技術(shù)特征：

1.一種58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷貝數(shù)的絕對(duì)定量檢測(cè)方法，其特征在于經(jīng)過(guò)下列各步驟：

（1）構(gòu)建58型HPV病毒 E6/E7致癌基因共同標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒：

a．根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中58型HPV基因序列，針對(duì)E6/E7基因47-941位點(diǎn)區(qū)域，按下述設(shè)計(jì)特異性引物：

HPV58 E6/E7For：5'-ACG GTC TGA CCG AAA CCG GTG-3'

HPV58 E6/E7Rev：5'-ACC TCA AAC CAG CCA GTA CAG-3'

b．宮頸癌細(xì)胞中總DNA的提?。合葘? mL HPV-58陽(yáng)性細(xì)胞保存液吸入1.5 mL滅菌的EP管中，在4℃下以13000rpm離心5min；棄上清，往沉淀中加入1mL Tris-HCl 洗滌緩沖液，在4℃下以13000rpm離心5min；棄上清，再加入1mL Tris-HCl洗滌緩沖液，在4℃下以13000rpm離心5min，棄上清；往沉淀中加入200 μL濃度為0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液， 在50℃下消化過(guò)夜；然后以95℃沸水煮沸變性10min；再在4℃下以13000rpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至0.5 mL EP管中，-70℃下凍存，得到58型HPV基因組DNA；

c．將步驟（1）b所得58型HPV基因組DNA通過(guò)PCR的方法，利用步驟a的特異性引物擴(kuò)增58型HPV病毒 E6/E7基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD-18T Vector克隆載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑單克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，獲得58型HPV目的基因序列鑒定正確的陽(yáng)性菌株；

d．將步驟（1）c所得序列鑒定正確的陽(yáng)性菌株分別進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，獲得58型HPV標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定58型HPV標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度，再按下列公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)：

Number of copies（copies/μl） = (Amount×6.022×10²³)/（Length×1×10⁹×650）

其中，Amount為紫外分光光度計(jì)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒所測(cè)含量（ng/μl），Length代表模板DNA長(zhǎng)度；

（2）參照步驟（1）c所得的58型HPV目的基因序列分別設(shè)計(jì)下列58型HPV病毒 E6和E7的熒光定量PCR特異性引物：

HPV58 E6For：5'-TGT CAG GCG TTG GAG ACA TC-3'

HPV58 E6Rev：5'-ATA GCA ATC GTA AGC ACA CT-3'

HPV58 E7For：5'-ACC AAC TGA CCT ATT CTG CTA TG-3'

HPV58 E7Rev：5'-ACG TCG GTT GTT GTA CTG TTG AT-3'

（3）利用步驟（1）d所得58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分別檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞中的58型HPV病毒 E6和E7拷貝數(shù)，具體檢測(cè)方法如下：

a．將步驟（1）d所得58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒用雙蒸水按梯度稀釋至10^-7，按PCR反應(yīng)體系以SYBR法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒擴(kuò)增效率和特異性，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)直接獲得58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線與溶解曲線，同時(shí)根據(jù)熒光定量PCR檢測(cè)所得標(biāo)準(zhǔn)品Ct值作為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)log₁₀作為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而得到58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

所述PCR反應(yīng)體系如表1：

表1 熒光定量PCR反應(yīng)體系（反應(yīng)總體積為20μl）

采用的反應(yīng)程序如下：

b．按步驟（3）a提供的PCR反應(yīng)體系以SYBR法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中HPV病毒DNA，分別根據(jù)步驟（3）a利用標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，進(jìn)而獲得宮頸癌細(xì)胞中HPV病毒 E6以及E7致癌基因DNA的絕對(duì)定量拷貝數(shù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的絕對(duì)定量檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟（1）58型HPV基因序列在基因庫(kù)中的收錄號(hào)為D90400.1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的絕對(duì)定量檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟（3）a中用雙蒸水按梯度稀釋至10^-7是指將58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分別用雙蒸水稀釋成以下梯度：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7。