本發(fā)明涉及一種合成1-苯基乙醇的生物學(xué)方法,屬于香精香料領(lǐng)域。
背景技術(shù):
:除了趨避植食性昆蟲(chóng),吸引天敵和傳粉昆蟲(chóng),植物間信號(hào)傳導(dǎo)之外,植物香氣還有著潛在的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值,例如延長(zhǎng)食品貯藏時(shí)間,提高食物的風(fēng)味,鎮(zhèn)靜,提高記憶力等。越來(lái)越多的研究表明植物香氣對(duì)人類的健康有貢獻(xiàn),同時(shí)某些植物香氣為新藥的開(kāi)發(fā)提供了線索?;谝陨系墓δ埽参锵銡獾暮铣珊图兓艿皆絹?lái)越多的關(guān)注。傳統(tǒng)的從植物中提取香氣物質(zhì)的方法耗時(shí)長(zhǎng),花費(fèi)大并且得率低。因此,開(kāi)發(fā)新的、安全高效的植物香氣合成方法勢(shì)在必行。1-苯基乙醇是香水工業(yè)的原料,同時(shí)也是某些藥物合成的中間體。在茶樹(shù)花中,1-苯基乙醇是主要的香氣物質(zhì)。目前茶樹(shù)多采取無(wú)性繁殖。和具有高附加值的茶葉相比而言,茶樹(shù)花是一種“廢棄”資源。從茶樹(shù)花中直接提取1-苯基乙醇也存在著耗時(shí)長(zhǎng),花費(fèi)大并且產(chǎn)量低的劣勢(shì)。我們發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)花中含有某些酶能夠高效的將苯乙酮轉(zhuǎn)化為1-苯基乙醇。利用植物來(lái)源的酶合成植物香氣具有高效、環(huán)保、合成迅速等優(yōu)點(diǎn)。苯乙酮是一種價(jià)格非常低廉的工業(yè)原料。建立利用茶樹(shù)花酶將苯乙酮轉(zhuǎn)化為1-苯基乙醇的方法能夠?qū)崿F(xiàn)1-苯基乙醇的經(jīng)濟(jì)、高效、綠色合成。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種利用茶樹(shù)花的酶合成1-苯基乙醇的方法,利用該方法可以實(shí)現(xiàn)1-苯基乙醇的高效、安全、綠色合成。一種利用茶樹(shù)花的酶合成1-苯基乙醇的方法,包括以下步驟:(1)1-苯基乙醇合成酶粗酶的制備:將聚乙烯吡咯烷酮和3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽加入茶樹(shù)花中;用pH值為7的磷酸鉀緩沖液在冰上充分勻漿,緩沖液中同時(shí)含有1%的甘油,1mMEDTA;勻漿產(chǎn)物在4℃下離心15-20分鐘;離心之后的上清液通過(guò)PD-10脫鹽柱將目的蛋白用含有0.1%甘油、0.1mMEDTA的磷酸鉀緩沖液洗脫,緩沖液的濃度為10mM,pH值為7,得到1-苯基乙醇合成酶粗酶;(2)1-苯基乙醇的合成:底物苯乙酮在1-苯基乙醇合成酶粗酶的催化下生成1-苯基乙醇;反應(yīng)所使用的緩沖液為100mM磷酸鉀緩沖液;反應(yīng)液中包含1.25mM的苯乙酮,3.75mM的輔酶NADPH和0.1μg/μl的酶。在上述方法中,作為優(yōu)選的:步驟(2)的反應(yīng)溫度為55℃,合成pH為4.5-5.3,反應(yīng)時(shí)間為100分鐘。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下有益效果:1.1-苯基乙醇合成酶為植物來(lái)源,安全環(huán)保;2.1-苯基乙醇合成酶粗酶的提取方法簡(jiǎn)單;3.本合成方法的轉(zhuǎn)化效率高,綠色無(wú)污染;4.本合成方法實(shí)現(xiàn)了廢棄資源的合理利用,提高了茶樹(shù)花的產(chǎn)業(yè)附加值。具體實(shí)施方式:以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明,而不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1:(1)1-苯基乙醇合成酶粗酶的制備將0.3克聚乙烯吡咯烷酮和20毫克3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽加入1克茶樹(shù)花中。此混合物用10毫升pH值為7的100mM磷酸鉀緩沖液在冰上充分勻漿。緩沖液中同時(shí)含有1%的甘油,1mM乙二胺四乙酸。勻漿產(chǎn)物在4℃,26740離心力的條件下離心15-20分鐘。離心之后的上清液通過(guò)PD-10脫鹽柱將目的蛋白用含有0.1%甘油,0.1mMEDTA的磷酸鉀緩沖液洗脫。緩沖液的濃度為10mM,pH值為7。此方法制備的蛋白為1-苯基乙醇合成酶粗酶。(2)1-苯基乙醇的合成底物苯乙酮在1-苯基乙醇合成酶粗酶的催化下生成1-苯基乙醇。反應(yīng)所使用的緩沖液為100mM磷酸鉀緩沖液。反應(yīng)液中包含1.25mM的苯乙酮,3.75mM的輔酶NADPH和0.1μg/μl的酶。反應(yīng)溫度為55℃,反應(yīng)pH值為4.5,反應(yīng)時(shí)間為100分鐘。實(shí)施例2:(1)1-苯基乙醇合成酶粗酶的制備將3克聚乙烯吡咯烷酮和0.2克3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽加入10克茶樹(shù)花中。此混合物用100毫升pH值為7的100mM磷酸鉀緩沖液在冰上充分勻漿。緩沖液中同時(shí)含有1%的甘油,1mM乙二胺四乙酸EDTA。勻漿產(chǎn)物在4℃,26740離心力的條件下離心15-20分鐘。離心之后的上清液通過(guò)PD-10脫鹽柱將目的蛋白用含有0.1%甘油,0.1mMEDTA的磷酸鉀緩沖液洗脫。緩沖液的濃度為10mM,pH值為7。此方法制備的蛋白為1-苯基乙醇合成酶粗酶。(2)1-苯基乙醇的合成底物苯乙酮在1-苯基乙醇合成酶粗酶的催化下生成1-苯基乙醇。反應(yīng)所使用的緩沖液為100mM磷酸鉀緩沖液。反應(yīng)液中包含1.25mM的苯乙酮,3.75mM的輔酶NADPH和0.1μg/μl的酶。反應(yīng)溫度為55℃,反應(yīng)pH值為5.0,反應(yīng)時(shí)間為100分鐘。實(shí)施例3:(1)1-苯基乙醇合成酶粗酶的制備將1.5克聚乙烯吡咯烷酮PVPP和0.1克3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽加入5克茶樹(shù)花中。此混合物用50毫升pH值為7的100mM磷酸鉀緩沖液在冰上充分勻漿。緩沖液中同時(shí)含有1%的甘油,1mM乙二胺四乙酸EDTA。勻漿產(chǎn)物在4℃,26740離心力的條件下離心15-20分鐘。離心之后的上清液通過(guò)PD-10脫鹽柱將目的蛋白用含有0.1%甘油,0.1mMEDTA的磷酸鉀緩沖液洗脫。緩沖液的濃度為10mM,pH值為7。此方法制備的蛋白為1-苯基乙醇合成酶粗酶。(2)1-苯基乙醇的合成底物苯乙酮在1-苯基乙醇合成酶粗酶的催化下生成1-苯基乙醇。反應(yīng)所使用的緩沖液為100mM磷酸鉀緩沖液。反應(yīng)液中包含1.25mM的苯乙酮,3.75mM的輔酶NADPH和0.1μg/μl的酶。反應(yīng)溫度為55℃,反應(yīng)pH值為5.3,反應(yīng)時(shí)間為100分鐘。以上三個(gè)實(shí)施例條件均能高效催化苯乙酮生成1-苯基乙醇。苯乙酮生成1-苯基乙醇的轉(zhuǎn)化率約為40%。目前1-苯基乙醇的合成多采用化學(xué)合成的方法。化學(xué)合成污染大,且有反應(yīng)副產(chǎn)物產(chǎn)生。通過(guò)酶催化的反應(yīng)能夠穩(wěn)定,單一的形成特定的產(chǎn)物。而植物中含有大量可催化形成香氣物質(zhì)的酶。基于以上理論,我們首次發(fā)明了利用源自茶樹(shù)花的酶高效合成1-苯基乙醇的方法。我們首先通過(guò)響應(yīng)面分析初步確定了茶樹(shù)花酶提取緩沖液的最佳pH值、反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、NADPH濃度、苯乙酮濃度。接下來(lái)通過(guò)對(duì)不同反應(yīng)溫度,不同反應(yīng)pH的篩選,最終確定了最優(yōu)化的利用茶樹(shù)花酶以苯乙酮為底物生成1-苯基乙醇的條件。通過(guò)對(duì)生成的1-苯基乙醇進(jìn)行含量測(cè)定發(fā)現(xiàn),本發(fā)明三個(gè)實(shí)施例催化苯乙酮生成1-苯基乙醇的效率均比較高。說(shuō)明在本發(fā)明中利用茶樹(shù)花酶合成1-苯基乙醇的方法得到了優(yōu)化,合成1-苯基乙醇的反應(yīng)高效穩(wěn)定。此方法對(duì)環(huán)境友好,符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略方針。表1.三個(gè)實(shí)施例的1-苯基乙醇相對(duì)產(chǎn)量比較1-苯基乙醇相對(duì)產(chǎn)量※實(shí)施例16.44實(shí)施例26.08實(shí)施例36.49※1-苯基乙醇的相對(duì)產(chǎn)量通過(guò)GC-MS進(jìn)行測(cè)定,為1-苯基乙醇和內(nèi)標(biāo)葵酸乙酯的峰面積比值。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3