本發(fā)明涉及一種厭氧微生物培養(yǎng)裝置及應(yīng)用該裝置的厭氧微生物培養(yǎng)方法，特別是切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置及利用該裝置的厭氧微生物培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
人類生活的環(huán)境和人體本身就生存有種類眾多的厭氧微生物，它們與人類的關(guān)系密切。然而由于厭氧微生物的分離和純種培養(yǎng)的困難，研究厭氧微生物的技術(shù)和方法進(jìn)展又相當(dāng)緩慢，致使人類對厭氧微生物的認(rèn)識和利用遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于對好氧和兼性厭氧微生物的研究工作。直到近二十多年隨著厭氧操作技術(shù)的不斷完善，厭氧微生物研究方法的不斷改進(jìn)，尤其近十多年來許多新技術(shù)和方法的應(yīng)用，致使厭氧微生物學(xué)取得很大的進(jìn)展，獲得了豐碩的成果。發(fā)現(xiàn)了眾多種類的厭氧微生物，它們在自然界不僅生存于一般的常溫的無氧和少氧環(huán)境中，最近尚發(fā)現(xiàn)有生存于高溫環(huán)境最適生長溫度為100-103℃甚至有高達(dá)105℃的超嗜熱專性厭氧細(xì)菌，亦發(fā)現(xiàn)有能生長在南極的嗜冷厭氧菌，尚發(fā)現(xiàn)有能在22-25％鹽濃度中生長的專性厭氧發(fā)酵的嗜鹽菌。
在現(xiàn)有技術(shù)中，厭氧微生物的培養(yǎng)通常是采用厭氧袋、厭氧罐、厭氧箱等，均是通過物理的或者化學(xué)的方法形成培養(yǎng)需要的厭氧環(huán)境。采用厭氧袋、厭氧罐培養(yǎng)厭氧菌，其工作繁瑣復(fù)雜、條件苛刻，培養(yǎng)成功率低，很難達(dá)到需要的標(biāo)準(zhǔn)。而采用培養(yǎng)箱，雖然在一定程度上提高了培養(yǎng)的成功率，降低了操作復(fù)雜性，但是其本身造價(jià)高、費(fèi)用昂貴，限制了在厭氧微生物培育活動中的應(yīng)用。
另外，上述現(xiàn)有技術(shù)，在某些特殊菌種，如甲烷菌的培養(yǎng)時(shí)，因其苛刻的生長成活條件：甲烷細(xì)菌都是專性嚴(yán)格厭氧菌，對氧非常敏感，遇氧后會立即受到抑制，不能生長、繁殖，甚至死亡；甲烷細(xì)菌生長很緩慢，在人工培養(yǎng)條件下需經(jīng)過十幾天甚至幾十天才能長出菌落，據(jù)麥卡蒂(McCarty)介紹，有的甲烷細(xì)菌需要培養(yǎng)七八十天才能長出菌落，在自然條件下甚至更長。從而在該該類菌體培養(yǎng)的時(shí)候，需要保持嚴(yán)格的無氧環(huán)境并且需要具有良好的環(huán)境穩(wěn)定性，這又無形中增加了利用厭氧袋、厭氧罐、厭氧箱等設(shè)備培養(yǎng)的難度。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上述問題，本發(fā)明公開了切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置及利用該裝置的培養(yǎng)方法，其技術(shù)方案針對厭氧培養(yǎng)袋和血清瓶等常規(guī)厭氧培養(yǎng)器具在操作、環(huán)境控制精度、可觀察性等方面的不足，從而使得厭氧微生物在菌種培養(yǎng)、分離、培養(yǎng)環(huán)境控制等方面的可控性更為優(yōu)秀，使得厭氧微生物的培養(yǎng)更為高效便利，同時(shí)具有更好的成功率和成本控制性。
本發(fā)明方案中未限定的技術(shù)方案可以采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，而不影響本發(fā)明方案的實(shí)施。
本發(fā)明公開的切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置，包括，內(nèi)部形成有管狀的培養(yǎng)腔的主體：對厭氧微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基被封閉在培養(yǎng)腔內(nèi)；培養(yǎng)完成后，培養(yǎng)基從培養(yǎng)腔一端被全部地或者部分地?cái)D出。本方案設(shè)置的管式培養(yǎng)腔，在培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)，在培養(yǎng)腔內(nèi)以培養(yǎng)基(如瓊脂培養(yǎng)基)填充(填充時(shí)可以略微地滿溢，從而充分排出腔體內(nèi)的氧氣)，從而在培養(yǎng)時(shí)形成嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，從而低成本且簡單高效地即可實(shí)現(xiàn)符合要求的無氧環(huán)境。同時(shí)，通過采用將培養(yǎng)后的培養(yǎng)基以逐漸擠出切片的方式，從而可以在需要時(shí)進(jìn)行適當(dāng)大小尺寸的切割，而不影響其余培養(yǎng)基中無氧環(huán)境的保持，而提高了培養(yǎng)分離的效率以及使用的便利性。
本發(fā)明公開的切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置的一種改進(jìn)，主體上管狀的培養(yǎng)腔的內(nèi)徑相同或者培養(yǎng)腔的距離出口端近處的內(nèi)徑大于距離出口端遠(yuǎn)的內(nèi)徑。本方案便于在使用過程中，將凝固的培養(yǎng)基推出，而便于進(jìn)行切割切片操作，特別是等內(nèi)徑的情況下還利于無氧環(huán)境的維持；變徑的情況下則利于微生物的大量培養(yǎng)和分離，從而提高分離培養(yǎng)的效率。
本發(fā)明公開的切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置的一種改進(jìn)，主體上一端或者兩端具有開口以及用于密閉培養(yǎng)腔的封閉結(jié)構(gòu)(開口與封閉結(jié)構(gòu)匹配設(shè)置，以保持氣密性)。這里的封閉結(jié)構(gòu)可以為與開口相配合的蓋或者塞；該蓋或者塞可以具有螺紋。
本發(fā)明公開的切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置的一種改進(jìn)，主體上對應(yīng)于封閉結(jié)構(gòu)還設(shè)置有與封閉結(jié)構(gòu)相配合的螺紋結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明公開的切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置的一種改進(jìn)，切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置還包括與對應(yīng)培養(yǎng)腔區(qū)段相配合的活塞：培養(yǎng)完成后，推動活塞，培養(yǎng)基從培養(yǎng)腔一端被全部地或者部分地?cái)D出。本方案設(shè)置的活塞結(jié)構(gòu)，從而在培養(yǎng)腔的部分區(qū)段形成了類似于注射器的活塞式推擠結(jié)構(gòu)，從而便于在使用操作中將固化膠凝形態(tài)的培養(yǎng)基從而出口基礎(chǔ)，并且可以控制擠出量，有利于降低損耗和浪費(fèi)，同時(shí)，該活塞結(jié)構(gòu)還有利于形成封閉結(jié)構(gòu)，而避免使用過程中氧的滲入，有利于無氧環(huán)境的維持。進(jìn)一步優(yōu)選的，活塞上還具有可拆卸的推桿，從而在擠出時(shí)以推桿推動活塞，使用完畢則移除推桿再行封閉，不僅利于無氧環(huán)境的再建，還利于存儲。
本發(fā)明公開的厭氧微生物培養(yǎng)方法，至少包括如下步驟(本方案中未公開的步驟可以采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，而不影響本技術(shù)方案的實(shí)施)：將含有菌液的培養(yǎng)基在恒溫狀態(tài)下注入切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置的主體的管狀的培養(yǎng)腔，封閉培養(yǎng)腔；
在合適培養(yǎng)條件下，進(jìn)行菌種培養(yǎng)；
培養(yǎng)完成后，將培養(yǎng)基全部地或者部分?jǐn)D出，對獲得的凝固態(tài)的含菌培養(yǎng)基全部地或者部分地切割分離，即獲得培養(yǎng)完成的菌株。
本發(fā)明公開的厭氧微生物培養(yǎng)方法的一種改進(jìn)，主體上管狀的培養(yǎng)腔的內(nèi)徑相同或者培養(yǎng)腔的距離出口端近處的內(nèi)徑大于距離出口端遠(yuǎn)的內(nèi)徑。
本發(fā)明公開的厭氧微生物培養(yǎng)方法的一種改進(jìn)，培養(yǎng)完成后，培養(yǎng)基的擠出通過培養(yǎng)腔內(nèi)的活塞移動實(shí)現(xiàn)，活塞與其所處的培養(yǎng)腔區(qū)段相配合。
本發(fā)明公開的切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置及利用該裝置的培養(yǎng)方法，在操作、環(huán)境控制精度、可觀察性、成本等方面獲得良好的改善，利用本發(fā)明技術(shù)厭氧微生物的培養(yǎng)(并且滿足不同規(guī)格的培養(yǎng)，適合實(shí)驗(yàn)室的小量培養(yǎng)，也滿足大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的培養(yǎng))更為高效便利，同時(shí)具有更好的成功率和成本控制性，并且具有良好的操作的便利性，并且在分離、取樣操作時(shí)，可以隨用隨取，分割靈活性高，并且在分割后同樣能夠通過簡易操作實(shí)現(xiàn)保持良好的無氧環(huán)境。
附圖說明
圖1、本發(fā)明公開的切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置的一種實(shí)施方案的結(jié)構(gòu)示意圖。
附圖標(biāo)記列表：
1、主體； 2、培養(yǎng)腔； 3、螺紋結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解下述具體實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。需要說明的是，下面描述中使用的詞語“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附圖中的方向，詞語“內(nèi)”和“外”分別指的是朝向或遠(yuǎn)離特定部件幾何中心的方向。
實(shí)施例1
本實(shí)施例中，切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置，包括內(nèi)部形成有管狀的培養(yǎng)腔的主體：對厭氧微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基被封閉在培養(yǎng)腔內(nèi)；培養(yǎng)完成后，培養(yǎng)基從培養(yǎng)腔一端擠出，擠出時(shí)，可以視需要全部擠出或者部分?jǐn)D出，如部分?jǐn)D出時(shí)，在繼續(xù)封閉后即可保持無氧的培養(yǎng)環(huán)境；而在對空缺部分進(jìn)行惰性氣體填充除氧后，更可以實(shí)現(xiàn)較為長期的無氧保存。
實(shí)施例2
本實(shí)施例中，與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于，主體上管狀的培養(yǎng)腔的內(nèi)徑相同，即培養(yǎng)腔整體即為一個內(nèi)徑相同的管狀結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)基在該類型的培養(yǎng)腔中同樣可以較為均勻地分布，本方案所形成的培養(yǎng)基凝膠結(jié)構(gòu)可控性好，菌落分布性好，易于填充并且具有良好的培養(yǎng)穩(wěn)定性和可觀測性，同時(shí)還便于篩選截取。
實(shí)施例3
本實(shí)施例中，與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于，主體上管狀的培養(yǎng)腔的距離出口端(指在使用時(shí)，培養(yǎng)基被擠出段)近處的內(nèi)徑大于距離出口端遠(yuǎn)的內(nèi)徑，即可以為由距離出口端遠(yuǎn)處向距離出口端近處逐漸變大(如成錐形或者喇叭形或者階梯型等)，本方案利于大量培養(yǎng)，有利于提高產(chǎn)出效率。
與上述實(shí)施例相區(qū)別的，主體上一端具有開口以及用于密閉培養(yǎng)腔的封閉結(jié)構(gòu)，本方案進(jìn)一步限定為主體一端開口時(shí)，具有利于保持氣密性，從而利于維持無氧環(huán)境。
與上述實(shí)施例相區(qū)別的，主體上兩端均具有開口以及用于密閉培養(yǎng)腔的封閉結(jié)構(gòu)，本方案進(jìn)一步限定為主體兩端開口以及封閉結(jié)構(gòu)時(shí)，便于擠出培養(yǎng)基和清洗再利用。
與上述實(shí)施例相區(qū)別的，主體上對應(yīng)于封閉結(jié)構(gòu)還設(shè)置有與封閉結(jié)構(gòu)相配合的螺紋結(jié)構(gòu)。該螺紋結(jié)構(gòu)以增強(qiáng)主體的開口于封閉結(jié)構(gòu)(如蓋(主體開口處的外螺紋)或者塞(主體開口處的內(nèi)螺紋))的配合緊密性，從而增強(qiáng)密閉效果。
與上述實(shí)施例相區(qū)別的，切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置還包括與對應(yīng)培養(yǎng)腔區(qū)段相配合的活塞：培養(yǎng)完成后，推動活塞，培養(yǎng)基從培養(yǎng)腔一端被全部地或者部分地?cái)D出：
本實(shí)施例中，當(dāng)培養(yǎng)腔整體為一個內(nèi)徑相同的管狀結(jié)構(gòu)時(shí)，該活塞可以在整個培養(yǎng)腔內(nèi)移動，從而實(shí)現(xiàn)了在需要時(shí)將所有的培養(yǎng)基全部擠出，而在部分?jǐn)D出時(shí)也不會影響到整體的氣密性，此時(shí)活塞或者塞或者蓋都可以起到良好的密閉性；
本實(shí)施例中，當(dāng)培養(yǎng)腔整體為一個內(nèi)徑由距離出口端遠(yuǎn)處向距離出口端近處逐漸變大(如成錐形或者喇叭形或者階梯型等)時(shí)，該活塞可以處于該培養(yǎng)腔的某一段，同樣可以實(shí)現(xiàn)對培養(yǎng)基的擠出，此時(shí)活塞或者塞或者蓋都可以起到良好的密閉性。
制備實(shí)施例1
本實(shí)施例中，至少包括如下步驟：將含有菌液的培養(yǎng)基在恒溫狀態(tài)下注入切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置的主體的管狀的培養(yǎng)腔，封閉培養(yǎng)腔；
在合適培養(yǎng)條件下，進(jìn)行菌種培養(yǎng)；
培養(yǎng)完成后，將培養(yǎng)基全部地或者部分?jǐn)D出，對獲得的凝固態(tài)的含菌培養(yǎng)基全部地或者部分地切割分離，即獲得培養(yǎng)完成的菌株。
制備實(shí)施例2
本實(shí)施例中，與制備實(shí)施例1的區(qū)別僅在于，主體上管狀的培養(yǎng)腔的內(nèi)徑相同，即培養(yǎng)腔整體即為一個內(nèi)徑相同的管狀結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)基在該類型的培養(yǎng)腔中同樣可以較為均勻地分布，本方案所形成的培養(yǎng)基凝膠結(jié)構(gòu)可控性好，菌落分布性好，易于填充并且具有良好的培養(yǎng)穩(wěn)定性和可觀測性，同時(shí)還便于篩選截取。
制備實(shí)施例3
本實(shí)施例中，與制備實(shí)施例1的區(qū)別僅在于，主體上管狀的培養(yǎng)腔的距離出口端(指在使用時(shí)，培養(yǎng)基被擠出段)近處的內(nèi)徑大于距離出口端遠(yuǎn)的內(nèi)徑，即可以為由距離出口端遠(yuǎn)處向距離出口端近處逐漸變大(如成錐形或者喇叭形或者階梯型等)，本方案利于大量培養(yǎng)，有利于提高產(chǎn)出效率。
與上述實(shí)施例相區(qū)別的，培養(yǎng)完成后，培養(yǎng)基的擠出通過培養(yǎng)腔內(nèi)的活塞移動實(shí)現(xiàn)，活塞與其所處的培養(yǎng)腔區(qū)段相配合。
以下為利用本發(fā)明方案的一種實(shí)施方案的具體操作，僅作為對本發(fā)明方案可行性的解釋說明，而非對要求范圍的限定：
需要的設(shè)備：恒溫水浴鍋，高純氮?dú)?氦氣，100ml血清瓶，液體培養(yǎng)基所需各種生物化學(xué)試劑，培養(yǎng)基用低熔點(diǎn)瓊脂糖，無菌刀片，超凈工作臺，切膠式管裝分離器(50ml)，5ml,50ml注射器。
分離流程：第一步，在密閉的已除氧的液體培養(yǎng)基中對目標(biāo)微生物(產(chǎn)氣微生物，如產(chǎn)甲烷菌或產(chǎn)氫菌)進(jìn)行預(yù)富集培養(yǎng)(可以在100ml血清瓶中密閉，在恒溫培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng))；可以通過定期測定目標(biāo)產(chǎn)物濃度觀測微生物的生長狀況，如果是消耗氣體的產(chǎn)物，如甲烷厭氧菌產(chǎn)生的甲烷，也可以通過測定添加的氣體濃度變化觀測微生物的生長狀況；第二步，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?dāng)目標(biāo)微生物生長達(dá)到快速生長期時(shí)，將預(yù)富集的菌體依次梯度稀釋并轉(zhuǎn)移到預(yù)先準(zhǔn)備好的厭氧液體培養(yǎng)基中；第三步，將濃度稀釋梯度為10-1～10-3的菌液，用5ml注射器吸2ml菌液注入在恒溫水浴鍋(50℃)中保溫的血清瓶(內(nèi)有50～60ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)基包括1.5％瓊脂、添加有0.1％刃天青，同時(shí)有持續(xù)的高純氮?dú)?氦氣注入保持厭氧環(huán)境)，再視培養(yǎng)需要可以加入100～200微升1％Na2S(視分離的微生物決定是否添加該物質(zhì))和100微升0.2mol/L半胱氨酸；第四步，蓋好蓋子的同時(shí)迅速將充氣針頭取出，搖晃均勻之后，迅速倒入仍在高純氮?dú)?氦氣環(huán)境下的切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置的培養(yǎng)腔內(nèi)，以少許溢出為好，然后迅速把蓋子蓋好，即形成封閉無氧環(huán)境；第五步，根據(jù)培養(yǎng)目標(biāo)微生物的需要放入恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)；第六步，每隔一定時(shí)間對培養(yǎng)基進(jìn)行觀察，如果出現(xiàn)培養(yǎng)基有膨脹就說明有微生物生長，而后，培養(yǎng)至合適的階段(滿足培養(yǎng)目的時(shí))可以將固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到超凈工作臺，將切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置打開(可以兩端同時(shí)打開，用推動器(活塞)從一端向另一端慢慢推出)，可以根據(jù)膨脹點(diǎn)(菌落生長點(diǎn))所出現(xiàn)的位置對膠進(jìn)行切割；第七步，將切割下的含有目標(biāo)菌株的微生物群落的培養(yǎng)基再轉(zhuǎn)移到厭氧的液體培養(yǎng)基中，通過50℃的水浴即可將膠中包含的微生物菌體釋放到液體培養(yǎng)基中(由于所含瓊脂很低，將液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到恒溫培養(yǎng)箱中也不會發(fā)生凝固現(xiàn)象)。第八步，利用分子生物學(xué)或者掃描電鏡可以對分離的微生物進(jìn)行純菌鑒定、分析。第九步，如果尚未獲得純菌株可以重復(fù)以上步驟直到獲得純菌株為止。
如圖1所示，切膠式管狀厭氧微生物分離培養(yǎng)裝置，包括內(nèi)部形成有等內(nèi)徑的直管的管狀的培養(yǎng)腔2的主體1，主體1兩端開口(根據(jù)需要還可以設(shè)置匹配的塞子或者蓋子，從而便于保持氣密性而使整個培養(yǎng)基長期處于無氧環(huán)境)，其中一個開口處具有外螺紋3，接種菌種后的培養(yǎng)基存在于培養(yǎng)腔2內(nèi)：對厭氧微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基被封閉在培養(yǎng)腔內(nèi)；培養(yǎng)完成后，培養(yǎng)基從培養(yǎng)腔一端擠出(可以有推擠結(jié)構(gòu)如(活塞等)從一端向另一端擠出)，擠出時(shí)，可以視需要全部擠出或者部分?jǐn)D出，如部分?jǐn)D出時(shí)，在繼續(xù)封閉后即可保持無氧的培養(yǎng)環(huán)境；而在對空缺部分進(jìn)行惰性氣體填充除氧后，更可以實(shí)現(xiàn)較為長期的無氧保存。
本處實(shí)施例對本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)范圍中點(diǎn)值未窮盡之處以及在實(shí)施例技術(shù)方案中對單個或者多個技術(shù)特征的同等替換所形成的新的技術(shù)方案，同樣都在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi)；同時(shí)本發(fā)明方案所有列舉或者未列舉的實(shí)施例中，在同一實(shí)施例中的各個參數(shù)僅僅表示其技術(shù)方案的一個實(shí)例(即一種可行性方案)，而各個參數(shù)之間并不存在嚴(yán)格的配合與限定關(guān)系，其中各參數(shù)在不違背公理以及本發(fā)明述求時(shí)可以相互替換，特別聲明的除外。
本發(fā)明方案所公開的技術(shù)手段不僅限于上述技術(shù)手段所公開的技術(shù)手段，還包括由以上技術(shù)特征任意組合所組成的技術(shù)方案。以上所述是本發(fā)明的具體實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。