本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一株西瓜雌性突變株及西瓜雌性系的檢測方法。

背景技術：

西瓜(Citrullus lanatus)為葫蘆科黃瓜屬一年生蔓生草本植物，是一種國內(nèi)外廣泛栽培的重要經(jīng)濟作物。我國自漢代以來就有種植西瓜的歷史，是世界上最早栽培西瓜的國家之一，也是目前世界上西瓜栽培面積最大、產(chǎn)量最高的國家。

葫蘆科作物具有被子植物中的全部性型，是植物性別分化機理研究的模式作物，其中黃瓜及甜瓜性別決定機理研究比較清楚，而在西瓜中的研究比較滯后。西瓜植株的性型有：雌雄異花同株、雄花完全花同株(雄完株系)、雌性系和完全花系。前人的研究表明黃瓜及甜瓜雌性系產(chǎn)生是由于一個C2H2類的轉錄因子ClWIP1的突變產(chǎn)生的。而西瓜雌性系是一種極為罕見的性型，目前僅有我國報道發(fā)現(xiàn)了西瓜雌性系自然突變體XHBFGM。它是雌雄異花同株性型材料XHBMB自然變異所得的。雌性系在育種中具有相當大的作用，它有利于降低育種人工成本、提高種子純度，具有很高的經(jīng)濟價值。故開展西瓜雌性系控制基因研究具有相當大的理論和實踐意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測西瓜性型的方法。

本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測西瓜性型的方法是檢測待測西瓜ClWIP1基因的第656-664位是否發(fā)生缺失，

若待測西瓜ClWIP1基因的兩條同源染色體的第656-664位均沒有發(fā)生缺失或兩條同源染色體中的一條同源染色體的第656-664位發(fā)生缺失，且另一條沒有發(fā)生缺失，則待測西瓜為或候選為雌雄異花同株西瓜品種；

若待測西瓜ClWIP1基因的兩條同源染色體的第656-664位均發(fā)生缺失，則待測西瓜為或候選為雌性系西瓜品種。

上述方法中，所述檢測待測西瓜ClWIP1基因的第656-664位是否發(fā)生缺失的方法為(1)或(2)：

(1)直接測序西瓜個體的基因組DNA；

(2)測序含有ClWIP1基因的第656-664位的PCR擴增產(chǎn)物；根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物鑒定或輔助鑒定待測西瓜性型的方法：

若PCR擴增產(chǎn)物含有DNA片段甲，則待測西瓜為或候選為雌雄異花同株西瓜品種；

若PCR擴增產(chǎn)物僅含有DNA片段乙，則待測西瓜為或候選為雌雄異花同株西瓜品種；

所述PCR擴增產(chǎn)物所用的引物為如下1)或2)：

1)由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的單鏈DNA分子組成的引物對A；

2)由序列A所示的單鏈DNA分子和序列B所示的單鏈DNA分子組成的引物對B；

所述序列A為將序列3刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列3具有相同功能的核苷酸；

所述序列B為將序列4刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列4具有相同功能的核苷酸；

所述DNA片段甲的核苷酸序列為序列5；

所述DNA片段乙的核苷酸序列為序列6。

本發(fā)明的第二個目的是檢測待測西瓜ClWIP1基因的第656-664位是否發(fā)生缺失的物質的新用途。

本發(fā)明提供了檢測待測西瓜ClWIP1基因的第656-664位是否發(fā)生缺失的物質在如下(a1)-(a6)中至少一種中的應用：

(a1)鑒定或輔助鑒定待測西瓜性型；

(a2)制備鑒定或輔助鑒定待測西瓜性型的產(chǎn)品；

(a3)鑒定或輔助鑒定待測西瓜為雌雄異花同株西瓜品種還是雌性系西瓜品種；

(a4)制備鑒定或輔助鑒定待測西瓜為雌雄異花同株西瓜品種還是雌性系西瓜品種的產(chǎn)品；

(a5)選育雌性系西瓜品種；

(a6)選育雌雄異花同株西瓜品種。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測西瓜性型的產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測西瓜性型的產(chǎn)品是檢測待測西瓜ClWIP1基因的第656-664位是否發(fā)生缺失的物質。

上述應用或上述產(chǎn)品中，所述檢測待測西瓜ClWIP1基因的第656-664位是否發(fā)生缺失的物質為如下1)或2)：

1)由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的單鏈DNA分子組成的引物對A；

2)由序列A所示的單鏈DNA分子和序列B所示的單鏈DNA分子組成的引物對B；

所述序列A為將序列3刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列3具有相同功能的核苷酸；

所述序列B為將序列4刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列4具有相同功能的核苷酸。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種選育雌性系西瓜品種的方法。

本發(fā)明提供的選育雌性系西瓜品種的方法是選育ClWIP1基因的兩條同源染色體的第656-664位均發(fā)生缺失的西瓜。

本發(fā)明的第五個目的是提供一種選育雌雄異花同株西瓜品種的方法。

本發(fā)明提供的選育雌雄異花同株西瓜品種的方法是選育ClWIP1基因的兩條同源染色體的第656-664位均沒有發(fā)生缺失或兩條同源染色體中的一條同源染色體的第656-664位發(fā)生缺失，且另一條沒有發(fā)生缺失的西瓜。

本發(fā)明的第六個目的是提供一種雌性系西瓜的培育方法。

本發(fā)明提供的雌性系西瓜的培育方法為使西瓜ClWIP1基因的兩條同源染色體的第656-664位均發(fā)生缺失，得到雌性系西瓜。

本發(fā)明的最后一個目的是提供上述方法獲得的雌性系西瓜的新用途。

本發(fā)明提供了上述雌性系西瓜在如下(b1)-(b3)中任一種中的應用：

(b1)西瓜育種；

(b2)降低西瓜育種人工成本；

(b3)提高西瓜種子純度。

上述方法或上述應用或上述產(chǎn)品中，

所述雌雄異花同株西瓜為同一株上同時著生雌花及雄花的西瓜；

所述雌性系西瓜為同一株上25節(jié)位以下全部著生雌花的西瓜。

上述方法或上述應用或上述產(chǎn)品中，

所述ClWIP1基因的第656-664位為自ClWIP1基因起始密碼子起的第656-664位，也即為西瓜基因組2號染色體的第33348744-33348752位。

本發(fā)明在長期的育種實踐中發(fā)現(xiàn)了一株西瓜雌性系突變體TGS409，是來源于雌雄異花同株性型材料TS409的自然變異。通過比較全基因組重測序信息及對后代分離群體驗證，發(fā)現(xiàn)ClWIP1基因中9個堿基的缺失突變導致了TGS409雌性株表型的出現(xiàn)，并基于獲得的InDel差異位點設計了可以方便檢測含有ClWIP1缺失突變位點的分子標記。通過實驗證明：本發(fā)明的分子標記可迅速檢測以TGS409為轉育材料的西瓜雌性系表型，對西瓜雌性系TGS409中突變后的ClWIP1基因進行鑒定，可用于后代轉育西瓜雌性株育種材料，大大降低了西瓜制種成本、提高了種子純度。

附圖說明

圖1為西瓜雌性系基因ClWIP1的DNA全長在正常野生型的雌雄異花同株材料及TGS409雌性系突變體的序列差異比對圖。

圖2為引物gy-IF和引物gy-IR對親本及F2群體的PCR擴增圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

實施例1、西瓜雌性系突變體TGS409及分子標記的獲得

一、西瓜雌性系突變體TGS409的發(fā)現(xiàn)與保藏

本發(fā)明在長期的育種實踐中發(fā)現(xiàn)了一株西瓜雌性系突變體TGS409，是來源于雌雄異花同株性型材料TS409的自然變異。通過比較全基因組重測序信息及對后代分離群體驗證，發(fā)現(xiàn)ClWIP1基因第656-664位存在9個堿基的缺失突變導致了TGS409雌性株表型的出現(xiàn)。

西瓜雌性系突變體TGS409于2016年09月01日保藏于北京農(nóng)作物種質資源庫(http://www.bvrc.com.cn:6041/GR_Program/Web/)，保藏編號為西瓜No.32129。

二、分子標記的獲得及初步驗證

1、供試材料選取

(1)供試體材料包括：野生型TS409(雌雄異花同株)和驗證群體；驗證群體為父本卡紅Calhum Gray(http://www.bvrc.com.cn:6041/GR_Program/Web/)，保藏編號為西瓜No.21414)和母本TGS409(雌性系性型，gygy)為親本進行雜交，獲取F₁代群體及F2代群體。

(2)群體單株的性型鑒定

對234個單株組成的F₁代及F2代群體的性型進行鑒定，其中，雌雄異花同株西瓜為同一株上同時著生雌花及雄花的西瓜；雌性系西瓜為同一株上25節(jié)位以下全部著生雌花的西瓜。

鑒定結果表明：F1群體單株均為典型雌雄異花同株性型，F(xiàn)2群體中有178株雌雄異花同株性型單株和56株雌性系性型單株，經(jīng)卡方檢測符合3：1分離比率。故西瓜TGS409中的雌性系性型是受隱性單基因控制。

2、基因組DNA的提取

將步驟1中的供試材料分別進行DNA提取處理，得到供試材料基因組DNA；DNA提取處理為參照Murry等(1980)的方法(Murray M,Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res,1980,8:668-673.)的基礎上改進而成；具體步驟如下：

a.取1.5克葉片，在液氮中研磨成粉末，再加入9ml 2％CTAB提取液(2％CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1％PVP-40，0.2％β-巰基乙醇)，混勻，于65℃水浴1小時，得到混合物A；

b.將混合物A停止水浴，加入1/3體積的5M的醋酸鉀溶液，混勻，冰浴20分鐘；再加入等體積氯仿/異戊醇(24：1)抽提兩次，得到上清液A；

c.向上清液A中加入2/3體積異丙醇用來沉淀DNA；再用洗滌緩沖液(76％乙醇，10mM乙酸銨)洗滌一次，吹干，再加TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.4)溶解，得到溶液A；

d.向溶液A中加入RNase A，使其終濃度達100μg/ml，再混勻37℃水浴1小時；再用等體積氯仿/異戊醇(24：1)抽提一次，得到上清液B；

e.向上清液B中加入1/2體積7.5M醋酸銨、2倍體積無水乙醇，得到DNA沉淀；

f.用70％乙醇洗滌DNA沉淀，吹干，加適量ddH₂O溶解DNA，得到供試材料基因組DNA；

再用紫外分光光度計(Shimadzu UV-1201，日本)以OD₂₆₀值測定供試材料基因組DNA的濃度，再用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測供試材料基因組DNA的提取質量；

3、InDel位點的發(fā)現(xiàn)

根據(jù)西瓜全基因組信息，設計全長引物對西瓜雌性系突變體TGS409及野生株TS409的ClWIP1基因進行序列比對，獲取TGS409及TS409間的InDel位點，根據(jù)ClWIP1基因全長測序結果，對西瓜雌性系材料TGS409及雄花完全花材料TS409進行全基因組序列比對，發(fā)現(xiàn)TGS409與TS409間的InDel位點，并設計特異性引物。PCR擴增反應選用的多態(tài)性標記引物由上海生工公司北京合成部合成。具體步驟如下：

分別以西瓜雌性系突變體TGS409和野生型TS409(雌雄異花同株)為模板，采用上游序列gy-F和下游序列gy-R引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，即ClWIP1基因序列；

ClWIP1全長序列擴增引物：

上游序列gy-F為：5’-ATGACTGATCCTTACCCCATCAAC-3’(序列1)；

下游序列gy-R為：5’-TCATGTTTCAATCTCAGAAGCTGG-3’(序列2)。

PCR擴增反應的反應體系(50μL)：5μL 10×TransStart Taq Buffer；5μL濃度為2.5mM的dNTPs；2U TransStart Taq DNA Polymerase DNA聚合酶；2μL 10mM上游引物，2μL 10mM下游引物；20ng模板DNA；ddH₂O補足到50μL；其中，Taq DNA聚合酶、反應緩沖液及dNTPs購自北京全式金生物技術有限公司；

反應程序為：階段1：94℃預變性5min；階段2：94℃30s，55℃30s，72℃1min30s，共38個循環(huán)；階段3：72℃延伸10min；階段5:4℃保存；其中，PCR儀為購自Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler；

PCR擴增產(chǎn)物檢測：取PCR擴增產(chǎn)物與載樣緩沖液(6×Loading Buffer，北京全式金生物技術有限公司)混勻，再加入1.2％的瓊脂糖凝膠中，180V/90A進樣，90V/100A電泳；其中，瓊脂糖為：Agarose RA(購自amresco公司)；緩沖液為：1×TAE緩沖液；電泳儀為購自JINGYI公司的JY600電泳儀；針對目的條帶送由北京市諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。

測序結果表明：野生型TS409(雌雄異花同株)PCR擴增得到大小為2834bp的條帶，突變體TGS409(雌性系)PCR擴增得到大小為2825bp的條帶，PCR擴增產(chǎn)物的比對結果如圖1所示。從圖中可以看出：和野生型TS409(雌雄異花同株)相比，西瓜雌性系突變體TGS409中ClWIP1基因第656-664位(也即為西瓜基因組2號染色體的第33348744-33348752位，西瓜全基因序列信息來源于西瓜基因組信息網(wǎng)站，網(wǎng)站為http://www.icugi.org)存在9個堿基的缺失，進而導致表現(xiàn)為雌性系。

4、InDel引物的設計及初步驗證

(1)InDel引物的設計

根據(jù)TGS409及TS409間的InDel位點，設計特異性引物用于ClWIP1基因的缺失分析，ClWIP1基因特異InDel擴增引物序列如下：

上游序列gy-IF為：5’-GATGATCATCATCAATTAGAAG-3’(序列3)；

下游序列gy-IR為：5’-GAATCAAAAAGGTGATGAACAC-3’(序列4)。

(2)InDel引物的初步驗證

分別以突變體TGS409(雌性系)和野生型TS409(雌雄異花同株)為模板，采用上游序列gy-IF和下游序列gy-IR引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。

PCR擴增反應的反應體系(13μL)：1.3μL含15mM MgCl₂的10×EasyTaq PCR Buffer；0.8μL濃度為2.5mM的dNTPs；0.4U long PCR Taq DNA聚合酶；0.5μL 10mM上游引物，0.5μL 10mM下游引物；20ng模板DNA；ddH₂O補足到13μL；其中，Taq DNA聚合酶、反應緩沖液及dNTPs購自北京全式金生物技術有限公司；

反應程序為：階段1：94℃預變性5min；階段2：94℃15s，55℃20s，72℃30s，共34個循環(huán)；階段3：72℃延伸4min；階段5:4℃保存；其中，PCR儀為購自Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler；

PCR擴增產(chǎn)物檢測：取13μl PCR產(chǎn)物中加入3μl上樣緩沖液(6×Loading Buffer)，移液器混勻后點入8％的聚丙烯酰胺凝膠中。140V/500mA電泳電泳1h 30min即可。其中，8％聚丙烯酰胺膠配方：dd H₂O 10mL、10×TBE 2mL、20％Acr-Bis 8mL、Temed、20μL、10％APS 200μL。

測序結果表明：野生型TS409(雌雄異花同株)PCR擴增得到大小為263bp的條帶，其核苷酸序列如序列5所示；突變體TGS409(雌性系)PCR擴增得到大小為254bp的條帶，其核苷酸序列如序列6所示。上述引物擴增結果與信息學分析結果相同，即包含ClWIP1基因DNA全部序列的片段的單株為雌雄異花同株，而ClWIP1基因的第656-664位缺失的單株表現(xiàn)為雌性系。下面通過F1和F2群體進行驗證。

三、分子標記的群體驗證

以F2代群體為實驗材料，采用引物gy-IF和gy-IR進行單株PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。PCR擴增方法和PCR產(chǎn)物檢測方法均參照步驟4中的(2)。

檢測結果表明：F2群體中178株雌雄異花同株性型的單株的擴增產(chǎn)物均含有大小為263bp的條帶，核苷酸序列均如序列5所示；F2群體中56株雌性系性型的單株的擴增產(chǎn)物均僅含有大小為254bp的條帶，核苷酸序列均如序列6所示，部分材料的擴增結果如圖2所示。上述結果表明：基因型與表型的吻合率為100％。該結果顯示，在TGS409雌性系性中ClWIP1基因的第656-664位發(fā)生9個堿基的缺失是導致雌性系產(chǎn)生的分子基礎。因此可以根據(jù)ClWIP1基因的第656-664位是否發(fā)生9個堿基的缺失判斷待測西瓜的性型：

若待測西瓜ClWIP1基因的兩條同源染色體的第656-664位均沒有發(fā)生缺失或兩條同源染色體中的一條同源染色體的第656-664位發(fā)生缺失，且另一條沒有發(fā)生缺失，則待測西瓜為或候選為雌雄異花同株西瓜品種；

若待測西瓜ClWIP1基因的兩條同源染色體的第656-664位均發(fā)生缺失，則待測西瓜為或候選為雌性系西瓜品種。

序列表

<110> 北京市農(nóng)林科學院 京研益農(nóng)（北京）種業(yè)科技有限公司

<120> 一株西瓜雌性突變株及西瓜雌性系的檢測方法

<160> 6

<210> 1

<211> 24bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atgactgatc cttaccccat caac 24

<210> 2

<211> 24bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

tcatgtttca atctcagaag ctgg 24

<210> 3

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gatgatcatc atcaattaga ag 22

<210> 4

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

gaatcaaaaa ggtgatgaac ac 22

<210> 5

<211> 263bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gatgatcatc atcaattaga agatcaagtt cctaatccta attattcttc ttctaattcc 60

aatattatta ctagtgctgc tactactact actggactta ataagggtca atattggatt 120

ccaactcctg ctcagattct tattggtcca actcagtttt cttgccctct ttgcttcaag 180

actttcaata gatacaacaa catgcaggta tttattttat tttttattct tcaatcttaa 240

tgtgttcatc acctttttga ttc 263

<210> 6

<211> 254bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

gatgatcatc atcaattaga agatcaagtt cctaatccta attattcttc ttctaattcc 60

aatattatta ctagtgctgc tactactact actggactta ataagggtca atattggatt 120

ccaactcctg ctcagattct tattggtcca actcagtttt cttgccctct ttgcttcaag 180

actttcaata acatgcaggt atttatttta ttttttattc ttcaatctta atgtgttcat 240

cacctttttg attc 254