本發(fā)明屬于四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE兩個(gè)苯環(huán)中間的支鏈改造(兩個(gè)苯環(huán)中間的支鏈進(jìn)行衍生化)，使之具備耦合用羧基的合成方法，并對(duì)其用途進(jìn)行研究。

背景技術(shù)：

四溴雙酚A(TBBPA)及其衍生物是一類(lèi)在全球廣泛使用的溴代阻燃劑，研究表明，TBBPA具有強(qiáng)甲狀腺激素干擾活性以及弱雌激素活性，會(huì)通過(guò)干擾甲狀腺動(dòng)態(tài)平衡而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害。TBBPA-DHEE即為其中一種，是一種重要的添加型阻燃劑。目前，TBBPA及其衍生物在生產(chǎn)過(guò)程中的使用、泄露等使其進(jìn)入環(huán)境，可在多介質(zhì)環(huán)境中殘留、積累，并造成潛在危害。

因此，開(kāi)展四溴雙酚A及其衍生物的分析測(cè)定具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，檢測(cè)四溴雙酚A及其衍生物的方法均基于儀器分析方法，具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但是由于所用儀器極其昂貴，而且存在測(cè)試成本高、分析時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)所需樣品量大及前處理步驟繁瑣等不足，無(wú)法在較大范圍內(nèi)系統(tǒng)、全面、快速分析環(huán)境中TBBPA及其衍生物的含量，因此，建立一種快速簡(jiǎn)便的四溴雙酚A檢測(cè)方法是具有重要意義的。

和其他傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，生物分析方法是基于抗體(或其它具有識(shí)別功能的生物大分子)特異性反應(yīng)的一種分析方法，已廣泛應(yīng)用于食品與環(huán)境中小分子污染物的分析檢測(cè)。該方法具有靈敏度高、方便快捷、高通量、低成本等優(yōu)勢(shì)。而建立此方法的前提是相應(yīng)抗體的研制。

由于TBBPA-DHEE是小分子物質(zhì)，小分子化合物因其分子量小，缺乏免疫原性，在免疫動(dòng)物時(shí)，很難誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)。為此，需要將小分子物質(zhì)與大分子載體蛋白偶聯(lián)，使其成為完全抗原。小分子化合物的抗體，是通過(guò)半抗原作為抗原決定簇免疫動(dòng)物而獲得，所以設(shè)計(jì)并合成合理的半抗原是制備親和性好、靈敏度高的抗體的關(guān)鍵。其原則是設(shè)計(jì)合成與待測(cè)物結(jié)構(gòu)類(lèi)似的半抗原，并盡量保持與待測(cè)物共有的結(jié)構(gòu)作為母核。

對(duì)于半抗原結(jié)構(gòu)的選擇，如果待測(cè)物本身含有-NH₂，-COOH，-OH，-SH等功能基團(tuán)，可直接活化后聯(lián)入載體蛋白，便可合成人工完全抗原。但大部分待測(cè)物分子并不含有功能基團(tuán)，或功能基團(tuán)對(duì)待測(cè)物的特異性和極性影響較大，因此，需要對(duì)小分子化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，使其具有能共價(jià)結(jié)合到載體蛋白上的一種功能基團(tuán)(如氨基、羧基、羥基和巰基等)。

本發(fā)明基于以上原則，設(shè)計(jì)了四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原合成方法，以雙酚酸為原料，通過(guò)4步反應(yīng)得到四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE的半抗原，為后續(xù)建立四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE的生物分析方法提供了有利條件，該抗原目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE(4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸)半抗原的合成方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式如下所示：

所述四溴雙酚A衍生物衍生物TBBPA-DHEE半抗原的合成方法，以雙酚酸為原料，通過(guò)4步反應(yīng)得到半抗原。反應(yīng)過(guò)程如下所示：

一種四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原合成方法，合成步驟如下：

步驟1、以4,4-雙(4-羥苯基)戊酸為原料與甲醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯(a)，步驟如下：

稱(chēng)取原料4,4-雙(4-羥苯基)戊酸裝入圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入甲醇，回流反應(yīng)得到化合物4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯；

步驟2、通過(guò)化合物a與液溴發(fā)生取代反應(yīng)生成4,4-雙(3,5-二溴-4-羥苯基)戊酸甲酯(b)，合成步驟如下：

把溶有Br₂的冰醋酸A慢慢加入到溶有4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯的冰醋酸B中，持續(xù)攪拌；攪拌完成后，將得到的混合物倒入亞硫酸氫鈉的飽和水溶液除去未反應(yīng)的Br₂；再將所得的產(chǎn)物通過(guò)過(guò)濾分離，并用冷水洗滌；產(chǎn)物干燥后，重新溶解在甲醇中攪拌均勻，濾除不溶物，濾液在真空下蒸發(fā)，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)硅膠柱色譜法純化得到4,4-雙(3,5-二溴-4-羥苯基)戊酸甲酯；

步驟3、4,4-雙(3,5-二溴-4-羥基苯基)戊酸甲酯通過(guò)與2-溴乙醇發(fā)生取代反應(yīng)，得到半抗原4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯(c)，合成步驟如下：

在二頸瓶中加入4,4-雙(3,5-二溴-4-羥基苯基)戊酸甲酯，碳酸鉀，2-溴乙醇，二甲基甲酰胺，恒溫反應(yīng)，旋干二甲基甲酰胺，通過(guò)硅膠柱色譜法純化得到化合物4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯1.1g；

步驟4、化合物c通過(guò)與氫氧化鈉發(fā)生皂化反應(yīng)，鹽酸酸化，得到半抗原4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸，合成步驟如下：

將4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯、氫氧化鈉混合，加入甲醇/水混合溶液，恒溫反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，加鹽酸調(diào)節(jié)pH＝4～5，用二氯甲烷提取反應(yīng)液三次，濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜法純化得化合物4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸。

步驟1中，所述4,4-雙(4-羥苯基)戊酸、甲醇的用量比為2.86g：20mL，所述回流反應(yīng)溫度為60℃，回流反應(yīng)時(shí)間為2h。

步驟2中，所述冰醋酸A中，Br₂的濃度為16mol/L；所述冰醋酸B中，4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯的濃度為0.24mol/L；所使用的冰醋酸A與冰醋酸B的體積比為1:4；所述持續(xù)攪拌的時(shí)間為5h。

步驟3中，所述4,4-雙(3,5-二溴-4-羥基苯基)戊酸甲酯、碳酸鉀、2-溴乙醇、二甲基甲酰胺的用量比為1.2g:0.552g:350μL:7mL；所述恒溫反應(yīng)的溫度為100℃，恒溫反應(yīng)時(shí)間為10h。

步驟4中，所述4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯、氫氧化鈉、甲醇/水混合溶液的用量比為1.1g:0.3g:25mL，所述甲醇/水混合溶液中，甲醇與水的體積比為1:1；所加入的鹽酸濃度為1mol/L；所述恒溫反應(yīng)的溫度為60℃，恒溫反應(yīng)時(shí)間為4h。

所制備的4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸用于載體蛋白BSA相偶聯(lián)，制備四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE人工免疫抗原。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)成功的設(shè)計(jì)并合成了一種四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE的半抗原，是一種新型的四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原的合成方法，該方法不僅簡(jiǎn)單、安全、可行，而且所得半抗原能與載體蛋白成功結(jié)合得到四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE的人工抗原，使用該免疫原免疫動(dòng)物，獲得了能特異性識(shí)別四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE的單克隆和多克隆抗體，抗體效價(jià)高，特異性強(qiáng)，可廣泛用于四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE的免疫分析研究。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明制備的4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸的核磁共振氫譜圖；

圖2為本發(fā)明制備的4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

(1)以4,4-雙(4-羥苯基)戊酸為原料與甲醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯(a)，步驟如下：

稱(chēng)取原料4,4-雙(4-羥苯基)戊酸2.86g裝入圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入甲醇20ml，60℃回流2h得到化合物4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯2.9g。產(chǎn)率96％。

(2)通過(guò)化合物a與液溴發(fā)生取代反應(yīng)生成4,4-雙(3,5-二溴-4-羥苯基)戊酸甲酯(b)，合成步驟如下：

把10mL溶有25.7g,0.16mol Br₂的冰醋酸慢慢加入到40mL溶有2.9g，9.6mmol4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯的冰醋酸中，持續(xù)攪拌5小時(shí)。將混合物倒入亞硫酸氫鈉的飽和水溶液除去未反應(yīng)的Br₂。將所得的產(chǎn)物通過(guò)過(guò)濾分離，并用冷水洗滌。干燥后，將所得產(chǎn)物重新溶解在100mL甲醇中，攪拌30分鐘。不溶物通過(guò)過(guò)濾除去，濾液在真空下蒸發(fā)，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)硅膠柱色譜法純化得到4,4-雙(3,5-二溴-4-羥苯基)戊酸甲酯(4.2g)。產(chǎn)率70％。

(3)4,4-雙(3,5-二溴-4-羥基苯基)戊酸甲酯通過(guò)與2-溴乙醇發(fā)生取代反應(yīng)，得到半抗原4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯(c),合成步驟如下：

在二頸瓶中加入4,4-雙(3,5-二溴-4-羥基苯基)戊酸甲酯1.2g，加入碳酸鉀552mg，2-溴乙醇350μL，二甲基甲酰胺7ml，在100℃下反應(yīng)10h，旋干二甲基甲酰胺,通過(guò)硅膠柱色譜法純化得到化合物4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯1.1g,產(chǎn)率80％。

(4)化合物c通過(guò)與氫氧化鈉發(fā)生皂化反應(yīng)，鹽酸酸化，得到半抗原4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸(D₃)，合成步驟如下：

將1.1g 4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯、氫氧化鈉300mg混合，加入甲醇和水(1:1，25ml)，在60℃下反應(yīng)4h結(jié)束，加1mol/L鹽酸調(diào)pH至4-5，用二氯甲烷提取反應(yīng)液三次，濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜法得化合物4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸(D₃)0.95g，產(chǎn)率85％。

所制備的4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸的表征見(jiàn)圖1、圖2，其中核磁共振氫譜如下：¹H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):1.56(s,3H),1.95(m,2H),2.32(m,2H),3.76(q,J＝5.6Hz,4H),3.97(t,J＝5.6Hz,4H),4.90(t,J＝5.6Hz,2H),7.45(s,4H),12.17(s,1H)。質(zhì)譜結(jié)果如下：calculated for C21H22Br4O6:690.01；found:689.08([M-H+])。

實(shí)施例2

利用碳化二亞胺法將合成的四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原D₃與載體蛋白BSA相偶聯(lián)，制備四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE人工免疫抗原：

稱(chēng)取400mg EDC·HCl和15mg BSA溶于2mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS溶液中，于磁力攪拌器上攪拌30min。稱(chēng)取45mg半抗原D₃溶于1mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS溶液中，逐滴滴加到上述混合溶液中，室溫下攪拌1h，4℃放置過(guò)夜。將反應(yīng)終液置于0.01mol/L pH＝7.4的PBS溶液中4℃透析，每4-12小時(shí)換透析一次液，共透析3天。透析結(jié)束后將透析袋中的蛋白溶液，即為四溴雙酚A人工抗原D₃-BSA分成若干等份分裝于1mL離心管中，于-20℃冰箱中存放備用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。