本發(fā)明屬于中藥現代化技術領域，涉及一種中藥化學對照品的制備方法，具體來說，本發(fā)明提供了一種從防風藥材中分離高純度升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的方法。

背景技術：

防風為傘形科植物防風Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.未抽花莖的干燥根?，F今主要分布于黑龍江、內蒙古、遼寧、吉林、河北和山東等地，分布較廣適應性強，為我國最常用的傳統(tǒng)中藥之一，味辛苷，性溫，歸膀胱、肝、脾經，具有解表祛風、勝濕、止痙的功效。主治外感風寒、頭痛目眩、周身盡痛、風寒麻痹、骨節(jié)疼痛、四肢攣急等癥。

升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷是在2010年版一部中收載的指標成分，升麻素苷(Prim-O-glucosylcimifugin)，分子式為C₂₂H₂₈O₁₁，5-O-甲基維斯阿米醇苷(5-O-methylvisamminolβ-D-glucopyranoside)，分子式為C₂₂H₂₈O₁₀，它們的結構式如下：

針對防風組成的中藥制劑(如辛夷鼻炎丸、玉屏風散、童康平等)中升麻素苷和5-O甲基維斯阿米醇苷的檢測方法的專利較多，如申請?zhí)?01310504883.5的專利申請公開“辛夷鼻炎丸含量的測定方法”。而目前國內關于升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的分離純化文獻報道很少，加之，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷已在2010版藥典中被列為標準，這兩種對照品的需求量越來越大，尤其5-O-甲基維斯阿米醇苷在藥材中含量很低，從藥材中分離出單體非常困難，因此從防風中分離純化升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品顯得非常必要，具有廣泛的應用價值。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的分離純化方法。該方法不但可實現升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的同步分離，且分離效率高，工藝穩(wěn)定，成本低廉，可大量制備得到純度大于99％的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品。

本發(fā)明的第一方面提供了一種升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的制備方法，所述的方法包括以下步驟：

(i)提供升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的醇提混合物；

(ii)所述的醇提混合物與溶劑混合，得到第一混合物，并利用中壓制備柱分離所述的第一混合物，從而獲得升麻素苷粗品和5-O-甲基維斯阿米醇苷粗品；和

(iii)利用溶劑對升麻素苷粗品和/或5-O-甲基維斯阿米醇苷粗品進行重結晶，從而獲得升麻素苷對照品和/或5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(ii)還包括步驟：

(ii-1)以30-35％(v/v)甲醇溶液作為中壓制備柱的第一洗脫劑，進行第一階段洗脫，濃縮洗脫液以獲得升麻素苷粗品；和

(ii-2)以45-50％(v/v)甲醇溶液作為中壓制備柱的第二洗脫劑，進行第二階段洗脫，濃縮洗脫液以獲得5-O-甲基維斯阿米醇苷粗品。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(ii)中的中壓制備柱設有柱壓0-2MPa,較佳地為0.5-2MPa。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(ii)中的中壓制備柱的柱壓下限選自下組：0MPa、0.1MPa、0.2MPa、0.3MPa、0.4MPa、或0.5MPa。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(ii)中的中壓制備柱的柱壓上限選自下組：2MPa、2.1MPa、2.2MPa、2.3MPa、2.4MPa、或2.5MPa。

此處，當中壓制備柱的柱壓為0MPa時，是指中壓制備柱處于標準大氣壓下。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(ii)中的中壓制備柱的填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(ii)中的中壓制備柱的填料粒徑為40-60μm。

在另一優(yōu)選例中，所述的升麻素苷粗品純度≥93.0％。

在另一優(yōu)選例中，所述的5-O-甲基維斯阿米醇苷粗品純度≥98.0％。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(iii)還包括步驟：

(iii-1)所述的升麻素苷粗品與純水以及丙酮混合，使所述的升麻素苷粗品在混合溶劑中進行重結晶；分離并干燥所得結晶物，即獲得升麻素苷對照品；和/或

(iii-2)所述的5-O-甲基維斯阿米醇苷粗品與甲醇以及丙酮混合，使所述的5-O-甲基維斯阿米醇苷粗品在混合溶劑中進行重結晶；分離并干燥所得結晶物，即獲得5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(iii-2)在所述步驟(iii-1)之前，或同步進行。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(ii)中使用45-55％(v/v)甲醇溶液與所述的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的醇提混合物進行混合。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(iii-1)中純水的電導率≤18.2μs/cm。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(iii-2)中甲醇的純度為≥99.5％。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(iii-1)和(iii-2)的丙酮的純度≥99.5％。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(iii-1)中，加入的丙酮為純水的5-10倍量(v/v)；和/或

所述的步驟(iii-2)中，加入的丙酮為甲醇的5-10倍量(v/v)。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(iii-1)中重結晶操作重復次數大于等于2次。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(iii-2)中重結晶操作重復次數大于等于2次。

在另一優(yōu)選例中，所述的升麻素苷對照品純度≥99.0％，較佳地，純度≥99.3％，更佳地，純度≥99.5％。

在另一優(yōu)選例中，所述的5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品純度純度≥99.0％，較佳地，純度≥99.5，更佳地，純度≥99.6％。

在另一優(yōu)選例中，所述的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的醇提混合物由包括以下步驟的方法制備得到：

(i-1)混合防風藥材和乙醇溶液，冷浸醇提，固液分離后濃縮液體部分，從而獲得第一濃縮液；

(i-2)使用大孔樹脂吸附所述的第一濃縮液，然后分別用4-5倍柱體積的水洗脫雜質，再用1-2倍柱體積的55-65％乙醇溶液洗脫目標物，收集洗脫液，濃縮以獲得第二濃縮液；和

(i-3)使用硅膠柱層析分離所述的第二濃縮液，采用二氯甲烷:甲醇洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮以獲得步驟(i)中所述的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的醇提混合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的乙醇溶液與防風藥材以5-8(L/kg)倍量混合。

在另一優(yōu)選例中，所述的乙醇溶液的體積百分比濃度為70-90％(v/v)，較佳地，為80％(v/v)。

在另一優(yōu)選例中，所述的大孔樹脂為聚苯乙烯型非極性吸附樹脂。

在另一優(yōu)選例中，所述的大孔樹脂的孔隙率為42-46％。

在另一優(yōu)選例中，所述的二氯甲烷:甲醇洗脫劑中各組分的體積比為10:1-5:1。

本發(fā)明的第二方面提供了一種升麻素苷對照品和/或5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品，所述的升麻素苷對照品和/或5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品由如本發(fā)明第一方面所述的方法制備得到。

應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1為實施例1所得升麻素苷對照品的HPLC檢測圖譜。

圖2為實施例1所得5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的HPLC檢測圖譜。

具體實施方式

本發(fā)明人經過廣泛而深入地研究，首次研發(fā)出一種高純度升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的制備方法。本制備方法采用中壓制備柱分離純化升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷醇提物，在一定的壓強下，分離效率大大提高，并且通過重結晶來進一步提高目標物質的純度。在此基礎上，完成了本發(fā)明。

為實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

本發(fā)明一種優(yōu)選的技術方案如下：

A.原料提?。簩⒎里L藥材按照體積質量比L/Kg加入5～8倍量的乙醇溶液，冷浸提取提取72h，抽濾，合并濾液，濃縮至無醇味；

所述的乙醇溶液的體積百分比濃度為80％；

B.大孔樹脂富集：將步驟A的濃縮液用大孔樹脂靜態(tài)吸附過夜，然后分別用4-5倍柱體積的水洗脫雜質，再用1-2倍柱體積的65％乙醇溶液洗脫目標物，收集洗脫液，濃縮至原體積的1/10；

C.硅膠柱層析：將步驟B的濃縮液用100-200目的硅膠拌樣，烘干后碾碎，取200-300目硅膠，二氯甲烷濕法裝柱。上樣后，采用二氯甲烷：甲醇洗脫劑，并按10:1-5:1的體積比由高到低梯度洗脫，TLC跟蹤檢測，收集洗脫液，濃縮得升麻素苷半成品和5-O-甲基維斯阿米醇苷的半成品；

D.中壓制備:將步驟C的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的半成品用50％甲醇水溶解上中壓制備柱，用33％甲醇洗脫，濃縮得到純度為93％左右得升麻素苷粗品；用48％甲醇溶液洗脫，濃縮得到純度為98％左右的5-O-甲基維斯阿米醇苷粗品；

E.產品回收：將步驟D得到的93％左右的升麻素苷粗品用少量的純水加熱溶解后加入5倍量的丙酮稀釋，轉移至4℃冰箱中冷藏結晶，等晶體析出后，抽濾固體，再重新用純水加熱溶解后用5倍量的丙酮稀釋重結晶，重復操作2-3次冷凍干燥后得到純度為99％以上升麻素苷對照品；將步驟D得到的98％左右的5-O-甲基維斯阿米醇苷粗品用少量的甲醇加熱溶解后加入5倍量的丙酮稀釋，轉移至4℃冰箱中冷藏結晶，等晶體析出后，抽濾固體，再重新用甲醇加熱溶解后用5倍量的丙酮稀釋重結晶，重復操作2-3次冷凍干燥后得到純度為99％以上5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品。

本發(fā)明的主要優(yōu)點

1、采用重結晶方法進行產品回收，產品得率高，純度高；

2、溶劑消耗少，工藝過程中的溶劑都可回收再利用；

3、溶劑毒性小，所用的溶劑為乙醇、甲醇、純水，環(huán)境污染小；

4、操作簡便，生產周期短，分離效率高，工藝穩(wěn)定可靠，重現性好，成本低廉，適合工業(yè)化生產；

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。

實施例1

升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的制備方法，按如下工藝步驟進行：

A.原料提取；將防風藥材10Kg，加入50L體積分數為80％的乙醇溶液冷浸提取72h，過濾，合并濾液，濃縮至無醇味，共5L；

B.大孔樹脂富集：稱取4KgAB-8大孔吸附樹脂，將步驟A的濃縮液用大孔樹脂靜態(tài)吸附12個小時，然后用40L的水洗脫雜質，再用6L的65％乙醇溶液洗脫目標物，收集洗脫液，濃縮至100ml；

C.硅膠柱層析：將步驟B的100ml濃縮液用100-200目硅膠100g拌樣，烘干后碾碎，取200-300目硅膠500g，用二氯甲烷濕法裝柱。上樣后，采用二氯甲烷：甲醇洗脫劑，并按10:1-5:1的體積比由高到低梯度洗脫，TLC跟蹤檢測，收集洗脫液，分別濃縮得升麻素苷半成品8.7g和5-O-甲基維斯阿米醇苷半成品6.5g；

D.中壓制備：將步驟C的升麻素苷半成品8.7g用30ml水溶解后上中壓制備柱用33％甲醇洗脫，濃縮得到純度為93％的升麻素苷粗品5.2g；將步驟C的5-O-甲基維斯阿米醇苷半成品6.5g用20ml的甲醇溶解上中壓制備柱，用48％的甲醇洗脫，濃縮得到98％的5-O-甲基維斯阿米醇苷粗品4.2g；

E.產品回收：將步驟D得到的93％左右的升麻素苷粗品5.2g用10ml的純水加熱溶解后加入50ml的丙酮稀釋，轉移至4℃冰箱中冷藏12小時，等晶體析出后，抽濾固體，再重新用純水加熱溶解后用5倍量的丙酮稀釋重結晶，重復操作2-3次冷凍干燥后得到純度為99％以上升麻素苷對照品4.1g；將步驟D得到的98％左右的5-O-甲基維斯阿米醇苷粗品4.2g用10ml的甲醇加熱溶解后加入5倍量的丙酮稀釋，轉移至4℃冰箱中冷藏12小時，等晶體析出后，抽濾固體，再重新用甲醇加熱溶解后用5倍量的丙酮稀釋重結晶，重復操作2-3次冷凍干燥后得到純度為99％以上5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品3.6g。

圖1為實施例1所得升麻素苷對照品的HPLC檢測圖譜，圖2為實施例1所得5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的HPLC檢測圖譜。所得升麻素苷對照品經HPLC分析純度為99.3％，5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品經HPLC分析純度為99.6％。

實施例2

升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的制備方法，按如下工藝步驟進行：

A.原料提?。粚⒎里L藥材5Kg，加入35L體積分數為80％的乙醇溶液冷浸提取72h，過濾，合并濾液，濃縮至無醇味，共3L；

B.大孔樹脂富集：稱取2KgAB-8大孔吸附樹脂，將步驟A的濃縮液用大孔樹脂靜態(tài)吸附12個小時，然后用20L的水洗脫雜質，再用3L的65％乙醇溶液洗脫目標物，收集洗脫液，濃縮至50ml；

C.硅膠柱層析：將步驟B的50ml濃縮液用100-200目硅膠50g拌樣，烘干后碾碎，取200-300目硅膠300g，用二氯甲烷濕法裝柱。上樣后，采用二氯甲烷：甲醇洗脫劑，并按10:1-5:1的體積比由高到低梯度洗脫，TLC跟蹤檢測，收集洗脫液，分別濃縮得升麻素苷半成品4.8g和5-O-甲基維斯阿米醇苷半成品4.3g；

D.中壓制備：將步驟C的升麻素苷半成品4.8g用20ml水溶解后上中壓制備柱用33％甲醇洗脫，濃縮得到純度為95％的升麻素苷粗品3.7g；將步驟C的5-O-甲基維斯阿米醇苷半成品4.2g用10ml的甲醇溶解上中壓制備柱，用48％的甲醇洗脫，濃縮得到97％的5-O-甲基維斯阿米醇苷粗品3.2g；

E.產品回收：將步驟D得到的95％左右的升麻素苷粗品3.7g用6ml的純水加熱溶解后加入30ml的丙酮稀釋，轉移至4℃冰箱中冷藏12小時，等晶體析出后，抽濾固體，再重新用純水加熱溶解后用5倍量的丙酮稀釋重結晶，重復操作2-3次冷凍干燥后得到純度為99％以上升麻素苷對照品3.2g；將步驟D得到的98％左右的5-O-甲基維斯阿米醇苷粗品3.2g用100ml的甲醇加熱溶解后加入5倍量的丙酮稀釋，轉移至4℃冰箱中冷藏12小時，等晶體析出后，抽濾固體，再重新用甲醇加熱溶解后用5倍量的丙酮稀釋重結晶，重復操作2-3次冷凍干燥后得到純度為99％以上5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品2.5g。

所得升麻素苷對照品經HPLC分析純度為99.5％，5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品經HPLC分析純度為99.5％。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。