5ml，間隔5d，每只兔子注射10ml加強免疫1次。
3.3 強化免疫(滅活抗原)：共1次。滅活抗原免疫后5d后，將1.2項制備的滅活抗原，以背部皮下注射，每只兔子注射20ml。
4 家兔安全性觀察 家兔免疫后注射部位均未出現(xiàn)膿腫破潰等局部不良反應(yīng)。
5 陽性血清收獲及鑒定
5.1 陽性血清效價測定 最后1次免疫接種后5d采集少量兔血清，使用玻片凝集試驗測定血清中和效價，確認陽性血清的中和抗體為1:320。
5.2 陽性血清的收獲 于最后一次加強免疫后10d采用心臟采血的方式收獲特陽性血清90ml。
5.3 陽性血清的應(yīng)用效果 將有交叉反應(yīng)的血清進行吸附后采用玻片凝集的方法進行試驗，結(jié)果制備的陽性血清僅與本型血清發(fā)生凝集反應(yīng)。將收獲的陽性血清進行無菌檢驗、支原體檢驗及外源病毒檢驗，結(jié)果各項檢驗全部合格。表明我們自行制備的陽性確定可滿足鑒定需要。
以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。