本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種天目瓊花枝葉木脂素成分提取方法和用途。

背景技術(shù)：

天目瓊花(Viburnum sargentii)是忍冬科(Caprifoliaceae)莢蒾屬(Viburnum)植物。我國黑龍江、吉林、遼寧、河北北部、山西、陜西南部、甘肅南部，河南西部、山東、安徽南部和西部、浙江西北部、江西(黃龍山)、湖北和四川均有分布。其味甘、苦，性平，入肺、肝、脾、腎四經(jīng)，有通經(jīng)活絡(luò)、活血消腫、祛風殺蟲之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明天目瓊花的果實能夠治療慢性支氣管炎、咳嗽痰喘、抗腫瘤等作用，而對天目瓊花的木脂素類成分提取方法的研究未見報道。本發(fā)明首次對泰山野生天目瓊花化學(xué)成分進行系統(tǒng)研究，為進一步開發(fā)利用該植物提供科學(xué)依據(jù)。

木脂素是一類結(jié)構(gòu)多樣的天然化合物，具有廣泛的生物活性，存在于多種植物中。現(xiàn)代藥理研究表明木脂素具有抵抗多種腫瘤細胞、抗炎抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)血漿膽固醇等藥理作用。木脂素結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變，多數(shù)呈游離型，為親脂性成分，少數(shù)與糖結(jié)合成苷。如何從植物中提取、制備高純度的木脂素單體，是開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品的關(guān)鍵技術(shù)之一，現(xiàn)有技術(shù)中公開的幾種常用提取法為有機溶劑提取法、超聲波提取法、二氧化碳超臨界等提取技術(shù)。有機溶劑提取法和超聲波提取法主要是對藥材藥用成分的前期批量萃取的粗提取手段；二氧化碳超臨界提取技術(shù)雖然融合了萃取和分離技術(shù)，但提取的極性范圍有限，對提取揮發(fā)油成分比較好使；而木脂素類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變，與植物葉綠素和脂質(zhì)成分混合難以分離、純化，利用現(xiàn)有方法很難分離到高純度木脂素類化合物單體。為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種采用“有機溶劑萃取法”“超聲波提取法”和“柱色譜法”相結(jié)合的方法從天目瓊花枝葉中提取高純度的木脂素單體，并探索其醫(yī)藥用途。

動脈粥樣硬化疾病是指高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥、氧化應(yīng)激或炎癥等因素引起的動脈粥樣硬化性疾病。多糖抗動脈粥樣硬化的研究較多，對木脂素單體的抗動脈粥樣硬化研究未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供天目瓊花枝葉木脂素成分提取方法，旨在解決目前的提取方法不能獲得高純度天目瓊花木脂素類化合物單體及抗動脈粥樣硬化的活性的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種天目瓊花木脂素的提取方法，所述天目瓊花木脂素的提取方法包括如下步驟：

步驟一，將干燥的天目瓊花枝葉粉碎后用95％乙醇室溫冷浸48～72小時滲漉提取，乙醇提取液用30L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，將蒸出乙醇倒回滲漉罐子冷浸24～48小時；對藥粉進行二次滲漉提取，二次濃縮，將蒸出乙醇再次倒回滲漉罐子冷浸24～48小時；對藥粉進行第三次滲漉提取，三次濃縮，回收乙醇，至濃縮液無醇味，得總浸膏，回收乙醇；

步驟二，使用恒溫超聲儀溫水混懸浸膏，分別使用1倍～1.5倍的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，減壓濃縮，分別得到4個部位不同極性組分的浸膏；

步驟三，取氯仿部位浸膏甲醇溶解，用MCI柱色譜依次用30％～95％的甲醇溶液洗脫除去葉綠素；用聚酰胺柱色譜洗去黃酮雜質(zhì)；進行硅膠柱層析，洗脫溶劑采用體積比為二氯甲烷：丙酮＝100:1～5:1的混合液，取層析物進行中壓C₁₈反相柱色譜層析，依次用30％～95％的甲醇溶液洗脫，此后的層析物一組經(jīng)凝膠柱Sephadex LH-20進行純化，洗脫劑為采用體積比為二氯甲烷：甲醇＝1:1的混合液，得化合物1，最后經(jīng)高效液相色譜儀分離純化，甲醇：水體積比為55:45，得化合物2和3；另一組再進行硅膠柱層析，洗脫溶劑采用體積比為二氯甲烷：甲醇＝25:1～10:1，得化合物4，層析物再次經(jīng)凝膠柱Sephadex LH-20進行純化，洗脫劑為甲醇，得化合物5。

進一步，所述的步驟二中使用恒溫超聲儀溫水混懸浸膏，除了溫水混懸浸膏外，超聲儀水浴液也進行恒溫來增加水溶性，用40KHz頻率處理20～30分鐘，主要目的是震碎大的顆粒和促使微小氣泡生長破裂，來避免分布萃取中乳化現(xiàn)象。

進一步，所述步驟三中各種柱色譜層析洗脫條件均根據(jù)正相和反相層析板的指示進行的。

進一步，所述步驟三得到的得化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5的結(jié)構(gòu)式分別為：

本發(fā)明另一目的在于提供一種利用上述天目瓊花木脂素的提取方法提取的天目瓊花木脂素制備的治療動脈粥樣硬化藥物。以8周齡雄性小鼠為研究模型，通過喂飼高脂飼料建立動脈粥樣硬化模型，將42只小鼠隨機分成對照組(普通飲食)、對照組(高脂飲食)木脂素1組(高脂飲食+20mg化合物1/kg/d)、木脂素2組(高脂飲食+20mg化合物2/kg/d)、木脂素3組(高脂飲食+20mg化合物3/kg/d)、木脂素4組(高脂飲食+20mg化合物4/kg/d)木脂素5組(高脂飲食+20mg化合物5/kg/d)，每組6只，持續(xù)喂飼8周后，8周末，小鼠禁食10小時，采用酶法檢測血清總膽固醇、非高密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯水平。第8周末處死小鼠，觀察主動脈粥樣硬化形成情況。

現(xiàn)有提取方法存在的缺點及本發(fā)明解決辦法，來說明本發(fā)明的創(chuàng)造性：

1.現(xiàn)有提取技術(shù)缺點：植物葉綠素與木脂素類化合物混合在一齊，影響木脂素的分離，干擾層析板的指示，使分離變得困難?，F(xiàn)有技術(shù)一般采用大孔樹脂、硅膠、反相等方法去除葉綠素，去除率僅有60％～70％。

解決辦法：本發(fā)明采用最新的SBC MCI GEL反相色譜填料，使葉綠素效果去除率從60％～70％提高到97％～100％。

2.現(xiàn)有提取技術(shù)缺點：現(xiàn)代提取方法多數(shù)使用汽油、苯、乙醚、乙醇、丙酮、石油醚等有機溶劑，采用液液萃取、固液萃取、二氧化碳超臨界萃取、大孔樹脂層析，沉淀、結(jié)晶等提取方法，得到木脂素類化合物的總提取物，而且總提取物中木脂素類化合物成分含量僅有30％～85％。

解決辦法：本發(fā)明將萃取后的混合物浸膏經(jīng)正相柱和反相柱后，采用凝膠柱Sephadex LH-20以二氯甲烷：甲醇＝1:1為洗脫劑進行分離純化，反復(fù)2次富集得到純度96％～99％的化合物1單體；剩余的化合物2和化合物3用甲醇：水(55:45)高效液相色譜儀分離純化得到純度96％～99％的化合物化合物2和化合物3單體；采用類似的方法可得到純度96％～99％的化合物4和化合物5。與現(xiàn)有分離技術(shù)30％～85％純度相比有了顯著提高；

3.現(xiàn)有提取技術(shù)缺點：木脂素類化合物的提取中洗脫劑多采用石油醚和苯以及苯和乙酸乙酯組合，這些組合不易分離回收，回收率僅有30％～40％，而且苯的毒性較大。

解決辦法：本發(fā)明正相柱采用二氯甲烷和丙酮以及二氯甲烷和甲醇的組合方式，二氯甲烷和丙酮組合減壓回收后可采用高效分餾柱(塔)分餾進行分離回收，回收率達到80％-85％，二氯甲烷和甲醇組合減壓回收后可采用水萃取的方法快速分出二氯甲烷，回收率達到80％～90％，萃取水中甲醇可采用高效分餾柱(塔)分餾進行分離回收回收率達到75％～80％。與現(xiàn)有分離回收率30％～40％相比有了顯著提高。

本發(fā)明將萃取后的混合物浸膏經(jīng)正相柱和反相柱后，采用凝膠柱Sephadex LH-20以二氯甲烷：甲醇＝1:1為洗脫劑進行分離純化，反復(fù)2次富集得到純度96％～99％的化合物1單體；剩余的化合物2和化合物3用甲醇：水(55:45)高效液相色譜儀分離純化得到純度96％～99％的化合物化合物2和化合物3單體；采用類似的方法可得到純度96％～99％的化合物4和化合物5；與現(xiàn)有分離技術(shù)30％～85％純度相比有了顯著提高；化合物1～5結(jié)構(gòu)明確，可進行目標性結(jié)構(gòu)修飾，應(yīng)用于藥物合成，獲得活性更好的藥物分子，以進一步開發(fā)利用藥用植物資源。本發(fā)明的5個木脂素均為首次從天目瓊花中提取到，使得獲取這類天然活性成分的途徑更加廣泛。本發(fā)明正相柱采用二氯甲烷和丙酮以及二氯甲烷和甲醇的組合方式，二氯甲烷和丙酮組合減壓回收后可采用高效分餾柱(塔)分餾進行分離回收，回收率達到80％-85％；二氯甲烷和甲醇組合減壓回收后可采用水萃取的方法快速分出二氯甲烷，回收率達到80％～90％，萃取水中甲醇可采用高效分餾柱(塔)分餾進行分離回收，回收率達到75％～80％；與原有30％～40％回收率相比有了顯著提高；此方法排污少，適宜于現(xiàn)代精細工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明采用最新的SBC MCI GEL反相色譜填料，使葉綠素的去除率從現(xiàn)有技術(shù)的60％～70％提高到97％～100％。天目瓊花5個木脂素類化合物對防治動脈粥樣硬化疾病均有明顯的效果，為治療動脈粥樣硬化疾病指明了方向。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的天目瓊花木脂素的提取方法流程圖；

圖2是本發(fā)明實施例提供的化合物1氫譜圖；

圖3是本發(fā)明實施例提供的化合物1碳譜圖；

圖4是本發(fā)明實施例提供的化合物2氫譜圖；

圖5是本發(fā)明實施例提供的化合物2碳譜圖；

圖6是本發(fā)明實施例提供的化合物3氫譜圖；

圖7是本發(fā)明實施例提供的化合物3碳譜圖；

圖8是本發(fā)明實施例提供的化合物4氫譜圖；

圖9是本發(fā)明實施例提供的化合物4碳譜圖；

圖10是本發(fā)明實施例提供的化合物5氫譜圖；

圖11是本發(fā)明實施例提供的化合物5碳譜圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細的描述。

如圖1所示，本發(fā)明是實例提供的天目瓊花木脂素的提取方法，包括如下步驟：

S101：將干燥的天目瓊花枝葉粉碎后用95％乙醇室溫冷浸48～72小時滲漉提取，乙醇提取液用30L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，將蒸出乙醇倒回滲漉罐子冷浸24～48小時；對藥粉進行二次滲漉提取，二次濃縮，將蒸出乙醇再次倒回滲漉罐子冷浸24～48小時；對藥粉進行第三次滲漉提取，三次濃縮，回收乙醇，至濃縮液無醇味，得總浸膏，回收乙醇；

S102：使用恒溫超聲儀溫水混懸浸膏，分別使用1倍～1.5倍的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，減壓濃縮，分別得到4個部位不同極性組分的浸膏；

S103：取氯仿部位浸膏甲醇溶解，用MCI柱色譜依次用30％～95％的甲醇溶液洗脫除去葉綠素；用聚酰胺柱色譜洗去黃酮雜質(zhì)；進行硅膠柱層析，洗脫溶劑采用體積比為二氯甲烷：丙酮＝100:1～5:1的混合液，取層析物進行中壓C₁₈反相柱色譜層析，依次用30％～95％的甲醇溶液洗脫，此后的層析物一組經(jīng)凝膠柱Sephadex LH-20進行純化，洗脫劑為采用體積比為二氯甲烷：甲醇＝1:1的混合液，得化合物1，最后經(jīng)高效液相色譜儀分離純化，甲醇：水體積比為55:45，得化合物2和化合物3；另一組再進行硅膠柱層析，洗脫溶劑采用體積比為二氯甲烷：甲醇＝25:1～10:1，得化合物4，層析物再次經(jīng)凝膠柱Sephadex LH-20進行純化，洗脫劑為甲醇，得化合物5。

進一步，所述的步驟二中使用恒溫超聲儀溫水混懸浸膏，除了溫水混懸浸膏外，超聲儀水浴液也進行恒溫來增加水溶性，用40KHz頻率處理20～30分鐘，主要目的是震碎大的顆粒和促使微小氣泡生長破裂，來避免分布萃取中乳化現(xiàn)象。

進一步，所述步驟三中各種柱色譜層析洗脫條件均根據(jù)正相和反相層析板的指示進行的。

進一步，所述步驟三得到的得化合物1～5的結(jié)構(gòu)式分別為：

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步的描述

實施例1

將20Kg干燥的天目瓊花枝葉粉碎后用95％乙醇50L室溫冷浸48～72小時滲漉提取，乙醇提取液用30L大型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，將蒸出乙醇倒回滲漉罐子冷浸24～48小時；對藥粉進行二次滲漉提取，二次濃縮，將蒸出乙醇再次倒回滲漉罐子冷浸24～48小時；對藥粉進行第三次滲漉提取，三次濃縮，回收乙醇，至濃縮液無醇味，得總浸膏2000g，回收乙醇。使用恒溫超聲儀溫水混懸浸膏，分別使用1～1.5倍的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，減壓濃縮，分別得到4個部位不同極性組分的浸膏。取氯仿部位浸膏甲醇溶解，用MCI柱色譜除去葉綠素(依次用30％～95％的甲醇溶液洗脫)；用聚酰胺柱色譜洗去黃酮雜質(zhì)(水洗脫)；進行硅膠柱層析，洗脫溶劑為二氯甲烷：丙酮(體積比為100:1～5:1)，取層析物進行中壓C₁₈反相柱色譜層析(依次用30％～95％的甲醇溶液洗脫)，此后的層析物一組經(jīng)凝膠柱Sephadex LH-20進行純化，洗脫劑為二氯甲烷：甲醇(1:1)，得化合物1，最后經(jīng)高效液相色譜儀分離純化，甲醇：水(體積比為55:45)得化合物2和3。另一組再進行硅膠柱層析，洗脫溶劑為二氯甲烷：甲醇(體積比為25:1～10:1)，得化合物4，層析物再次經(jīng)凝膠柱Sephadex LH-20進行純化，洗脫劑為甲醇，得化合物5。

實施例2以8周齡雄性小鼠為研究模型，通過喂飼高脂飼料建立動脈粥樣硬化模型，將42只小鼠隨機分成對照組(普通飲食)、對照組(高脂飲食)木脂素1組(高脂飲食+20mg化合物1/kg/d)、木脂素2組(高脂飲食+20mg化合物2/kg/d)、木脂素3組(高脂飲食+20mg化合物3/kg/d)、木脂素4組(高脂飲食+20mg化合物4/kg/d)木脂素5組(高脂飲食+20mg化合物5/kg/d)，每組6只，持續(xù)喂飼8周后，8周末，小鼠禁食10小時，采用酶法檢測血清總膽固醇、非高密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯水平。第8周末處死小鼠，觀察主動脈粥樣硬化形成情況。

結(jié)果表明，與高脂飲食組相比，給予木脂素1組、木脂素2組、木脂素3組、木脂素4組和木脂素5組天目瓊花木脂素單體后，血清中總膽固醇分別降低了30.77％、28.37％、28.95％、32.62％和29.55％；非高密度脂蛋白膽固醇分別下降了36.22％、35.04％、33.22％、34.50％和34.22％；高密度脂蛋白膽固醇顯著增加了56.22％、55.44％、53.32％、54.39％和52.02％；對甘油三酯水平?jīng)]有影響。

主動脈粥樣硬化情況，空白對照組主動脈結(jié)構(gòu)正常，幾乎無脂質(zhì)沉積和斑塊形成。高脂飲食8周后，高脂組主動脈內(nèi)壁脂質(zhì)斑塊形成顯著。給藥天目瓊花木脂素8周后，木脂素1-5組均未見脂質(zhì)條紋形成和斑塊的形成。由此可見，天目瓊花木脂素單體化合物1-5均有較好的抗粥樣硬化作用。

實施例3單體木蘭脂素(化合物1)的結(jié)構(gòu)確定

白色粉末(氯仿)。ESI-MS m/z:417[M+H]+，分子式為C₂₃H₂₈O₇。1H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:3.10(2H,m,H-1,5),3.82,3.86,3.88(each,3H,s,OMe),3.86(6H,s,OMe),3.92,4.27(each 2H,m,H-4,8)；4.74(2H,m,H-2,6),6.81-6.90(5H,m,Ar-H).13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:54.3(C-1),54.6(C-5),56.1(OMe),56.4(OMe),61.2(OMe),72.0(C-4),72.2(C-8),85.9(C-2),86.3(C-6),103.0(C-2″,6″),109.4(C-2′),111.2(C-5′),118.5(C-6′),133.6(C-1′),137.0(C-1″),137.7(C-4″),148.9(C-3′),149.4(C-4′),153.7(C-3″,5″)。氫譜和碳譜見說明書附圖2和圖3

實施例4單體(+)-桉脂素(化合物2)的結(jié)構(gòu)確定

白色粉末(氯仿)。ESI-MS m/z:387[M+H]+，分子式為C₂₂H₂₆O₆。1H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:6.90-6.80(6H,m,Ar-H),3.10(2H,m,H-1,5),4.74(2H,d,J＝4.1Hz,H-2,6),4.25(2H,dd,J＝8.9,6.9Hz,H-4α,8α),3.95(2H,dd,J＝8.9,6.9HzH-4β,8β),3.88(6H,s,OCH3×2),3.86(6H,s,OCH3×2),；13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ:54.4(C-1,5),86.0(C-2,6),71.9(C-4,8),134.6(C-1′,1″),110.9(C-2′,2″),149.5(C-3′,3″),149.7(C-4′,4″),112.3(C-5′,5″),119.3(C-6′,6″),56.1(OCH3×2),56.2(OCH3×2)。氫譜和碳譜見說明書附圖4和圖5。

實施例5單體(-)-表桉葉明(化合物3)的結(jié)構(gòu)確定

白色粉末(氯仿)。ESI-MS m/z:387[M+H]+，分子式為C₂₂H₂₆O₆。1H-NMR(CDCl₃,400MHz):6.93-6.80(6H,m,Ar-H),2.90(1H,m,H-1),4.43(H,d,J＝7.2Hz,H-2),3.33(1H,m,H-4β),3.35(1H,m,H-5),4.86(1H,d,J＝5.4Hz,H-6),4.12(1H,m,H-8β),3.87(1H,d,J＝9.6Hz,H-4α,8α),3.86(3H,s,OCH3),3.87(3H,s,OCH3),3.88(3H,s,OCH3),3.89(3H,s,OCH3)；13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ:133.9(C-1),109.2(C-2),149.1(C-3),149.0(C-4),111.2(C-5),118.7(C-6),87.9(C-7),54.7(C-8),71.2(C-9),131.2(C-1′),109.4(C-2′),149.5(C-3′),148.3(C-4′),118.7(C-5′),117.9(C-6′),82.3(C-7′),50.4(C-8′),70.0(C-9′),56.2(OCH3×2),56.1(OCH3×2)。氫譜和碳譜見說明書附圖6和圖7。

實施例6單體vibsanol(化合物4)的結(jié)構(gòu)確定

白色粉末(氯仿)。ESI-MS m/z:343[M+H]+，分子式為C₁₉H₁₈O₆。1H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.51(1H,d,J＝1.9Hz,H-2′),6.93(1H,d,J＝8.2Hz,H-5′),7.36(1H,dd,J＝8.2,1.9Hz,H-6′),4.80(1H,s,H-9′),6.87(1H,d,J＝1.3Hz,H-2),7.20(1H,d,J＝1.3Hz,H-6),6.6(1H,d,J＝15.8Hz,H-7),6.3(1H,dt,J＝15.8,5.8Hz,H-8),4.2(2H,dd,J＝5.8Hz,H-9),3.9(3H,s,OCH3)；13C-NMR(400MHz,CDCl3)δ:134.7(C-1),109.6(C-2),143.4(C-3),143.7(C-4),133.2(C-5),110.4(C-6),132.7(C-7),128.5(C-8),55.6(C-9),123.6(C-1′),112.1(C-2′),149.4(C-3′),148.9(C-4′),116.6(C-5′),122.0(C-6′),155.9(C-7′),115.2(C-8′),64.0(C-9′),56.4(OCH3)。氫譜和碳譜見說明書附圖8和圖9。

實施例7單體3,4′-dimethoxylvibsanol(化合物5)的結(jié)構(gòu)確定

白色粉末(氯仿)。ESI-MS m/z:357[M+H]+，分子式為C₂₀H₂₀O₆。1H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.35(1H,d,J＝1.9Hz,H-2′),6.91(1H,d,J＝8.2Hz,H-5′),7.44(1H,dd,J＝8.2,1.9Hz,H-6′),4.83(1H,s,H-9′),6.87(1H,d,J＝1.3Hz,H-2),7.14(1H,d,J＝1.35Hz,H-6),6.64(1H,d,J＝15.79Hz,H-7),6.32(1H,dt,J＝15.79,5.82Hz,H-8),4.30(2H,dd,J＝5.78Hz,H-9),3.95/4.00/4.03(9H,s,3,3′,4′-OCH3)；13C-NMR(400MHz,CDCl3)δ:133.0(C-1),108.4(C-2),144.0(C-3),145.3(C-4),132.1(C-5),111.5(C-6),131.5(C-7),127.6(C-8),56.3(C-9),123.5(C-1′),112.0(C-2′),149.4(C-3′),149.9(C-4′),118.4(C-5′),123.5(C-6′),157.0(C-7′),112.0(C-8′),64.1(C-9′),56.3(OCH3×3)。氫譜和碳譜見說明書附圖10和圖11。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。