本發(fā)明屬于固相萃取技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱的制備方法及使用方法，并和高效液相色譜方法結(jié)合用于選擇性分離、富集及檢測藥品中的核苷類物質(zhì)的含量。

背景技術(shù)：

分子印跡技術(shù)是指采用人工方法制備在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上對特定分子有專一性結(jié)合作用的聚合物技術(shù)。分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymers,mips)是通過模板分子、功能單體和交聯(lián)劑三者之間相互作用而合成的一種具有三維空間結(jié)構(gòu)的“受體”，對模板分子具有獨(dú)特的“記憶”功能，因而表現(xiàn)出特殊的親和性、高度的選擇性以及卓越的分子識別能力。盡管如此，分子印跡聚合物在其制備過程中仍存在印跡位點(diǎn)分布不均一、“包埋”過深，不利洗脫等問題，為了解決這些問題，一些新型的分子印跡材料相繼發(fā)展起來。

中空分子印跡(hollowmolecularlyimprintedpolymers,h-mips)技術(shù)作為一種新型分子印跡技術(shù)，是在表面分子印跡技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過化學(xué)溶解或刻蝕的方法，去除載體基質(zhì)，得到具有中空結(jié)構(gòu)的聚合物，這種新型制備技術(shù)制得的聚合物使大部分結(jié)合位點(diǎn)分布在載體基質(zhì)材料表面上，有利于模板分子的洗脫和目標(biāo)物的再結(jié)合，有效的解決了在分子印跡技術(shù)發(fā)展過程中出現(xiàn)的印跡位點(diǎn)分布不均一、“包埋”過深，不利洗脫等問題，同時又減小了聚合物內(nèi)部存在擴(kuò)散阻力，提高印跡材料吸附分離效率，因而被廣泛應(yīng)用于固相萃取等方面。

硼酸化學(xué)法是利用硼酸基團(tuán)在堿性水溶液中可以與順式二醇類物質(zhì)，如核苷類物質(zhì)所含的順式鄰位或間位羥基發(fā)生可逆反應(yīng)形成環(huán)狀二酯，并且在酸性條件下實現(xiàn)可逆地解離，從而對含有順式二醇結(jié)構(gòu)的核苷進(jìn)行分離富集。這種ph開關(guān)的特性使硼酸成為優(yōu)良的親和識別配基。利用硼酸對順式二醇結(jié)構(gòu)的特異性識別，制備硼酸修飾的h-mips，可以實現(xiàn)對核苷類物質(zhì)的選擇性識別及分離富集。并且，利用苯硼酸和核苷中順式二醇結(jié)構(gòu)的可逆作用，可以增強(qiáng)材料對特定核苷的選擇性。同時，可以利用ph值控制吸附/解吸過程。

苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱制備過程中的粒徑、分散性、比表面積及吸附效果的優(yōu)化是使核苷類物質(zhì)能有效地被材料富集并與基體溶液快速方便地分離的前提條件。另外，在移除mcm-48基質(zhì)后，要在聚合物的表面形成一個單孔，從而制得中空分子印跡聚合物，要求中空分子印跡聚合物的大部分吸附位點(diǎn)都位于聚合物的內(nèi)外表面上，這一特點(diǎn)有利于提高聚合物的質(zhì)量轉(zhuǎn)移速率同時也將提高聚合物的吸附容量。因此，上述合成條件的控制是本專利擬解決的關(guān)鍵技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種苯硼酸修飾的中空分子印跡聚合物，包含該聚合物的固相萃取柱的制備和使用方法，與高效液相色譜檢測方法結(jié)合，可實現(xiàn)對藥品中含有順式二醇結(jié)構(gòu)的核苷類物質(zhì)(胞苷、鳥苷、尿苷及肌苷)含量的同時檢測。

具體的，本發(fā)明提供的苯硼酸修飾的中空分子印跡聚合物的制備方法，包括如下步驟：

s1：以3-氨基苯硼酸為修飾劑，對甲基丙烯酸單體進(jìn)行化學(xué)修飾，使得甲基丙烯酸表面修飾有對核苷具有硼親和作用的苯硼酸結(jié)構(gòu)，所述甲基丙烯酸單體和3-氨基苯硼酸的物質(zhì)的量比1：1～3；

具體反應(yīng)過程如式(1)所示；

s2：以介孔分子篩mcm-48為基質(zhì)，具有順式二醇結(jié)構(gòu)的尿苷為模板，s1制得的表面修飾有苯硼酸結(jié)構(gòu)的甲基丙烯酸作為功能單體，加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑制備分子印跡材料，對制得的分子印跡材料進(jìn)行洗脫模板，并采用氫氟酸腐蝕掉基質(zhì)介孔分子篩mcm-48，制得中空分子印跡聚合物；

其中，模板、功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑的物質(zhì)的量之比為：2.5～4：10：40～100：0.6～5，每1g基質(zhì)中添加的功能單體為1.5～5mmol。

具體反應(yīng)過程如式(2)所示；

優(yōu)選地，所述介孔分子篩mcm-48是以正硅酸乙酯為硅源，以十六烷基三甲基溴化胺為活性劑，采用水熱合成法合成得到的；

具體反應(yīng)過程如式(3)所示；

優(yōu)選地，所述交聯(lián)劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯，所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈。

優(yōu)選地，s1的具體過程為：將甲基丙烯酸單體與3-氨基苯硼酸按照物質(zhì)的量比為1:1～3的比例混合，溶解于乙腈中，室溫下攪拌12～18h，得到表面修飾有苯硼酸結(jié)構(gòu)的甲基丙烯酸。

更優(yōu)選地，s2的具體過程為：向表面修飾有苯硼酸結(jié)構(gòu)的甲基丙烯酸中加入模板尿苷，靜置4～6h；依次加入交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯和引發(fā)劑偶氮二異丁腈，使模板、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑的物質(zhì)的量之比為：2.5～4：10：40～100：0.6～5，通n210～30min，40～80℃下攪拌1～2h；之后，向體系中加入介孔分子篩mcm-48，超聲15～30min，通n2密封，在40～70℃下攪拌2h，65～80℃下攪拌18～20h，80～100℃下攪拌6～8h，制得聚合物微球；

將制備得到的聚合物微球抽濾乙醇洗滌后，用含有hf的乙醇溶液浸泡刻蝕10h，過濾洗滌后，將聚合物微球置于索式提取器中，用甲醇/乙酸混合溶劑洗去模板分子后，放入真空干燥器中干燥至恒重，得到中空分子印跡聚合物；

所述甲醇/乙酸混合溶劑中甲醇與乙酸的體積比為10-x：x，x選自1～3之間的任意數(shù)值。

優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種苯硼酸修飾的中空分子印跡聚合物，具體由上述任一所述的制備方法制得。

優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱，包括中空固相萃取柱，所述中空固相萃取柱內(nèi)填充有填充層，所述填充層的底部和頂部均安裝有篩板；所述填充層所填材料為上述苯硼酸修飾的中空分子印跡聚合物。

更優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了該苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱與高效液相色譜檢測方法結(jié)合，在藥品中檢測含有順式二醇結(jié)構(gòu)的核苷類物質(zhì)含量的應(yīng)用。

更優(yōu)選地，所述核苷類物質(zhì)為胞苷、鳥苷、尿苷或肌苷。

更優(yōu)選地，苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱與高效液相色譜檢測方法結(jié)合，檢測藥品中含有順式二醇結(jié)構(gòu)的核苷類物質(zhì)含量的具體步驟如下：

將所述苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱置于真空固相萃取裝置上，依次用溶劑甲醇和水在負(fù)壓狀態(tài)下活化小柱，之后抽干溶劑，備用；

將待檢測的樣品溶液在負(fù)壓狀態(tài)下連續(xù)通過所述苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱，抽干樣品溶液；

用正已烷做淋洗劑在負(fù)壓狀態(tài)下連續(xù)通過固相萃取柱進(jìn)行淋洗，抽干淋洗劑，并保持連續(xù)抽干狀態(tài)；

采用1～5％三氟乙酸/乙腈混合溶劑做洗脫劑在負(fù)壓狀態(tài)下連續(xù)通過固相萃取柱對分析物進(jìn)行洗脫，抽干洗脫劑，所述1～5％三氟乙酸/乙腈混合溶劑中，1～5％三氟乙酸和乙腈的體積比為10-y：y，y選自1～5之間的任意數(shù)值；

將洗脫液過濾后進(jìn)入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，測定藥品中含有順式二醇結(jié)構(gòu)的核苷類物質(zhì)含量。

本發(fā)明提供的硼親和中空分子印跡固相萃取柱對核苷類物質(zhì)具有明顯的富集效果，主要是由于分子印跡對模板分子及結(jié)構(gòu)類似物的選擇性吸附、并且中空分子印跡的大部分結(jié)合位點(diǎn)分布在載體基質(zhì)材料表面及中空腔內(nèi)，提高了吸附效率，此外，硼酸基團(tuán)對含有順式二醇結(jié)構(gòu)的核苷類物質(zhì)能實現(xiàn)可逆的吸附和解離。這種ph開關(guān)的特性使硼酸成為優(yōu)良的親和識別配體。以上三種效果的共同作用，使得固相萃取柱具有明顯的吸附效果。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1提供的載體基質(zhì)mcm-48及制備得到的硼親和的中空分子印跡聚合物的掃描電鏡圖。

具體實施方式

為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案能予以實施，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。

需要說明的是，以下實施例中所用到的試劑若無特別說明，均為常規(guī)試劑，可在市場上購買得到，所涉及的相關(guān)化合物的制備方法或檢測方法，若無特別說明，均為常規(guī)方法。

實施例1

一種硼親和中空分子印跡固相萃取柱的制備

分別稱取1.00mmol的單體甲基丙烯酸和1.00mmol的3-氨基苯硼酸，將二者混合均勻，之后溶解于40ml乙腈中，室溫下攪拌12h，得到甲基丙烯酸表面修飾有對核苷具有硼親和作用的苯硼酸結(jié)構(gòu)；

向上述苯硼酸結(jié)構(gòu)中加入模板尿苷，添加量為0.25mmol，0℃下靜置4h；加入5.00mmol的交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯，再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈0.457mmol，通n210min，40℃下攪拌1h；之后，向體系中加入200mg的介孔分子篩mcm-48，超聲15min，通n2密封，在40℃下攪拌2h，65℃下攪拌18h，80℃下攪拌6h，制得聚合物微球；

將上述制備得到的聚合物微球抽濾乙醇洗滌后，用含有hf的乙醇溶液浸泡刻蝕6h，過濾洗滌后，將聚合物微球置于索式提取器中，用體積比為9:1的甲醇/乙酸混合溶劑洗去模板分子后，放入真空干燥器中干燥至恒重，得到中空分子印跡聚合物，該中空分子印跡聚合物的掃描電鏡圖如圖1所示；

稱取200mg上述中空分子印跡聚合物材料，填充至5ml底部裝有篩板的中空固相萃取柱中，再在填料的上方放置篩板并壓實，完成。

上述制備得到的硼親和中空分子印跡固相萃取柱的應(yīng)用

以銀杏達(dá)莫注射液作為實際樣品，進(jìn)行實際樣品的富集和凈化，具體的步驟為，精密量取實際樣品2ml，置50ml容量瓶中，加流動相稀釋至50ml刻度，搖勻，取適量溶液至具塞離心管中，于4000r·min^-1條件下離心10min后，過濾，取濾液，并將此濾液作為實際樣品上樣溶液；

將硼親和的中空分子印跡固相萃取柱置于真空固相萃取裝置上，依次用3ml甲醇，3ml水在負(fù)壓狀態(tài)下活化，并抽干活化溶劑；

將上述實際樣品上樣溶液2ml在負(fù)壓狀態(tài)下連續(xù)通過固相萃取柱，使實際樣品中的核苷類成分在固相萃取柱中被吸附，抽干上樣溶液；再以3ml正已烷做淋洗劑在負(fù)壓狀態(tài)下連續(xù)通過固相萃取柱進(jìn)行淋洗，抽干淋洗劑，并保持連續(xù)抽干狀態(tài)；以0.5ml體積比為7:3的5％三氟乙酸/乙腈的混合溶劑作為洗脫劑，在負(fù)壓狀態(tài)下連續(xù)通過固相萃取柱對分析物進(jìn)行洗脫，抽干洗脫劑；將洗脫液過濾后進(jìn)高效液相色譜檢測。

對比例1

一種硼親和中空非分子印跡固相萃取柱的制備，其制備方法和實施例1相同，不同之處僅在于，在反應(yīng)的過程中不加入模板分子尿苷。

對比例2

以銀杏達(dá)莫注射液作為實際樣品，直接采用高效液相色譜對藥品中的核苷類物質(zhì)進(jìn)行檢測，其具體分析方法和實施例1相同。

對比例3

以銀杏達(dá)莫注射液作為實際樣品，直接采用商品化的固相萃取柱uf-c18結(jié)合高效液相色譜對藥品中的核苷類物質(zhì)進(jìn)行檢測，其具體分析方法和實施例1相同。

實施例2

一種硼親和中空分子印跡固相萃取柱的制備

分別稱取1.00mmol的單體甲基丙烯酸和2.00mmol的3-氨基苯硼酸，將二者混合均勻，之后溶解于50ml乙腈中，室溫下攪拌16h，得到甲基丙烯酸表面修飾有對核苷具有硼親和作用的苯硼酸結(jié)構(gòu)；

向上述苯硼酸結(jié)構(gòu)中加入模板尿苷，添加量為0.4mmol，20℃下靜置4h；加入4mmol的交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯，再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈0.061mmol，通n220min，60℃下攪拌2h；之后，向體系中加入400mg的介孔分子篩mcm-48，超聲20min，通n2密封，在60℃下攪拌3h，80℃下攪拌20h，100℃下攪拌6h，制得聚合物微球；

將上述制備得到的聚合物微球抽濾乙醇洗滌后，用含有hf的乙醇溶液浸泡刻蝕10h，過濾洗滌后，將聚合物微球置于索式提取器中，用體積比為8:2的甲醇/乙酸混合溶劑洗去模板分子后，放入真空干燥器中干燥至恒重，得到中空分子印跡聚合物；

稱取200mg上述中空分子印跡聚合物材料，填充至5ml底部裝有篩板的中空固相萃取柱中，再在填料的上方放置篩板并壓實。

上述制備得到的硼親和中空分子印跡固相萃取柱的應(yīng)用

以香丹注射液作為實際樣品，進(jìn)行實際樣品的富集和凈化，具體的步驟為，精密量取實際樣品5ml，置50ml容量瓶中，加流動相稀釋至50ml刻度，搖勻，取適量溶液至具塞離心管中，于4000r·min^-1條件下離心20min后，過濾，取濾液，并將此濾液作為實際樣品上樣溶液；

將硼親和的中空分子印跡固相萃取柱置于真空固相萃取裝置上，依次用3ml乙腈，3ml水在負(fù)壓狀態(tài)下活化，并抽干活化溶劑；

將上述上樣溶液在負(fù)壓狀態(tài)下連續(xù)通過固相萃取柱，使實際樣品中的核苷類成分在固相萃取柱中被吸附，抽干上樣溶液；再以5ml丙酮做淋洗劑在負(fù)壓狀態(tài)下連續(xù)通過固相萃取柱進(jìn)行淋洗，抽干淋洗劑，并保持連續(xù)抽干狀態(tài)；以1.0ml體積比為6:4的2％三氟乙酸/乙腈的混合溶劑作為洗脫劑，在負(fù)壓狀態(tài)下連續(xù)通過固相萃取柱對分析物進(jìn)行洗脫，抽干洗脫劑；將洗脫液過濾后進(jìn)高效液相檢測。

對比例4

一種硼親和中空非分子印跡固相萃取柱的制備，其制備方法和實施例2相同，不同之處僅在于，在反應(yīng)的過程中不加入模板分子尿苷。

對比例5

以香丹注射液作為實際樣品，直接采用高效液相色譜對藥品中的核苷類物質(zhì)進(jìn)行檢測，其具體分析方法和實施例2相同。

對比例6

以香丹注射液作為實際樣品，直接采用商品化的固相萃取柱uf-c18結(jié)合高效液相色譜對藥品中的核苷類物質(zhì)進(jìn)行檢測，其具體分析方法和實施例2相同。

實施例3

一種硼親和中空分子印跡固相萃取柱的制備

分別稱取1.00mmol的單體甲基丙烯酸和3.00mmol的3-氨基苯硼酸，將二者混合均勻，之后溶解于60ml乙腈中，室溫下攪拌18h，得到甲基丙烯酸表面修飾有對核苷具有硼親和作用的苯硼酸結(jié)構(gòu)；

向上述苯硼酸結(jié)構(gòu)中加入模板尿苷，添加量為0.25mmol，30℃下靜置6h；加入10mmol交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯，再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈0.12mmol，通n230min，80℃下攪拌1h；之后，向體系中加入600mg的介孔分子篩mcm-48，超聲30min，通n2密封，在70℃下攪拌4h，80℃下攪拌20h，90℃下攪拌8h，制得聚合物微球；

將上述制備得到的聚合物微球抽濾乙醇洗滌后，用含有hf的乙醇溶液浸泡刻蝕10h，過濾洗滌后，將聚合物微球置于索式提取器中，用體積比為7:3的甲醇/乙酸混合溶劑洗去模板分子后，放入真空干燥器中干燥至恒重，得到中空分子印跡聚合物；

稱取200mg上述中空分子印跡聚合物材料，填充至5ml底部裝有篩板的中空固相萃取柱中，再在填料的上方放置篩板并壓實。

上述制備得到的硼親和中空分子印跡固相萃取柱的應(yīng)用

以紅花口服液作為實際樣品，進(jìn)行實際樣品的富集和凈化，具體的步驟為，精密量取實際樣品2ml，置50ml容量瓶中，加流動相稀釋至50ml刻度，搖勻，取適量溶液至具塞離心管中，于4000r·min^-1條件下離心30min后，過濾，取濾液；

將硼親和的中空分子印跡固相萃取柱置于真空固相萃取裝置上，依次用5ml乙腈，5ml水在負(fù)壓狀態(tài)下活化，并抽干活化溶劑；

將上述濾液在負(fù)壓狀態(tài)下連續(xù)通過固相萃取柱，抽干溶劑；再以1ml正丁烷做淋洗劑在負(fù)壓狀態(tài)下連續(xù)通過固相萃取柱進(jìn)行淋洗，抽干淋洗劑，并保持連續(xù)抽干狀態(tài)；以1.0ml體積比為5:5的1％三氟乙酸/乙腈的混合溶劑作為洗脫劑，在負(fù)壓狀態(tài)下連續(xù)通過固相萃取柱對分析物進(jìn)行洗脫，抽干洗脫劑；將洗脫液過濾后進(jìn)高效液相檢測。

對比例7

一種硼親和中空非分子印跡固相萃取柱的制備，其制備方法和實施例3相同，不同之處僅在于，在反應(yīng)的過程中不加入模板分子尿苷。

對比例8

以紅花口服液作為實際樣品，直接采用高效液相色譜對藥品中的核苷類物質(zhì)進(jìn)行檢測，其具體分析方法和實施例3相同。

對比例9

以紅花口服液作為實際樣品，直接采用商品化的固相萃取柱uf-c18結(jié)合高效液相色譜對藥品中的核苷類物質(zhì)進(jìn)行檢測，其具體分析方法和實施例3相同。

上述實施例1-3所得的檢測溶液，以及對比例1-9的檢測溶液的液相檢測條件均為：色譜柱：diamonsilc18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：水-甲醇(v:v＝90∶10)；流速：0.9ml·min^-1；檢測波長：260nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl。所得的液相色譜分析結(jié)果見下表1所示。

表1各實施例液相色譜分析結(jié)果

本發(fā)明實施例1-3提供的硼親和中空分子印跡固相萃取柱與對比例中空非分子印跡固相萃取柱、商品化固相萃取柱uf-c18對核苷類物質(zhì)的吸附效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明，本發(fā)明提供的硼親和中空分子印跡固相萃取柱對核苷類物質(zhì)具有明顯的富集效果，主要是由于分子印跡對模板分子及結(jié)構(gòu)類似物的選擇性吸附、并且中空分子印跡的大部分結(jié)合位點(diǎn)分布在載體基質(zhì)材料表面及中空腔內(nèi)，提高了吸附效率，此外硼酸基團(tuán)對含有順式二醇結(jié)構(gòu)的核苷類物質(zhì)能實現(xiàn)可逆的吸附和解離。這種ph開關(guān)的特性使硼酸成為優(yōu)良的親和識別配體。以上三種效果共同作用，使得本發(fā)明合成的h-mips固相萃取柱具有明顯的吸附效果。

以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，其保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。